Yöntem makalesi

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması Epitelyal Gut Hücreleri

DOI:

10.3791/55747

⸱

23 Temmuz 2017

 ,  , 
1Queensland Alliance for Agriculture & Food Innovation, The University of Queensland, 2Centre for Comparative Genomics, Murdoch University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rhipicephalus microplus bağırsak dokusundan epitel hücrelerini izole etmek için modifiye bir yoğunluk santrifüj gradyan tabanlı metodoloji kullanıldı. Yüzeye bağlı proteinler, biyotinlenmiş ve streptavidin manyetik boncuklarla arıtılmış uygulamalarda kullanılmak üzere saflaştırılmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rhipicephalus microplus - sığır kene - birçok patojen vektörü olarak hayvancılık üzerindeki ekonomik etki açısından en önemli ektoparazitedir. Damla bağırsak epitel hücrelerinin yüzeyinde bulunan BM86 gibi aşı adaylarının bulunmasına odaklanarak, zararlı etkilerini azaltmak için sığır kene kontrolüne yönelik çalışmalar yapılmıştır. Mevcut araştırmalar, diğer aşı adaylarını taramak için cDNA ve genomik kütüphanelerin kullanımına odaklanmaktadır. Dişi bağırsak hücrelerinin izolasyonu, kenet hücresi zarı üzerine yüzey proteinlerinin kompozisyonunun araştırılmasında önemli bir avantaj teşkil eder. Bu yazı, yarı-sıkışmış R. microplus'un bağırsak içeriğinden epitel hücrelerinin izolasyonu için yeni ve uygulanabilir bir yöntem teşkil etmektedir . Bu protokol, subepitelyal destek dokularından epitel hücrelerini serbest bırakmak için TCEP ve EDTA'yı ve süreksiz yoğunluk santrifüj gradyanını kullanmaktadırNt, epitel hücrelerini diğer hücre türlerinden ayırır. Hücre yüzey proteinleri biyotinile edildi ve FACS veya LC-MS / MS analizinde aşağı akış uygulamaları için streptavidin bağlantılı manyetik boncuklar kullanarak kene bağırsak epitel hücrelerinden izole edildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sığır kenesi Rhipicephalus microplus , sığır kene humması (babesiosis), anaplasmosis ve equine piroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4'ü vektörelleştirdiği için tropik ve subtropikal bölgelerdeki sığır endüstrisi üzerindeki ekonomik etki açısından en önemli ektoparazitedir. Zararlı etkiyi azaltmak için sığır kene kontrolüne yönelik çalışmalar yapılmıştır ancak kimyasal akarisitlerin kullanımı gibi geleneksel yöntemlerin süt ve ette kimyasal kalıntıların varlığı ve kimyasal olarak dirençli kenelerin yaygınlığı gibi örtük dezavantajları vardır 5 , 6 , 7 . Sonuç olarak, doğal dirençli sığırların kullanımı, biyolojik mücadele (biyoparestisitler) ve aşı gibi alternatif kene kontrol yöntemlerinin geliştirilmesi incelenmiştirInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

Aşı adayları olarak kullanılabilecek proteinlerin peşinde, mevcut araştırma kene bağırsağına odaklanmaktadır. Orta bacak duvarları, ince bir bazal tabakaya dayanan, tek katlı epitelyal hücrelerden oluşur; bazal laminanın dış kısmı kas ağını oluşturur. Işık ve elektron mikroskopu gözlemleri, orta bağırsağın üç tip hücreden oluştuğunu göstermektedir: rezerv (ayırt edilmemiş), sekresyon ve sindirim. Hücre tiplerinin sayısı, fizyolojik faza bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Sekretuar ve sindirim hücreleri, hem rezerv hücreler 18 , 19 , 20'den kaynaklanır .

CDNA kütüphanelerinin inşasıKene bağırsağının bileşimini incelemek potansiyel aşı adayları olan Bm86 gibi antijenik proteinlerin tanımlanmasına yol açtı 2 , 3 , 4 . Glikoprotein Bm86, kenarı bağırsak hücrelerinin yüzeyinde lokalizedir ve aşılanmış sığırlarda sığır kenesine ( R. microplus ) karşı koruyucu bir bağışıklık tepkisi oluşturmaktadır. Bağışıklık kazandırılmış konak tarafından üretilen anti-Bm86 IgG'leri kene tarafından alınır, bu antijeni tene bağırsak hücrelerinin yüzeyinde tanır ve sonra da bağırsak dokusunun işlevi ve bütünlüğünü bozmaktadır. Bm86 antijenlere dayanan aşılar sayısı, ağırlık ve daha sonra kene kuşak 4 düşük bir larva istila sonuçlanan kadın engorging üreme kapasitesini azaltarak, R. microplus ve Rhipicephalus annulatus etkin biçimde kontrol göstermiştir. Bununla birlikte, Bm86 esaslı aşılar tüm kene aşamalarına karşı etkili değildir veBazı coğrafi R. microplus suşlarına karşı yetersiz etkinlik gösterdiğinden, sığır ve süt endüstrileri bu aşıları 2 , 4'ü kötü şekilde benimsemişlerdir.

Epitel hücrelerini kan bağı bağından ayırma yeteneği, farklı çevre koşullarında morfoloji ve fizyoloji de dahil olmak üzere protein membran kompozisyonunu belirlemek için araştırmanın ilerlemesini sağlayacak önemli bir yeniliktir. Burada tarif edilen metot, alt epitel destek dokularından epitelyumu 10 serbest bırakmak için kenetleme maddesi etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve indirgeyici ajan tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) kullanmaktadır. Epitel, dokuların mekanik olarak parçalanması sonrasında sallayarak, ardından Percoll'da süreksiz gradyent santrifüjlemeyle toparlanır. Bu makale, kene gut epi'sinin izolasyonu için uygulanabilir ve yeni bir teknik tanımlamaktadırHücre hücreleri. Bu epitelyal hücrelerin yüzeyinden izole edilen biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinleri, daha sonra FACS ve / veya LC-MS / MS analizi gibi aşağı akım uygulamaları ile analiz edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bağırsak epitelinin R. microplus'tan diseksiyonu

  1. Deney günü sığırlardan yarı-sıkıştırılmış kene toplayın. Kene ortasından kaldırıldıktan 24 saat sonra parçalara ayırın.
  2. 92 mm x 16 mm Petri kabının tabanına bir şerit bandı yapıştırın. Kasete süper yapışkan bir damla ekleyin. Kene, ventral tarafı süper tutkal üzerine indirin, 2 dakika kurumaya bırakın.
  3. Petri kabı içine 100 mL fosfat tamponlu salin (PBS) dökün veya kene tamamen su altına alıncaya kadar.
  4. 11 numaralı bir neşter kullanarak, kene her iki yanında da gözlerin üstünden alttaki festo parçalarına kadar kesilir.
  5. Steril forseps kullanarak, tamamen iç organları açığa, Kalkan ve alloscutum çıkarın.
  6. Kirlenmeyi önlemek için ince beyaz iplik benzeri organları (trakea) ve diğer membranları çıkarın.
  7. Bağırsağı, forseps kullanarak, üst bölgeyi sıkarak vekarkas. Kalan tüm bağırsak dokularını çıkarın, böylece başka dokuların parçalanmadığından emin olun.
  8. Bağırsak proteinaz inhibitörü kokteyli (PIC) ile kalsiyum klorür ve magnezyum sülfat içermeyen buz soğukluğundaki Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde saklayın. Bağırsakları kuru buzda dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
    Not: Bağırsak diseksiyonu ve iç organların kene detaylarına yardımcı olmak için, D. Sonenshine'in Bölüm 3.1'ine, "Kenların Biyolojisi" na bakın. 19 .

2. Epitelyal Hücre Ayrışımı

  1. 50 ml tüp içinde 70 mikron hücre süzgeçine disseke bağırsak dökün.
  2. Çözelti berraklaşıncaya ve bağırsaklar beyaz / berrak bir görünüm alıncaya kadar bağırsak dokusunu PIC ile 50 mL buz soğukluğundaki HBSS ile yıkayın.
  3. PIC ile 30 mL buz soğukluğunda HBSS bağırsaklarını yeniden süspanse edin, hafifçe karıştırın ve bağırsaklarını pelet haline getirmek için 10 dakika boyunca 4 ° C'de 500 xg'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.
  5. Süspansiyonu 250 um'lik bir hücre süzgeci ile filtre edin, akış yolu ile girdaplayın ve kalan akış akışını toplayan 70 μm'lik hücre süzgeci ile filtreleyin.
  6. Süspansiyonu 500 xg'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyerek tek hücrelerin pelet haline getirin.

3. Bir yoğunluk santrifüj gradyanı kullanarak Tek Epitelyal Hücrelerin İzolasyonu

  1. Bir AP15 ön filtre kağıdından süzerek yoğunluk santrifüj gradyanını ( örn . Percoll) hazırlayın. Degrade katmanlamadan önce 1 saat süreyle% 40 ve% 20 Percoll'u mqH 2 0 (v / v) içinde hazırlayın ve 4 ° C'de soğutun.
  2. Bir peristaltik kullanmaEn düşük hızda ayarlanan pompa, 3 mL'lik% 40 yoğunluklu santrifüj gradyanı, 16 mL'lik ultra santrifüj tüpüne yerleştirilerek 15 dakika boyunca buzda kalmasına izin verilir. Pompanın hızı dakikada bir <1 mL'ye ulaşmalıdır.
  3. Tüpü 45 ° 'lik bir açıyla eğinmek için% 40 tabakanın üzerine% 20 yoğunlukta santrifüj gradyanını katmak için peristaltik pompayı kullanın. Pompanın hızı, dakikada 1 mL'den az akış hızına ulaşmalıdır. Katmanların 15 dakika boyunca buzda kalmasına izin verin.
  4. % 20-40 yoğunluklu santrifüj gradyanı üzerinde kan bağı hücreleri içeren 3 mL DMEM ortamı katmak için dakikada 1 mL'den daha düşük peristaltik pompa kullanın.
  5. Azami hızlanma ve minimum hızlanma için santrifüj programlayın. 10 dakika 600 x g'de santrifüjleyin. Epitel tek hücrelerini izole etmek için DMEM ile interfazları toplayın:% 20 yoğunlukta santrifüj gradyanı ve% 20:% 40 yoğunlukta santrifüj gradyanları. Sonraki analizler için toplanan ara fazları 4 ° C'de saklayın.

4. Hücre İzolasyonunun Değerlendirilmesi

  1. hemasitometre
    1. Hematitometre slaydını alkolle temizleyin.
    2. Yavaşça hücreleri yukarıya ve aşağıya pipetleyerek hücreleri erteleyin. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde hücre süspansiyonundan 100 μL pipetleyin.
    3. 0.4% Trypan Blue 400 μL ekleyin. Tüpü hafifçe oynatarak hafifçe karıştırın.
    4. Hemocytometer'in her iki haznesini yavaşça doldurmak için Trypan Blue ile işlenmiş hücre süspansiyonundan 100 μL pipetleyin.
    5. Hemositometreyi, 10X'lik bir hedefle hemositometrenin ızgara çizgilerine odaklanarak, hafif bir mikroskop altında yerleştirin.
    6. Elde taşınan bir çarpıcı sayaç kullanarak, canlı olmayan lekelenmemiş hücreleri 16 kareden oluşan bir kümede sayın. Aynı meydanın içinde mavi ölü hücreleri sayın. 16 kareden oluşan dört set sayılana kadar saymaya devam edin.
    7. Formül kullanarak mL başına toplam hücre sayısını hesaplayın:
      47eq1.jpg "/>
    8. Aşağıdaki formülle hücre yaşayabilirliğini hesaplayın:
      figure-protocol-1
  2. Hücre İzolat Görselleştirme
    1. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 9 μL HBSS'de izole hücrelerin 1 μL'sini seyreltin. Mikro santrifüj tüpünü nazikçe karıştırmak için kullanın.
    2. Bir cam slayt ortasına HBSS izole hücrelerin 5 mcL Pipet. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile üç damla montaj aracı uygulayın.
    3. Slayt 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Hava kabarcıkları önleyerek preparatın üzerine bir kapak kayışı yerleştirin.
    4. Floresan mikroskop altında 360 nm uyarımda DAPI ile lekelenmiş hücreleri ve 460 nm'de emisyonu görselleştir.

5. Hücre Yüzey Proteini Biyotinilasyonu

  1. Biotinat 100 uL tek hücreli epitel hücrelerinin Biotin (Tip A) KonjugasyonuKiti, üreticinin talimatlarına göre 1: 1 yüzey proteininin konjuge edilecek molar bir oranda
  2. Hücre lizisi için, biyotinlenmiş hücrelere 100 μL PBS,% 1 Triton X-100,% 10 gliserol, 100 uM oksitlenmiş glutatyon ve PIC ekleyin. 10 dakikada bir hafifçe karıştırarak buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
  3. Çözünmeyen maddeyi pelet haline getirmek için 20 dakika boyunca 4 ° C'de 20,000 xg'de biyotinlenmiş hücreleri santrifüjleyin. Sitoplazmik ve biyotinlenmiş zar proteinleri içeren süpernatantı toplayın.
  4. Bradford tahlili ile protein konsantrasyonunu belirleyin.

6. Biyotinlenmiş Yüzey Proteinlerin İzolasyonu

  1. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne 50 μL Streptavidin Manyetik Boncuk ekleyin.
  2. Boruyu manyetik bir standa yerleştirin, boncukları tüpün yanına toplayın. Süpernatanı çıkarın ve atın.
  3. Tüpe 1000 μL TBS,% 0.1 Tween-20 ekleyin. Nazikçe karıştırın ve manyetik kütlesi ile boncukları toplayınd. Süpernatanı çıkarın ve atın.
  4. Yıkanmış manyetik boncuklar ile 1x PBS'de 300 μL'ye seyreltilmiş 40 μg biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinlerini birleştirin. Çalkalayarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  5. Boncukları manyetik bir ayakla toplayın, yüzen maddeyi çıkarın ve atın.
  6. Boncukları tekrar askıya almak için hafifçe karıştırarak 300 μL TBS,% 0.1 Tween-20 tüp ekleyin. Boncuk toplayın, süpernatanı çıkarın ve atın. Bu yıkama adımı iki kez tekrarlayın.
  7. Manyetik boncuklara 0.1 M glisin pH 2.0'dan 100 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Boncuk toplayın ve elüt edilen biyotinlenmiş yüzey proteinleri içeren süpernatantı çıkarın.
  8. İzole edilmiş yüzey proteinlerini% 4-20 Tris-MOPS SDS-PAGE jelinde canlandırabilirsiniz.

7. Biyotinlenmiş Yüzey Proteininin Değerlendirilmesi

  1. Nokta leke
    1. Nitroselüloz zarın 7 cm x 3 cm şeridini kesin.
    2. 10 μg total tick gu uygulayınT içerikleri (yukarıdaki 1.8'den) ve membrana 10 ug biyotinlenmiş yüzey proteini. Oda sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın.
    3. Bir kutuya aktarın ve 100 mL bloke edici tampon içine batırın. Bir saat çalkalanarak oda sıcaklığında inkübe edin. Engelleme tamponunu atın.
    4. Çalkalamayla 5 dakika boyunca 100 μL PBS,% 0.05 Tween-20 içinde nitroselüloz zar yıkayın. Yıkama tamponunu atın ve yıkamaları ç kez tekrarlayın.
    5. Oda sıcaklığında ajitasyon ile 2 saat süreyle 100 uL PBS,% 0.05 Tween-20'de 1/5000 Streptavidin-yaban turbu peroksidazı (HRP) içinde inkübe edin ve kalan solüsyonu atın.
    6. Nitroselüloz membranı 100 μL PBS,% 0.05 Tween-20 ile çalkalamayla 5 dakika yıkayın. Yıkama tamponunu atın ve yıkamayı üç kez tekrarlayın.
    7. Tespit için 1 tablet 4-kloro-1-napthol 10 mL buz soğukluğunda metanol içinde çözülür. 20 mL TBS'e 4 mL metanol stok ekleyin. 10 μL taze% 30 hidrojen peroksit ve immedi ekleyinNitroselüloz membrana uygulayınız.
    8. Oda sıcaklığında ajite çözünmeyen bir mavi son ürün üretene kadar çalkalayarak inkübe edin. Bu işlem 2-15 dakika sürebilir.
    9. Tespit solüsyonu atın ve 100 uL MQH 2 O., membran üç defa yıkamak
  2. ELISA Testi
    1. Her bir numunenin 200 ng'si 400 mcL 100 mM Karbonat kaplama tamponu ile inceltin ve ELISA plakasının (düz alt kuyular) birinci sıranın (A #) 2 katını kaplayın.
    2. Sıradaki diğer karşılık gelen oyuklara (BH) 100 mM'lik karbonat kaplama tamponu 100 uL ekleyin.
    3. Her bir numunenin seri seyreltmelerini, A sırasındaki her kuyudan 100 mcL pipetle alınarak ve B sırasına aktararak hazırlayın. Pipetleme ile hafifçe karıştırın ve kabarcıklar üretmekten kaçının. Satır H'deki her bir kuyudaki son 100 mcL'yi atarak, her satıra kadar seyreltmeleri tekrarlayın.
    4. Plakayı parafilm ile örtün ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    5. Tablayı yıkaE başına 200 μL PBS,% 0.05 Tween-20 ile üç kez.
    6. Kaplanmış oyuklara 200 uL engelleyici tampon ekleyin, Parafilm ile kaplayın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    7. 1 / 15,000 Streptavidin-HRP'yi blokaj tamponunda seyreltin ve plakanın her oyuğuna 100 uL ekleyin. Parafilm ile kaplayın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    8. Plakayı, beş kez 200 uL PBS,% 0.05 Tween-20 oranında yıkayın.
    9. Tespit etmek için, göz başına 100 μL TMB reaktif ekleyin. Yeterli renk gelişiminden sonra, genellikle 10-15 dakika arasında, reaksiyonu durdurmak için 100 uL 1 M fosforik asit ekleyin.
    10. Λ = 450 nm'de her kuyunun absorbansını okuyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitelyal hücreler, Şekil 1'de sunulan şematik gibi R. microplus'un bağırsak dokularından izole edildi. Bu protokolü kullanarak hazırlanan kene bağırsak epitel hücrelerinin temsili floresan mikroskopi görüntüleri Şekil 2A'da gösterilmektedir Ve 2B. Hücre izolasyonu, yarı-tıkanmış R. microplus üzerinde yapıldığından , hücreler tek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sığır istilası, akarisitlerin 1 , 4 kullanımına bağlı en yaygın kontrol yöntemiyle dünyanın tropik ve subtropikal bölgelerinde sığır endüstrisi için büyük bir problem teşkil etmektedir. Bm86, daha önce Bm86 coğrafi dizilim varyasyonu ve düzenli boostlama gereksinimi 4 nedeniyle, bir aşı stratejisi olarak sınırlı başarı ile, R. microplus istila 10'a karşı koruyucu bir antijen olarak kene bağırsak epitel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışma için kullanılan Rhipicephalus microplus kenelerinin sağlanması için Biosecurity Tick Colony'ye (Queensland Tarım ve Balıkçılık, Avustralya) ve Lucas Karbanowicz'e video çekimi için yardım etmekten dolayı teşekkür etmek istiyorlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,4 Tripan MavisiThermoFisher Scientific15250061
1,5 mL mikrosantrifüj tüpüEppendorf3322
100mM Karbonat Tamponu3,03 g Na2CO3, 6,0 g NaHCO3 1000 ml damıtılmış su pH 9,6
16 mL sızdırmazlık kapaklı santrifüj tüpleriThermo Scientific3138-0016mikrodan önce buzda soğutun
; M hücre süzgeciThermo Fisher87791
3,3 & prime ;, 5,5 & prime; -Tetrametilbenzidin (TMB) ELISASigmaT04404C'de Saklanır
30 Hidrojen PeroksitLaboratuvar SahnesiBSPA5.500
%4-20 Tris-MOPS JelGen Komut DosyasıM42015
4-Kloro-1-naftol tabletSigma-AldrichC6788
50 mL Falcon TüpCorning Mavisi30 x 115mm stil. Polipropilen konik boru.
70 ve mikro; M hücre süzgeciBD Falcon352350
AP15 filtre kağıdıMillipore AO1504200
Biotin (Tip A) Konjugasyon KitiAbcamAb102865
Diseksiyon mikroskobuOlympusSZX7
DP Manager Olympus2.2.1.195Hücre görüntü yazılımı
Koli BandıEv Tamircisi48mm x 25mm Koli Bandı
Dulbecco' s Modifiye Eagle MediumGibco11995-065DMEM - protokol EDTA için buz gibi
Amresco0105-500G
F96 Maxisorp İmmünoPlaka Nunc439454
Fetal Sığır SerumuSigma-Aldrich12003CFCS
Floresan mikroskobu ve nbsp;  Olimpos DAPI
Fluoroshield
>% 99
GlisinSigma-Aldrich410225
Hank' s Dengeli Tuz ÇözeltisiSigma Yaşam BilimleriH9394HBSS ve protokol Hematitometre için buz gibi
Optik Lakor-
L-Glutatyon oksitlenmişSigma-AldrichG4376
Manyetik Ayırma StandıNovagen-4Tüplü Manyetik Ayırma Rafı
MetanolSigma-Aldrich179337
Milli-Q SuMilliporeZRXQ003WWUltra Saf Su için Entegre Su Arıtma Sistemi
Nitroselüloz MembranYaşam Bilimleri6648530cm x 3M saf nitroselüloz membran
PageRuler Prestained protein MerdivenThermo-FisherSM0671
PBS1,16 g Na2HPO4, 0,1 g KCl, 0,1 g K3PO4, 4,0 g NaCl (500 ml damıtılmış su) pH 7,4
PercollSigma-AldrichP1644-500ML
Peristaltik PompaMasterflex7518-10
Fosforik AsitSigma-AldrichP6560
Pierce Protein İçermeyen T20 PBS Bloke Edici TamponTermo-Scientific375734C'de Saklanır. Bloke Edici Tampon
Proteaz İnhibitörü KokteylSigma-AldrichP8215-5MLPIC – -20 ° C
Hızlı Başlangıç Bradford Boya Reaktifi 1xBiorad500-0205Bradford Testi için
Hızlı Başlangıç BSA StandartlarıBiorad500-0207Bradford Testi için BSA standartları
NeşterLaboratuvarı Co Boyutu11 Neşter
SilverQuest TM Boyama KitiInvitrogenLC6070
Simply Blue TM Güvenli Boyama InvitrogenLC6060
Sorvall C6 + UltrasantrifüjTermo Bilimsel46910
Streptavidin (HRP)AbcamAB7403
Streptavidin Manyetik BoncukNew England BiolabsS1420S
Süper Yapıştırıcı - Ultra Hızlı MiniUHUUHU Süper Yapıştırıcı 1mg. Ultra Hızlı mini
Masa Üstü SantrifüjEppendorf22331
TCEPThermo Fisher20490
Triton X-100Biorad161-0407
Tween-20SigmaP2287-500ML
Vorteks KarıştırıcıRatekVM1
Su BanyosuHibeGD100
Gradyan 250 ve için Sıvı Substrat Sistemi % Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI Forseps Dumont # 9 Dumont - Switerzland Gliserol Sigma-Aldrich G5516 Moleküler biyoloji için Gliserol ile BX51 El Tipi Tezgah Ofisleri JA0376230 soğuk

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
  3. García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
  4. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
  5. Kearney, S. Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , AgNote No. K58. (2013).
  6. Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
  7. Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
  8. Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
  9. Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
  10. Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
  11. Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
  12. Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
  13. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
  14. Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
  15. Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
  18. Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , Pergamon Press. 201-205 (1982).
  19. Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, Two, Oxford University Press. (2014).
  20. Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Percoll GradyanStreptavidin Manyetik BoncuklarH cre Y zeyi Proteini zolasyonuKene Ba rsak Epitel H creleriFloresan MikroskobiSDS PAGE AnaliziELISA Tespiti

İlgili makaleler