Method Article

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması Epitelyal Gut Hücreleri

DOI:

10.3791/55747

⸱

July 23rd, 2017

 ,  , 
1Queensland Alliance for Agriculture & Food Innovation, The University of Queensland, 2Centre for Comparative Genomics, Murdoch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rhipicephalus microplus bağırsak dokusundan epitel hücrelerini izole etmek için modifiye bir yoğunluk santrifüj gradyan tabanlı metodoloji kullanıldı. Yüzeye bağlı proteinler, biyotinlenmiş ve streptavidin manyetik boncuklarla arıtılmış uygulamalarda kullanılmak üzere saflaştırılmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rhipicephalus microplus - sığır kene - birçok patojen vektörü olarak hayvancılık üzerindeki ekonomik etki açısından en önemli ektoparazitedir. Damla bağırsak epitel hücrelerinin yüzeyinde bulunan BM86 gibi aşı adaylarının bulunmasına odaklanarak, zararlı etkilerini azaltmak için sığır kene kontrolüne yönelik çalışmalar yapılmıştır. Mevcut araştırmalar, diğer aşı adaylarını taramak için cDNA ve genomik kütüphanelerin kullanımına odaklanmaktadır. Dişi bağırsak hücrelerinin izolasyonu, kenet hücresi zarı üzerine yüzey proteinlerinin kompozisyonunun araştırılmasında önemli bir avantaj teşkil eder. Bu yazı, yarı-sıkışmış R. microplus'un bağırsak içeriğinden epitel hücrelerinin izolasyonu için yeni ve uygulanabilir bir yöntem teşkil etmektedir . Bu protokol, subepitelyal destek dokularından epitel hücrelerini serbest bırakmak için TCEP ve EDTA'yı ve süreksiz yoğunluk santrifüj gradyanını kullanmaktadırNt, epitel hücrelerini diğer hücre türlerinden ayırır. Hücre yüzey proteinleri biyotinile edildi ve FACS veya LC-MS / MS analizinde aşağı akış uygulamaları için streptavidin bağlantılı manyetik boncuklar kullanarak kene bağırsak epitel hücrelerinden izole edildi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sığır kenesi Rhipicephalus microplus , sığır kene humması (babesiosis), anaplasmosis ve equine piroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4'ü vektörelleştirdiği için tropik ve subtropikal bölgelerdeki sığır endüstrisi üzerindeki ekonomik etki açısından en önemli ektoparazitedir. Zararlı etkiyi azaltmak için sığır kene kontrolüne yönelik çalışmalar yapılmıştır ancak kimyasal akarisitlerin kullanımı gibi geleneksel yöntemlerin süt ve ette kimyasal kalıntıların varlığı ve kimyasal olarak dirençli kenelerin yaygınlığı gibi örtük dezavantajları vard....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bağırsak epitelinin R. microplus'tan diseksiyonu

  1. Deney günü sığırlardan yarı-sıkıştırılmış kene toplayın. Kene ortasından kaldırıldıktan 24 saat sonra parçalara ayırın.
  2. 92 mm x 16 mm Petri kabının tabanına bir şerit bandı yapıştırın. Kasete süper yapışkan bir damla ekleyin. Kene, ventral tarafı süper tutkal üzerine indirin, 2 dakika kurumaya bırakın.
  3. Petri kabı içine 100 mL fosfat tamponlu salin (PBS) dökün veya kene tamamen su altına alıncaya kadar.
  4. 11 numaralı bir neşter kullanarak, kene her iki yanında da gözlerin üstünden alttaki festo parçalarına kadar kesilir.
  5. Steril forseps kullanarak....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitelyal hücreler, Şekil 1'de sunulan şematik gibi R. microplus'un bağırsak dokularından izole edildi. Bu protokolü kullanarak hazırlanan kene bağırsak epitel hücrelerinin temsili floresan mikroskopi görüntüleri Şekil 2A'da gösterilmektedir Ve 2B. Hücre izolasyonu, yarı-tıkanmış R. microplus üzerinde yapıldığından , hücreler tek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sığır istilası, akarisitlerin 1 , 4 kullanımına bağlı en yaygın kontrol yöntemiyle dünyanın tropik ve subtropikal bölgelerinde sığır endüstrisi için büyük bir problem teşkil etmektedir. Bm86, daha önce Bm86 coğrafi dizilim varyasyonu ve düzenli boostlama gereksinimi 4 nedeniyle, bir aşı stratejisi olarak sınırlı başarı ile, R. microplus istila 10'a karşı koruyucu bir antijen olarak kene bağırsak epitel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışma için kullanılan Rhipicephalus microplus kenelerinin sağlanması için Biosecurity Tick Colony'ye (Queensland Tarım ve Balıkçılık, Avustralya) ve Lucas Karbanowicz'e video çekimi için yardım etmekten dolayı teşekkür etmek istiyorlar.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
%0,4 Tripan MavisiThermoFisher Scientific15250061
1,5 mL mikrosantrifüj tüpüEppendorf3322
100mM Karbonat Tamponu3,03 g Na2CO3, 6,0 g NaHCO3 1000 ml damıtılmış su pH 9,6
16 mL sızdırmazlık kapaklı santrifüj tüpleriThermo Scientific3138-0016mikrodan önce buzda soğutun
; M hücre süzgeciThermo Fisher87791
3,3 & prime ;, 5,5 & prime; -Tetrametilbenzidin (TMB) ELISASigmaT04404C'de Saklanır
30 Hidrojen PeroksitLaboratuvar SahnesiBSPA5.500
%4-20 Tris-MOPS JelGen Komut DosyasıM42015
4-Kloro-1-naftol tabletSigma-AldrichC6788
50 mL Falcon TüpCorning Mavisi30 x 115mm stil. Polipropilen konik boru.
70 ve mikro; M hücre süzgeciBD Falcon352350
AP15 filtre kağıdıMillipore AO1504200
Biotin (Tip A) Konjugasyon KitiAbcamAb102865
Diseksiyon mikroskobuOlympusSZX7
DP Manager Olympus2.2.1.195Hücre görüntü yazılımı
Koli BandıEv Tamircisi48mm x 25mm Koli Bandı
Dulbecco' s Modifiye Eagle MediumGibco11995-065DMEM - protokol EDTA için buz gibi
Amresco0105-500G
F96 Maxisorp İmmünoPlaka Nunc439454
Fetal Sığır SerumuSigma-Aldrich12003CFCS
Floresan mikroskobu ve nbsp;  Olimpos DAPI
Fluoroshield
>% 99
GlisinSigma-Aldrich410225
Hank' s Dengeli Tuz ÇözeltisiSigma Yaşam BilimleriH9394HBSS ve protokol Hematitometre için buz gibi
Optik Lakor-
L-Glutatyon oksitlenmişSigma-AldrichG4376
Manyetik Ayırma StandıNovagen-4Tüplü Manyetik Ayırma Rafı
MetanolSigma-Aldrich179337
Milli-Q SuMilliporeZRXQ003WWUltra Saf Su için Entegre Su Arıtma Sistemi
Nitroselüloz MembranYaşam Bilimleri6648530cm x 3M saf nitroselüloz membran
PageRuler Prestained protein MerdivenThermo-FisherSM0671
PBS1,16 g Na2HPO4, 0,1 g KCl, 0,1 g K3PO4, 4,0 g NaCl (500 ml damıtılmış su) pH 7,4
PercollSigma-AldrichP1644-500ML
Peristaltik PompaMasterflex7518-10
Fosforik AsitSigma-AldrichP6560
Pierce Protein İçermeyen T20 PBS Bloke Edici TamponTermo-Scientific375734C'de Saklanır. Bloke Edici Tampon
Proteaz İnhibitörü KokteylSigma-AldrichP8215-5MLPIC – -20 ° C
Hızlı Başlangıç Bradford Boya Reaktifi 1xBiorad500-0205Bradford Testi için
Hızlı Başlangıç BSA StandartlarıBiorad500-0207Bradford Testi için BSA standartları
NeşterLaboratuvarı Co Boyutu11 Neşter
SilverQuest TM Boyama KitiInvitrogenLC6070
Simply Blue TM Güvenli Boyama InvitrogenLC6060
Sorvall C6 + UltrasantrifüjTermo Bilimsel46910
Streptavidin (HRP)AbcamAB7403
Streptavidin Manyetik BoncukNew England BiolabsS1420S
Süper Yapıştırıcı - Ultra Hızlı MiniUHUUHU Süper Yapıştırıcı 1mg. Ultra Hızlı mini
Masa Üstü SantrifüjEppendorf22331
TCEPThermo Fisher20490
Triton X-100Biorad161-0407
Tween-20SigmaP2287-500ML
Vorteks KarıştırıcıRatekVM1
Su BanyosuHibeGD100
Gradyan 250 ve için Sıvı Substrat Sistemi % Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI Forseps Dumont # 9 Dumont - Switerzland Gliserol Sigma-Aldrich G5516 Moleküler biyoloji için Gliserol ile BX51 El Tipi Tezgah Ofisleri JA0376230 soğuk

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Rhipicephalus microplusEpithelial Gut CellsBiotinylated Cell Surface ProteinsPercoll GradientStreptavidin Magnetic BeadsCell Surface Protein IsolationTick Gut Epithelial CellsFluorescence MicroscopySDS PAGE AnalysisELISA Detection

Related Articles