Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

10.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55757

⸱

9 Ağustos 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Özet

Miyokard İnfarktüsü ve sonraki iskemik art arda sıralı cardiomyocytes, konjestif kalp yetmezliği, ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir önde gelen geniş kaybına neden. Mezenkimal Kök hücre (MSCs) geçerli, invaziv teknikler değiştirmek hücre tabanlı terapiler için umut verici bir seçenek vardır. MSCs kardiyak hücre tipleri, dahil olmak üzere Mezenkimal soy ayırabilirsiniz ama fonksiyonel hücrelere tam farklılaşma değil henüz elde. Önceki yöntemler farklılaşma farmakolojik ajanlar veya büyüme faktörleri dayalı. Ancak, daha fizyolojik ilgili stratejileri cardiomyogenic dönüşüme MSCs etkinleştirmesini de isteyebilirsiniz. Burada, cardiomyocyte gibi sözleşme hücreleri üretmek için cardiomyocyte besleyici katmanlar üzerinde MSC toplamları kullanarak bir farklılaşma yöntem mevcut.

İnsan göbek kordonu Perivasküler hücreleri (HUCPVCs) daha ayrıştırması daha potansiyel için gösterilmiştir kemik iliği MSCs (BMSCs) gibi MSC türleri yaygın olarak araştırıldı. Ontogenetically genç bir kaynağı olarak, biz büyük kaynaklarına göre birinci üç aylık dönem (FTM) HUCPVCs cardiomyogenic potansiyelini araştırdık. FTM HUCPVCs çoğu zaman kültürlü rahim içinde immunoprivileged özellikleri korumak MSCs roman, zengin bir kaynağıdır vitro. Bu farklılaşma protokolü, FTM ve terim kullanarak HUCPVCs BMSCs için karşılaştırıldığında önemli ölçüde artış cardiomyogenic farklılaşma cardiomyocyte işaretleri (Yani, myocyte artırıcı bir faktör 2 C, kardiyak troponin T, ağır zincir kardiyak myosin, sinyal düzenleyici protein α ve connexin 43) artan ifade tarafından belirtildiği şekilde elde. Onlar da kendi alt HLA-A ifade ve daha yüksek HLA-G ifade tarafından gösterdiği olarak anlamlı derecede düşük immünojenisite muhafaza. Farklılaşma toplamak tabanlı uygulama, FTM HUCPVCs potansiyel ve oluşturulan ortak kültür kardiyak besleyici katmanlar üzerinde 1 hafta içinde hücre kümeleri müteahhitlik, bunu yapmak için ilk MSC türü haline artan toplama oluşumu gösterdi.

Bu farklılaşma stratejisi etkili FTM HUCPVCs gibi genç MSCs cardiomyogenic potansiyelini koşum ve o vitro öncesi farklılaşma onların rejeneratif etkinliği içinde vivoartırmak için potansiyel bir strateji olabilir öneriyor bizim sonuçlar gösterilmektedir.

Giriş

Konjestif kalp yetmezliği (CHF) morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen bir nedeni olarak devam ederse. En düşük CHF kez cardiomyocytes büyük kaybı ve akut miyokard infarktüsü (mı)1patolojik sonucu olarak skar dokusu boş hücre gelişimi takip oluşur. Kalp kısmen kendi kendini yenileyerek bir organ olmakla birlikte, bereket ve fonksiyon kez yaralanma sonra en iyi kurtarma için yetersiz hale yaşlı hastalarda ikamet kök ve progenitör hücre havuz önemli ölçüde doku rejenerasyonu yürütmek için sorumlu azalır. Böylece, sağlıklı donör hücre nakli hasarlı Miyokardiyum içine dahil deneysel tedaviler geliştirmede büyük bir ilgi vardır. Donör hücreleri doku yapısı geri kalmayıp aynı zamanda etkilenen Miyokardiyum fonksiyonel iyileşme elde etmek olduğunu zorunludur.

Yerel kalp kalp doku yerleşik istihdam ve endojen kemik iliği kökenli kök hücre sonrası yaralanma için2,3,4onarmak. Rejeneratif hücreleri-host ve donör-kaynaklı hem-must uygun fenotip ve yetenek verimli ve güvenli bir şekilde kayıp hücreleri değiştirmek için birlikte remodeling Miyokardiyum microenvironment işlevinde elde etmek için kapasite var. Vitro farklılaştırma yöntemleri yaygın yüksek verimli, kök hücre tabanlı cardiomyocyte üretim5,6elde etmek için kullanılmaktadır. Kardiyak lineage işaretleri ifade profili kardiyak lineage7karşı kök hücre farklılaşma süreci tanımlamak için kullanılır. Erken ayırt etme belirteçleri, NKX2.5, myocyte enhancer factor 2 C gibi (Mef2c) ve GATA48,9, cardiomyogenic sürecinin başlangıç belirtisi olabilir. Olgun cardiomyocyte işaretleri farklılaşma etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan sinyal düzenleyici protein α (SIRPA)10, kardiyak troponin T (cTnT)11, ağır zincir kardiyak myosin (MYH6)8,12,13ve connexin 43 (Cx43)14,15,16' dır. Embriyonik kök hücreler (ESCs) ve pluripotent kök hücreler (PSC) kullanarak yöntemler iyice en iyi duruma getirilmiş ve endüktif faktörler, oksijen ve besin gradyan ayrıntılarını ve eylem5,6,7,17,18tam zamanlaması ile ilgili ele. Yine de, ESC ve PSC temel teknolojileri hala birden çok etik ve güvenlik endişeleri, suboptimal Elektrofizyolojik ve immünolojik özellikleri19,20birlikte mevcut. Bu hücreler ile sık sık nakledilen ev sahipliği yapan immunorejection deneyim ve kalıcı immünosupresyon gerektirir. Bu esas olarak MHC kompleksi (MHC) molekülleri ana bilgisayar ve donör ve elde edilen T hücreli yanıt21eşleşmeyebilir nedeniyle. Bireysel MHC sınıf ı eşleştirme olası bir çözüm, daha erişilebilir bir klinik pratikte immunoprivileged ret endişe üstesinden gelmek için evrensel bir hücre kaynağı gerektirir.

Klinik uygulamalar, MSCs ve özellikle, BMSCs, kullanmak için bir alternatif hücre kaynağı olarak kullanılmak üzere doku rejenerasyonu 199522onların ilk açıklama beri araştırdı. MSCs hemen hemen her bozukluklarına doku23' bulunabilir yerleşik rejeneratif hücreleri olduğuna inanılmaktadır. Yalıtım istenilen kaynaktan üzerine MSCs kültüründe kolayca genişletilebilir, geniş parakrin kapasitesine sahip ve genellikle immunoprivileged ya da immunomodulatory özellikleri24,25sahip. Onların güvenliği ve etkinliği zaten birkaç önceden klinik çalışmalarda, özellikle kalp yenilenme3,26için gösterilmiştir.

Birçok MSC farklılaşma stratejileri farmakolojik ajanlar, 5-azacytidine22 ve DMSO27ve büyüme veya BMP5,7,28,29 veya Anjiyotensin-II gibi30, morphogenic faktörler gibi değişken verimlilik ile kullanmaktadır. Bu stratejiler, saf rejeneratif hücre posta veya yaralanma siteye teslim sonra karşılaşmak muhtemeldir engelleri Ancak, temel alan değil içinde vivo. Daha fizyolojik ilgili stratejileri, süre daha zor için tanımlamak ve işlemek, MSC farklılaşma doku microenvironment gelen sinyalleri aracılığıyla bağlı olmak öncül dayalı. Önceki çalışmalarda bu maruz kalma kardiyak hücre lysates31 veya Ventriküler Miyokardiyum32,33göstermiştir veya doğrudan birincil cardiomyocytes vitro15,34, kişiyle MSCs kardiyak işaretlerinin ifade artırabilir. Kısmen, BMSCs ve cardiomyocytes39,40 füzyon doğmakta olan Miyokardiyum oluşturulan, ancak diğerleri ile MSCs35,36,37,38, kardiyak yaralanmaları tedavi sonra spontan cardiomyogenesis göstermiştir. Bilgimizi, fonksiyonel, kendiliğinden sözleşme cardiomyocytes insan MSCs (hMSCs) herhangi bir doku kaynağı üzerinden henüz bildirilmiştir değil.

Geçerli fikir birliği tüm MSCs Perivasküler hücreleri23ortaya olduğunu. Genç MSCs pericyte özelliklere sahip insan göbek kordonu doku41,42,43Perivasküler bölgesinden ayrılmış olabilir. BMSCs ile karşılaştırıldığında, HUCPVCs sahip artan farklılaşma potansiyeli ve birçok Rejeneratif avantajı, her iki vitro41,44 ve in vivo45,46,47. Özellikle, maternal-fetal arabirim olan kaynak, önemli ölçüde daha düşük immünojenisite MSCs yetişkin kaynaklarına göre HUCPVCs var. Bizim araştırma karakterizasyonu ve FTM HUCPVCs, araştırdık, MSCs en genç kaynak önceden klinik uygulamaları hangi biz daha önce proliferatif ve daha yüksek multilineage arttı göstermiştir odaklanır ayırt etme kapasiteleri, cardiomyogenic soy41yılında da dahil olmak üzere.

Burada, endüktif Kuvvetleri MSCs. toplamları tam cardiomyogenic farklılaşma ulaşmak için daha iyi koşullar içinde vivo 2D yapisan kültürlere göre modeller 3D bir çevre sağlamak olarak toplama oluşumu ve birincil kalp hücresi besleyici katmanlar birleştirir bir iletişim kuralı mevcut. Kardiyak besleyici katmanlar kullanarak son nakli site için MSCs temsilcisidir bir ortam sağlar. Biz öncesi ya da doğum sonrası göbek bağları izole MSCs genç kaynakları formu toplamları ve yetişkin BMSCs için hala onların bağışıklık ayrıcalık koruyarak karşılaştırıldığında kalp fenotip ulaşmak için daha yüksek bir kapasiteye sahip göstermek. Kardiyak lineage marker genler ve hücre içi indüklenen ifade dik yükselmesine dışında (Yani, cTnT ve MYH6) ve hücre yüzey proteinleri (Yani, SIRPA ve Cx43) belirli cardiomyocytes için biz göstermek FTM HUCPVCs farklılaşma potansiyeli bu yöntemle harnessed olabilir ve onlar kendiliğinden cardiomyocyte benzeri hücreler sözleşme için artış verebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanları içeren tüm çalışmalar ARRIVE guidelines48'e göre yürütülmüş ve raporlanmıştır. Tüm çalışmalar kurumsal araştırma etik kurul onayı (REB number 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Toronto Üniversitesi, Toronto, Kanada). Tüm hayvan prosedürleri, Üniversite Sağlık Ağı (Toronto, Kanada) Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı ve tüm hayvanlara, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, 8. baskıya (Ulusal Sağlık Enstitüleri 2011) uygun olarak insancıl bakım verildi.

1. Doku Kültürü

  1. Kültür FTM HUCPVC'ler, terim HUCPVC'ler (önceden kurulmuş, her biri için n ≥ 3 bağımsız satır)42 ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) kokteyli ile desteklenmiş alfa-minimum esansiyel ortamda (MEM) ticari olarak temin edilebilen BMSC'ler. Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda sıçan primer kardiyomiyositleri ve MSC-kardiyomiyosit ko-kültürlerini kültürleyin:% 10 FBS ve% 1 P / S.
    içeren Besin Karışımı F-12 (DMEM-F1) NOT: Ortamı 0.2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin. Hazırlanan orta solüsyonları 4 °C'de 3 haftaya kadar saklayın.
  2. Hücre kültürlerini nemlendirilmiş inkübatörlerde (%95 bağıl nem, 37 °C ve %5 CO2) ve faz kontrast mikroskobu ile belirlenen %70-80 birleşmede geçişi koruyun. Kullanılan doku kültürü kabının boyutu için uygun hacimlerde ortam kullanın (ör., 10 cm'lik bir tabakta 10 mL ve 6 oyuklu doku kültürü plakasında oyuk başına 2 mL). Protokol süresince bu kültür koşullarını kullanın.
  3. Bir ayrışma enzimi çözeltisi (6 oyuklu bir plakada 2 mL / oyuk) kullanarak geçiş veya MSC-kardiyomiyosit ko-kültür oluşumu için MSC tek katmanlarını ayırın ve 37 ° C'de 4 dakika inkübe edin.
  4. Ayrışmış hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
  5. Hücre peletini bozmadan süpernatanı aspire edin ve hücreleri, otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayım için uygun bir kültür ortamının 1 mL'sinde yeniden süspanse edin. Hücreleri aşağıdaki protokol bölümlerinde açıklandığı gibi tohumlayın.

2. Primer Sıçan Kardiyomiyosit-MSC Ko-kültürlerinin Hazırlanması

  1. Primer kardiyomiyosit izolasyonu için kalp dokusu elde edin.
    1. CO2 boğulması kullanarak sıçan yavrularını (doğumdan 5-6 gün sonra) ötenazi yapın. CO2 odalarını% 20 gaz değişimine ayarlayın (akış hızı = dakikada 0.2 x oda hacmi). Sıkışma refleksinin yokluğuyla exitus'u onaylayın.
    2. Sterilize edilmiş aletler (yani forseps ve kavisli makas) kullanarak ana kan damarlarını bağlayarak kulakçıkları çıkarın41. Kalpleri buz üzerinde %1 P/S (PBS-P/S) ile steril PBS içeren 50 mL'lik tüplere aktarın.
    3. Ventrikülleri ikiye bölün ve kanın buz üzerinde 10 mL PBS-P/S ile 10 cm'lik bir tabakta yıkanmasına izin verin. Kavisli makas kullanarak ventriküler duvarları küçük parçalar halinde (çap = 2-3 mm) kesin.
    4. 10-12 hayvanın kalp parçalarını serolojik bir pipet kullanarak 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve yerleşmelerine izin verin.
    5. Herhangi bir kalp parçasını çıkarmadan mümkün olduğunca çok PBS-P/S'yi çıkarın. 10 mL yeni PBS-P/S ekleyin.
  2. Kardiyomiyositleri izole etmek için kalp dokusunu sindirin.
    1. Kalp parçalarının oturmasına izin verin. PBS-P/S'yi PBS'de 10 mL %0.15 tripsin ile değiştirin ve 37 ° C'de 10 dakika çalkalayın.
    2. Süpernatanı atın. Adım 2.2.1'de açıklanan sindirimi üç kez daha tekrarlayın, ancak süpernatanları 10 mL %100 FBS içeren 50 mL toplama tüplerine boşaltın.
  3. Hücreleri santrifüjleyin (400 x g, 5 dakika) ve süpernatanı aspire edin. %10 FBS ve %1 P/S içeren DMEM-F12'deki hücreleri yeniden süspanse edin ve 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın (1 x 105 hücre/cm2, kuyucuk başına 2 mL ortam).
  4. 1 saat sonra, bağlı olmayan hücreleri içeren ortamı 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve bağlı hücreleri atın. Süspansiyondaki hücreleri sayın ve bunları yeni 6 oyuklu plakalara (1 x 105 hücre /cm2, oyuk başına% 10 FBS ve% 1 P / S içeren 2 mL DMEM-F12) yeniden kaplayın.
  5. Bromodeoksiüridin (BrdU) ile hücre proliferasyonunu inhibe edin.
    Dikkat: BrdU güçlü bir teratojendir ve şüpheli mutajendir. Lütfen uygun eğitimin verildiğinden emin olun ve kullanmadan önce güvenlik bilgi formuna bakın.
    1. Hücreler bağlandıktan sonra, 6 oyuklu plakadaki ortamı% 10 FBS,% 1 P / S (oyuk başına 2 mL ortam) ve 5 μM BrdU içeren DMEM-F12 ile değiştirin. 16 saat inkübe edin (37 °C,% 5 CO2).
    2. BrdU içeren ortamı çıkarın ve% 10 FBS ve% 1 P / S (oyuk başına 2 mL ortam) içeren DMEM-F12 ile değiştirin.
  6. Önceden boyanmış MSC'leri hazırlayın.
    1. MSC kültürleri 10 cm'lik tabaklarda% 70-80 birleştiğinde, kültür ortamını çıkarın ve 3 mL hücre ayrışma çözeltisi ekleyin. Çanağı 37 °C ve %5 CO2'de 5 dakika inkübe edin.
    2. Ayrışmış hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
    3. Hücre peletini bozmadan süpernatanı aspire edin ve hücreleri, otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayım için %10 FBS ve %1 P/S içeren 1 mL DMEM-F12'de yeniden süspanse edin.
    4. Hücreleri% 10 FBS ve% 1 P / S içeren 1 x10 6 MSC / mL DMEM-F12 konsantrasyonuna seyreltin.
    5. MSC'leri canlı, aktarılamayan floresan boya (5 μM, 30 dk, 37 °C, %5 CO2) ile 1,5 mL'lik santrifüj tüplerinde 1 saat inkübe edin.
    6. Tüpleri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 x 10 6 MSC / mL'lik bir hücre konsantrasyonu için% 10 FBS ve% 1 P / S içeren DMEM-F12'de yeniden süspanse edin. Bunu toplam 3 kez tekrarlayın.
  7. MSC'leri, 6 oyuklu plakanın oyuğu başına 10 x 104 hücre konsantrasyonunda kardiyomiyositlere (adım 2.5.2) aktarın.

3. Agrega Ko-kültürlerinin Hazırlanması

  1. % 10 FBS ve% 1 P / S ile desteklenmiş alfa-MEM'de tek hücreli bir MSC süspansiyonu (2 x 104 hücre / mL ortam, geçiş # ≤ 6) hazırlayın (bkz. adım 2.6).
    NOT: Hücrelerin geçişi için protokolün 1. bölümüne bakın. Alternatif olarak, MSC'leri adım 2.6'ya göre önceden boyayın.
  2. 10 cm'lik doku kültürü kaplarının kapaklarının iç yüzeyine (kapak başına 50 damlaya kadar) 25 μL damla hücre süspansiyonu (500 hücre) yerleştirerek agrega oluşumunu başlatın. Kapakları PBS-P/S içeren alt muadillerine yerleştirin. 37 °C ve %5 CO2.
    'da inkübe edin NOT: Damla buharlaşmasını önlemek için 5-7 mL PBS-P/S'yi asılı damlaların altındaki kültür kabına yerleştirin.
  3. Stereomikroskop kullanarak 3 gün sonra damlalarda agrega oluşumunu gözlemleyin. 50 damlanın 40'ından fazlası oluşmuş agregalar içeriyorsa, damlaları 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak kapaklardan toplayın ve agregaları doğrudan birincil sıçan kardiyomiyosit tek katmanlarına aktarın (adım 2.1-2.7; 10 damla / kuyucuk). Agrega bütünlüğünü korumak için sert pipetlemeden kaçının.
  4. Agrega ko-kültürlerini inkübatörlerde 2 haftaya kadar tutun, her 72 saatte bir ortamın tam hacmini (oyuk başına% 10 FBS ve% 1 P / S içeren 2 mL DMEM-F12) değiştirin.
    1. Parlak alan mikroskobu kullanarak besleyici hücre katmanlarına yapışan agregaları günlük olarak gözlemleyin. Gözlemlendiğinde sözleşme toplamlarını kaydedin.
  5. Toplamları analiz için hazırlayın.
    1. Ortamı çıkarın ve 6 oyuklu bir doku kültürü kabının oyuğu başına 2 mL PBS ekleyin. PBS'yi çıkarın ve kuyucuk başına 2 mL ayrışma çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3 dakika inkübe edin.
    2. Bir hücre peleti elde etmek için 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Sonraki adımlarda açıklanan uygulamalar için belirtildiği gibi (bkz. adım 4.1, 5.1 ve 6.1) ortamda yeniden süspanse edin ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.

4. Akış Sitometrisi (FC) ve Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralama (FACS)

  1. Florofor konjuge (FITC veya APC) primer antikorlar (yani, CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G ve FC için SIRPA; 1:40) ile hücre süspansiyonlarını (% 3 FBS içeren 200 μL PBS'de 1 x 105 hücre) inkübe edin veya FCS için TRA-1-85; 1:40) 4 ° C'de 30 dakika boyunca, ışıktan korunarak.
  2. Santrifüjleyin (400 x g, 5 dk) ve hücreleri FC için% 3 FBS ile 1 mL PBS'de veya FACS için% 0.5 FBS ile PBS'de yeniden süspanse edin.
    NOT: MSC'lerin FC'si Hong ve diğerleri tarafından optimize edilmiştir.41.
  3. Hücreleri, FC (en az 1 x 104 olay) veya FACS tarafından analiz edilmeye hazır olana kadar karanlıkta 4 ° C'de tutun. Hücreleri aşağıdaki gibi sıralayın41. TRA-1-85 yüksek pozitif sıralanmış hücreleri 6 oyuklu plakalarda (1 x 104 hücre / oyuk, %10 FBS ve %1 P/S içeren 2 mL DMEM-F12) 1 h.
    içinde yeniden plakalayın NOT: TRA-1-85 insan hücre yüzeyi antijeninin geçit stratejisi için Ek Şekle bakınız.

5. İmmünositokimya (ICC) ve Mikroskopi

  1. Ko-kültürlerden (adım 3.5.2) veya FACS'den (bölüm 4) elde edilen hücre süspansiyonlarını oda slaytları (1 x 104 hücre / oyuk, oyuk başına% 10 FBS ve% 1 P / S içeren 2 mL DMEM-F12) üzerine yeniden plakalayın. Hücrelerin bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca tutunmasına izin verin (koşullar için bölüm 1'e bakınız).
  2. Hücreleri PBS'de 3 mL %4 paraformaldehit (PFA) kullanarak oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin. % 1 sığır serum albümini (BSA; PBS-BSA) yıkama başına 5 dakika
    Dikkat: PFA'yı kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
  3. Hücreleri% 0.1 Triton X-100 ile 3 mL PBS-BSA'da geçirgenleştirin. Hücre içi antijenler (yani, alfa sarkomerik aktinin (aSarc) ve Cx43) için 10 dakika veya intra-nükleer antijenler (yani, Mef2c ve insan nükleer antijeni (HuNu)) için 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Yıkama başına 5 dakika boyunca 3 mL PBS-BSA ile 3 kez yıkayın.
    4. Oda
  4. sıcaklığında 15 dakika boyunca% 5 normal keçi serumu (NGS) ve% 1 BSA içeren 3 mL PBS ile spesifik olmayan antikor reaksiyonlarına karşı numuneleri bloke edin. Yıkama başına 5 dakika boyunca 3 mL PBS-BSA ile 3 kez yıkayın.
  5. Birincil antikorlardaki hücreleri inkübe edin (ör., Mef2c, aSarc, Cx43 ve HuNu) gece boyunca 4 ° C'de 3 mL PBS-BSA'da 1:200 oranında seyreltilir.
  6. Yıkama başına 5 dakika boyunca 3 mL PBS-BSA ile 3 kez yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin. Yıkama başına 5 dakika boyunca 3 mL PBS-BSA ile 3 kez yıkayın.
  7. Lekeli numuneleri 3 mL montaj ortamında saklayın.
  8. Floresan mikroskobu kullanarak görüntü elde edin. Daha düşük büyütmeli görüntüleme için 10X objektif (NA = 0,3) ve 20X objektif (NA = 0,45) kullanın. Kullanılan ikincil antikorlar için GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) ve RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) için floresan filtre küpleri ve dalga boyları kullanın (bkz. Malzeme ve Ekipman Tablosu).
  9. Görüntüleme yazılımı kullanarak görüntülerin miktarını belirleyin (önerilen yazılım için Malzeme ve Ekipman Tablosuna bakın). Floresan yoğunluğu okumalarını ikincil kontrol alımlarına normalleştirin.

6. RNA İzolasyonu ve Kantitatif RT-PCR

  1. Üreticinin talimatlarına göre, farklılaşmamış MSC kültürlerinden veya sütun tabanlı RNA izolasyonu kullanarak ortak kültürlerden sıralanan MSC'lerden RNA örnekleri hazırlayın. Numune başına 0,7 mL hücre lizis tamponunda (RNA izolasyon kiti ile sağlanır) 1 x 104 ila 1 x 106 hücre hazırlayın.
  2. 100 μL RT reaksiyonu başına 2 μg'a kadar RNA'dan cDNA hazırlayın.
  3. Reaksiyon başına 10 ng cDNA kullanarak qPCR gerçekleştirin (40 döngü, 60 °C tavlama/uzatma sıcaklığı).
    1. İnsan MY6H ve cTnT için 500 nM konsantrasyonda ve reaksiyon başına 1-100 ng cDNA'da primerler kullanın (Malzeme ve Ekipman Tablosuna bakın). Dahili temizlik normalleştiricileri olarak GAPDH, ACTB ve HPRT kullanın. Ticari olarak temin edilebilen insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositleri pozitif kontrol olarak kullanın.
      NOT: Farklılaşmamış MSC'den türetilmiş cDNA örneklerine kıyasla ifadenin kat değişimini ifade edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

HUCPVC'ler, BMSC'lere Kıyasla Daha Yüksek Agrega Oluşturma Potansiyeli ve CD49f Ekspresyon Seviyeleri Gösterir:

hMSC'lerin (yani FTM HUCPVC'lerin, term HUCPVC'lerin ve BMSC'lerin) farklılaşmasını indüklemek için, diferansiye olmamış MSC tek hücre süspansiyonları veya MSC içeren asılı damlalar (Tablo 1), sırasıyla doğrudan ko-kültürler veya agregat ko-kültürler oluşturmak amacıyla sıçan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kök hücre kardiyak farklılaşma geliştirme için 2 yılda altında MSC kaynaklardan cardiomyocyte benzeri hücreleri oluşturmak için kullanılan birkaç farklı stratejileri ile olmuştur. Bu stratejiler, birçoğu ancak, verimsiz, ve kullanılan koşulları genellikle çevre nakledilen hücreler karşılaşma içinde vivotemsilcisi değildir.

Mevcut yöntemler aksine burada sunulan Protokolü birincil kardiyak besleyici katmanlar ve MSC toplama oluşumu bir arada kullanır. Birincil kardiyak besleyici Katman...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Dr. Clifford L. Librach olduğunu ortak patent sahibinin: Kanada ve Avustralya'verilen yöntemleri yalıtım ve ilk üç aylık göbek kordonu dokusundan elde edilen hücre kullanımı,.

Teşekkürler

Yazarlar aşağıdaki personel üye teşekkür ve araştırma katkılarından dolayı personel: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg ve Andrée Gauthier-Fisher. Bu eser Ontario araştırma fonu tarafından - araştırmada mükemmellik (ORF-RE, yuvarlak #7) ve Program A.ş. oluşturmak destek verdi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin / EDTAGibco25200056Hücre ayrışması için
Alpha-MEMGibco12571071HUCPVC ve BMSC kültür ortamı için.
PE konjuge anti-insan / fare CD49f antikoruBiolegend313612için Integrin belirteci
R& D SystemsFAB7737Aantikoru Genway Biotech Inc. için Connexin 43 markörü
GWB-66FBD2FC
FITC konjuge anti-HLA-G [MEM-G / 9] antikoruimmünojenisite belirteciAbcamab7904
FITC konjuge fare anti-insan SIRPA / CD172a antikoruAbD Serotec / Bio-RadMCA2518Fkardiyak belirteç
R& D SystemsFAB3195AFC ve FACS için insan hücresi markörü
FITC konjuge insan TRA-1-85/CD147 antikoruR& D SystemsFAB3195FFC ve FACS
Anti-connexin 43 / GJA1 antikoruAbcamab11370Cx43 için insan hücresi belirteci. ICC
Keçi anti-tavşan IgG (H + L) çapraz emilen ikincil antikoru için, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428ICC
Anti-sarkomerik alfa aktinin [EA-53] antikoruAbcamab9465aSARC için. ICC
Keçi anti-fare IgM ağır zincir çapraz emilen ikincil antikor için, Alexa Fluor 555Yaşam TeknolojileriA-21426ICC
Mef2C (D80C1) XP tavşan antikoruNew England BioLabs Ltd.5030SICC
Eşek anti-tavşan IgG (H + L) ikincil antikoru için, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206ICC
Anti-nükleus (HuNu) (klon 235-1) antikoruEMD MilliporeMAB1281ICC
MZ9.5 için StereomikroskopLeicaAgregaları görüntülemek için.
1.5 ml santrifüj mikrotüpleriAxygenMCT-150-CMSC'leri floresan boya ile boyamak için.
ImageJAçık kaynaklı görüntü işleme yazılımı.
Aria II UHN SickKids FC Tesisi. Hücre sıralama için.
Kemik iliği, mesektimal stromal hücrelerLonzaPT-2501BMSC'ler,
Sığır serum albümini,Sigma-AldrichA7030-100GBSA. ICC
BrdUEMD MilliporeiçinDikkat: BrdU güçlü bir teratojendir ve şüpheli mutajendir. Lütfen uygun eğitimi sağlayın ve kullanmadan önce SDS'ye bakın.
Canto IIBDUHN SickKids FC Tesisi. Akış sitometrisi için.
cDNA EcoDry PremixClontech/Takara639570qPCR için cDNA'nın hazırlanması için
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Hücre sitoplazmasının floresan görüntülemesi
Countess otomatik hücre sayacıInvitrogen Inc.C10227Hücre sayımı için
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421Sıçan primer kardiyomiyosit kültür ortamı için.
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu TuzluGibco'su10010023D-PBS, Ca2+ olmadan, Mg2+
>EVOSLife TechnologiesKurum içi floresan mikroskobu
FACSCaliburBDKurum içi. Akış sitometrisi için.
Fetal sığır serumu (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. Hücre kültürü ortamının bileşeni.
IDT Prime Time qPCR problarıEntegre Veri TeknolojileriFAM floroforhttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Sulu Montaj Ortamı ThermoScientificTA-030-FMHücrelerin ICC
LSR II UHN SickKids FC Tesisi. Akış sitometrisi için.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Tesisi. Hücre sıralama için.
Normal keçi serumuHücre Sinyalizasyon Teknolojisi5425SNGS. ICC
Nunc Lab-Tek II Hazne Kapak CamıThermo Scientific Nunc155409
OmniPur Triton X-100 Yüzey Aktif MaddeEMD Millipore9410-OPiçin hücreler hazırlanırken geçirgenleştirici çözeltinin bir bileşeni olarak
,% 16 Çözelti, EM Dereceli ElektronMikroskobu Bilimleri15710ICC için hücreleri sabitlemek için.
Penisilin / streptomisinGibco15140122Hücre kültürü ortamının bileşeni.
PrimerlerSigmaÖzel Standart DNA Oligoları, Tuzdan Arındırılmış, 0.2 & mu; mol< güçlü>CTnT_F: < / güçlü> GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: < / güçlü> GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: < / güçlü> GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: < / güçlü> GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Çekirdek İplik Diski KonfokalZeissSickKids Görüntüleme Tesisi
ReproCardio hiPS hücre türevli kardiyomiyositlerReproCellRCD001NqPCR
RNeasy mini kitiQiagen74106qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitiQiagen204074Ana karışımlı qPCR için
RPMI 1640GibcoA1049101MSC için, monosit kokültür ortamı.
TaqMan qPCR primer testleriqPCRThermo Fisher Scientific4444556
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Canlılık ve sayım için hücrelerin boyanması
TripsinGibco272500108Hücre ayrışması için
VolocityPerkin-ElmerVolocity 6.3Görüntüleme yazılımı
0.2 & mu; m gözenek filtresiThermo Fisher Scientific566-0020Doku kültürü ortamını sterilize etmek için
HERAcell 150i CO2 İnkübatörThermo Fisher Scientific51026410Hücreleri inkübe etmek için
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan
ForsepsAlmedic7727- A10-704Sıçan kalbi vermek için. Benzer forseps kullanabilir.
MakasGüzel Bilim Araçları14059-11Sıçan kalbini kıymak için. Kavisli makas önerilir.
50 mL tüpBD Falcon352070Kardiyomiyosit toplama ve genel doku kültürü prosedürleri sırasında toplama için
15 mL tüpBD Falcon352096Genel doku kültürü prosedürleri için
6 oyuklu plakalarThermo Scientific NuncCA73520-906Doku kültürü için
10 cm doku kültürü kaplarıCorning25382-428Agrega oluşumu için
Axiovert 40C MikroskopZeissDoku kültürü ve protokolün geri kalanı boyunca parlak alan görüntüleme için
70 μ m hücreli süzgeçFisherbrand22363548Akış sitometrisi veya sıralamadan önce tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için
Triton X-100EMD Millipore9410-1Lgeçirgenleştirme çözümünde kullanılır
Cx43 lokalizasyonunun görselleştirilmesi sırasında kullanılan leke
FC APC konjuge insan Cx43 / GJA1 antikoru FC FITC konjuge HLA-A2 için FC için immünojenisite belirteci FC APC konjuge insan TRA-1-85 / CD147 antikoru için için BD , , çözümler hazırlamak MAB3424 BD için engelleme çözümünde kullanılır, 8 kuyulu ICC için numune hazırlamak için ICC Paraformaldehit için pozitif kontrol için ICC Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 için

Kaynaklar

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1(2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767(2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4(2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252(2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kardiyomiyosit FarklılaşmasıAgregat OluşumuKardiyak Besleyici TabakalarAkış SitometrisiFloresan MikroskopiKardiyomiyosit MarkerlarıHUCPVC Farklılaşmasıİmmünojenite DeğerlendirmesiKontraksiyon Gösteren Hücre Kümeleri
Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.