Method Article

İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

DOI:

10.3791/55762

⸱

June 14th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan mitral kapağının protein kompozisyonu halen kısmen bilinmemektedir, çünkü analizi düşük selülarite ve dolayısıyla düşük protein biyosentezi ile karmaşıktır. Bu çalışma, mitral kapak proteomunun analizi için verimli bir şekilde protein çıkarmak için bir protokol sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel proteomun analizi, karmaşık biyolojik sistemlerde bulunan proteinlerin büyük ölçekli tanımlanmasına ve nicelenmesine olanak tanıyan teknolojilerin geliştirilmesine bağlı olarak, hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Proteomik bir yaklaşımla edinilen bilgiler potansiyel olarak bir Hastalıkların altında yatan patojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yeni tanısal ve prognostik hastalık belirteçlerinin ve umutla terapötik hedeflerin tanımlanmasına izin verilmesi. Bununla birlikte, kardiyak mitral kapak, proteoglikan ve kollajene zenginleştirilmiş hücre dışı matriste düşük sellülariteden dolayı proteomik analiz için çok zor bir örnek oluşturmaktadır. Bu, küresel bir proteomik analiz için proteinlerin çıkarılmasını zorlaştırıyor. Bu çalışma, niceliksel proteomik ve imünoblotlama gibi daha sonraki protein analizleriyle uyumlu bir protokolü açıklamaktadır. Bu, veri endeksinin korelasyonuna izin verebilirG protein ekspresyonu ile kantitatif mRNA ekspresyonu ve kantitatif olmayan immünhistokimyasal analiz verileri. Gerçekten de, bu yaklaşımlar birlikte uygulandığında, mRNA'dan translasyon sonrası proteinin modifikasyonuna kadar hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır. Bu nedenle, bu yöntem kardiyak kapak fizyopatolojisi çalışması ile ilgilenen araştırmacılarla alakalı olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni kanıtlar, mRNA sentezinden sonra ortaya çıkan birçok düzenleyici mekanizmanın rollerinin anlaşılmasını değiştirmiştir. Gerçekten de translasyonel, post-transkripsiyonel ve proteolitik süreçler protein bolluğunu ve fonksiyonunu düzenleyebilir. MRNA konsantrasyonlarının mütekabil proteinlerin yakınlıkları olduğunu söyleyen dogma, transkript seviyelerinin protein bolluğunun ana belirleyicisi olduğu varsayılarak kısmen revize edildi. Gerçekten de, transkript seviyeleri sadece protein bolluğunu kısmen tahmin ederek transkripsiyon sonrası olayların kısmen öngörülmesini sağladı. Hücrelerdeki proteinleri regüle etmek için meydana gelir 1 , 2 .

Dahası, proteinler sonuçta hücrenin işleyişini dikte eder ve bu nedenle otokrin, parakrin ve endokrin faktörlere yanıt olarak dinamik değişikliklere uğrayabilen fenotipini dikte eder; Kan yoluyla alınan arabulucular; sıcaklık; İlaç tedavisi; Ve hastalık gelişirve etkin kılar. Bu nedenle, protein seviyesine odaklanmış bir ifade analizi proteomu karakterize etmek ve hastalık patogenezinin bir parçası olarak meydana gelen kritik değişiklikleri çözmek için faydalıdır 3 .

Bu nedenle, mevcut teknolojik zorluklara rağmen, proteomiklerin sağlık ve hastalık koşullarını netleştirmek için sunduğu imkanlar çok zorludur. Proteomiklerin katkıda bulunabileceği özellikle umut verici araştırma alanları: değişen protein ekspresyonunun herhangi bir seviyede tanımlanması ( yani tüm hücreler veya doku, hücre altı bölmeleri ve biyolojik sıvılar); Hastalığın teşhisi ve prognozu için yararlı olan yeni biyolojik belirteçlerin tanımlanması, doğrulanması ve geçerliliği; Ve umarım, ilaçların etkinliği ve toksisitesinin değerlendirilmesi için olduğu kadar, terapötik amaçlar için de kullanılabilen yeni protein hedeflerinin belirlenmesi 4 .

Karmaşıklığını yakalamakProteom teknolojik zorluğu temsil eder. Mevcut proteomik araçlar, değişen protein seviyelerinin tanımlanması, nicelendirilmesi ve geçerliliği için büyük ölçekli, yüksek verimli analiz gerçekleştirme fırsatı sunar. Buna ek olarak, en bol proteinlerin neden olduğu parazitlenmeyi önlemeyi amaçlayan fraksiyonlama ve zenginleştirme tekniklerinin uygulanması, en az miktarda protein içeren protein tanımlamasını geliştirmiştir. Son olarak, proteomik, protein fonksiyonunun önemli modülatörleri olarak giderek artan translasyon sonrası modifikasyonların analizi ile tamamlanmaktadır.

Bununla birlikte, analiz altındaki biyolojik numunelerde numune hazırlama ve protein geri kazanımı hala proteomik iş akışındaki sınırlayıcı adımlardır ve muhtemel tuzaklar için potansiyel arttırır 5 . Gerçekten de, optimize edilmesi gereken moleküler biyoloji tekniklerinin çoğunda, ilk adımlar doku homojenizasyonuIyon ve hücre lizisi, özellikle amplifıkasyon yöntemleri bulunmayan düşük bolluklu proteinlerin analizi sırasında. Buna ek olarak, proteinlerin kimyasal yapısı kendi iyileşmelerini de etkileyebilir. Örneğin, çok hidrofobik proteinlerin analizi çok zordur, çünkü trans-membran proteinleri neredeyse çözünmezken, izoelektrik odaklama esnasında kolayca çökelirler (Referans 5'te incelenmiştir). Dahası, doku bileşimi değişkenliği evrensel bir ekstraksiyon yönteminin geliştirilmesi için önemli bir engel oluşturmaktadır. Son olarak, klinik örneklerin neredeyse tamamı sınırlı miktarda olduğundan, az miktarda numune miktarından maksimum düzeyde iyileşme ve tekrarlanabilirliğe sahip protein hazırlamayı sağlamak çok önemlidir 6 .

Bu çalışma, proteomik analiz için çok zor bir numuneyi temsil eden normal insan kalp kapakçık kapağından protein ekstraksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır. Normal mitral kapak bir komp.Lex yapısı sol atrium ve kalbin sol ventrikül arasında yatıyor ( Şekil 1 ). Atriyumdan ventriküle doğru kan akışının kontrolünde önemli bir rol oynar, böylece geri akış engellenir ve tüm vücuda doğru oksijen tedariki düzeyi sağlanır, böylece yeterli bir kalp debisi sağlanır. Bununla birlikte, çoğunlukla ekstrasellüler matristeki, düşük sellülarite ve birkaç bileşen içeren, "aktif olmayan" bir doku olarak kabul edilir. Bunun nedeni, normal şartlarda yerleşik valvüler interstisyel hücreler (VIC'ler), düşük bir protein biyosentez oranına sahip sessiz bir fenotiptir.

Bununla birlikte, patolojik bir durumda, spongiosa'daki VIC sayısı arttığı ve protein sentezinin diğer fonksiyonel ve fenotipik değişikliklerle birlikte aktive edildiği gösterilmiştir 8 . Bu nedenle, şurada bulunan en düşük verininLiteratürde aktif VIC'lerin artan sayısı nispeten yüksek tanımlanan proteinleri açıklayabilecek patolojik mitral kapakçıkların 9 , 10 analizine odaklanmıştır.

Sonuç olarak, bu protokol, mitral kapak proteini bileşenleri çalışması yoluyla mitral kapak hastalıklarına neden olan patojenik mekanizmaların anlaşılmasını geliştirmeye hizmet edebilir. Aslında, altta yatan patolojik süreçlerin daha iyi anlaşılması, mevcut müdahale endikasyonları büyük ölçüde hemodinamik kaygılarla yüklü olan kapak hastalıklarının klinik yönetimini iyileştirmeye yardımcı olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, organ kalpleri normal ekokardiyografik parametrelere rağmen teknik veya işlevsel nedenlerle organ naklinden dışlanan çoklu organ donörlerinden çoklu organ explantasyonu (4-12 saat soğuk iskemi süresi, ortalama ± ± 2 saat) sırasında toplanır. Aortik ve pulmoner kapakçıkların bankacılığı için Milan Kardiyovasküler Doku Bankasına, Monzino Kardiyoloji Merkezi'ne (Milano, İtalya) gönderilirler. Mitral posterior broşürler klinik amaçla kullanılmaz, bu nedenle donorların akrabalarından bilgilendirilmiş onam alındığında aortik ve pulmoner kapak izolasyonu sırasında toplanırlar. Transplantasyon ve araştırma dokusu sadece ebeveynlerin izninden sonra toplanır; Izin belgesinde, insan klinik kullanımına ( yani, mikrobiyolojik, fonksiyonel ve serolojik sorunlar) uygun değilse, kardiyak doku kullanımını araştırma için etik komitesinin talimatlarını izleyen (veya değil)Monzino Kardiyoloji Merkezi.

1. Mitral kapak hazırlığı

  1. Organ eksplantasyonundan sonra mümkün olduğunca çabuk insan mitral kapağını hasat edin (4-12 saat soğuk iskemi süresi).
  2. Temiz bir odada kalbi, soğuk (4 ° C) bir solüsyonu ( örn. Tuzlu su çözeltisi veya dengeli orta Eurocollins veya Wisconsin) içeren taşıma çantasından çıkarın. Vantuz hazırlığına geçmek için bir kovaya koyun ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin (biyolojik tehlike sınıfı A, İyi Üretim Uygulamaları (GMP) sınıflandırması).
  3. Kalbi dolabın içindeki steril tek kullanımlık bir örtünün üzerine koyun. Steril tek kullanımlık bir neşter kullanarak, kalbi tam eksene dik olarak, apsisden yaklaşık 4 cm uzaktaki sol ve sağ ventrikler seviyesinde kesin.
  4. Sol atrium çatısını görüntülemek için, yükselen aorta ve pulmoner arteri hareket ettirin.
  5. Steril otoklavlanabilir forseps ve toplar ile sol kulakçığı kesipMitral kapağı görünür hale getirir ve büyük mitral yaprakçık (anterior) ve küçük mitral yaprak posteri (posterior) tanımlanmasına izin verir.
    NOT: Antero-lateral ve posterior medial komissürler, ön yaprakçık ve posterior alanın sınırını tanımlar.
  6. Steril otoklavlanabilir makas ve travmatik olmayan forseps kullanarak, tüm sol ventrikül kapağının çevresi etrafında sol atrium ve ventrikül duvar kalınlığını inceleyin .
  7. Mitro-aort kapak sürekliliğini belirleyin.
    NOT: Sol ventrikül bütün mitral kapak ve akorları içerir.
  8. Posterior mitral kapakçık leğeninden ön mitral kapakçık broşürünü ayırın ve posterior broşürü ventrikülle sokma (komissür) ile kesme.
  9. Salin solüsyonundaki posterior broşürü yıkayın. Broşürünü küçük parçalara (<1 cm2) kesin ve aluminyum folyoya ayrı ayrı sarın. Sıvı azot ile çalkalamayın.
    Dikkat: Sıvı azot kullanırken organizasyonel güvenlik prosedürlerini takip edin.
    1. İşlemin sonunda kabininin masasını% 70 izopropil alkol solüsyonu ve% 6 hidrojen peroksit solüsyonuyla haşlayın.

2. Protein ekstraksiyonu

  1. Sıvı azot içinde depolanan numuneyi almak için forseps kullanın ve alüminyum folyoya sarılı haldeyken derhal kuru buz üzerine koyun. Herhangi bir transfer sırasında numuneyi çözmeye bırakmayın.
  2. Öğütmeden önce, sıvı azotu (~ 500 mL) içeren bir Dewar şişeye koyarak numuneyle birlikte bir öğütücü sisteminin porselen / zirkon harcı ve havucu suyunu ( örn. CryoGrinder) soğutun.
    Dikkat: Sıvı azot kullanırken organizasyonel güvenlik prosedürlerini takip edin.
  3. Harcı ve havaneleri kuru buz içeren bir polistiren kutusuna koyun. Numuneyi alüminyum folyodan çıkarın ve harç içine koyun.
  4. ÖğütHarç karşı 15-20 kez büyük harç ile örnek, tornavida kullanarak havaneli döndürmek için. Öğütme işlemi sırasında, önceden soğutulmuş bir spatula ucu ile numuneyi karıştırın.
    1. Küçük havaneli ile tekrarlayın.
  5. Öğütülmüş numuneyi, tüp ters çevrilerek, harç üzerine yerleştirilerek ve tüpün içine götürmek üzere birlikte ters çevirerek daha önceden tartılmış bir tüpe ( örn., 15 mL santrifüj tüpüne) aktarın. Harca ait tüm malzemeleri geri kazanmak için önceden soğutulmuş bir spatula kullanın.
    1. Transfer esnasında örnek çözülmesini önlemek için, boruyu numuneyle kuru buzda tutun.
  6. Numunenin net ağırlığını hesaplayın.
  7. Her numuneden sonra harç ve kalıntıları temizleyin ve otoklavlayarak veya 200 ° C'de 2 saat ısıtılarak dekontamine ediniz.
  8. Toz haline getirilmiş numuneyi, ters çevirerek bir homojenleştiricinin cam tübüne santrifüj tüpünden aktarın.
  9. Filtrelenmiş üre büfesi ekleHer 10 mg toz haline getirilmiş doku için 200 uL üre tamponu cam tüpüne% 10 r (8 M üre, 2 M tiyoüre,% 4 w / v CHAPS, 20 mM Tris ve 55 mM ditiyotreitol) ilave edildi.
    NOT: Santrifüj tüpünde kalan artık toz halindeki örnek, hesaplanan hacimde üre tamponu kullanılarak geri kazanılabilir.
  10. Borosilikat cam harç ve bir politetrafloroetilen (PTFE) havan ile donatılmış bir karıştırıcı kullanarak numuneyi homojenize edin. 10'ar kez büküm hareketi (1,500 rpm) ile örnek üzerine yavaşça bastırın.
  11. Süpernatanı alın ve onu temiz bir 1.7 mL santrifüj tüpüne aktarın. Kalan numuneyi taze üre tamponuyla tekrar çıkarıp, ilk ekstraksiyon sırasında kullanılan hacmin yarısını ekleyin.
  12. Adım 2.10'ı tekrarlayın.
  13. Süpernatanı alın ve adım 2.11'deki süpernatana birleştirin. Birleştirilen süpernatanı 30 dakika süreyle bir tüp döndürücü üzerine yerleştirin.
  14. Boruyu 13,000 xg ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
  15. Süpernatanı veD Bradford protein deneyi kullanılarak üreticinin talimatlarına göre protein konsantrasyonunu ölçün. Kullanana kadar numuneyi -80 ° C'de saklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinlerin üre tamponunda ekstraksiyonu ve çözünmesi, izoelektrofocusing (iki boyutlu elektroforez (2-DE) 11 ve sıvı faz izoelektrik odaklama (IEF) 12 ) temelli proteomik yöntemlerle ve Laemmli tamponu 13'de seyreltildikten sonra immünoblotlama ile doğrudan uyumludur Bir proteaz inhibitörü kokteylini içeren 14 .

Jelden arındırılmı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün kritik bir adımı, numuneyi dondurmak ve öğütücü sistemini soğutmak için sıvı azot kullanılmasıdır. Sıvı azot kullanımı, biyolojik bozulmayı önler ve verimli tozlamaya izin verir, ancak güvenli kullanım için özel eğitim gerektirir.

Bu protokolde örnek öğütme için bir öğütücü sistemi bulunur, çünkü küçük numunelerin standart harç ve havanelerden kurtarılması zordur. Bu durumda, küçük numuneler, harç yüzeyinin üzerine ince bir toz halinde yayılır ve böylece toplama işlemi zorlaşır...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İtalyan Sağlık Bakanlığı, bu çalışmayı destekledi (RC 2013-BIO 15). Mükemmel teknik yardımıyla Barbara Micheli'ye teşekkür ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tuzlu su çözeltisi%0.9 NaCl
Eurocollins ASALF30874046Dengeli organın taşıma ortamıdır. Dengeli besiyeri elde etmek için 400 mL Eurocollins A'yı 100 mL Eurocollins B ile birleştirin: Eurocollins
Eurocollins BSALF 30874022Dengeli organın taşıma ortamı. Dengeli ortam elde etmek için 400 mL Eurocollins A'yı 100 mL Eurocollins B ile birleştirin Eurocollins
WisconsinKöprü ömrüRM/N 4081Dengeli organın taşıma ortamı
Biyolojik tehlike dikey akışlı havaBurdinolaSınıf A GMP sınıflandırması
Dewar FlaskThermo ScientificNalgene 4150-1000
Kriyogrinder sistemiOPS teşhisiCG 08-01Havan, tokmak ve tornavida içeren öğütücü sistemi
Paslanmaz çelik forseps
Paslanmaz çelik spatula
Tek kullanımlık steril neşterMedisafeMS-10
Paslanmaz çelik makasOtoklavlanabilir
Paslanmaz çelik kazmalarOtoklavlanabilir
Tek kullanımlık steril örtüMon & Tex3.307.08
İzopropil alkol%70 izopropil alkol
Hidrojen peroksit%6 hidrojen peroksit
Mikropipet, 1 mL, uçlu
15 mL santrifüj tüpleriVWR uluslararası9278
1.7 mL santrifüj tüpleriVWR uluslararasıPIER90410
Üre tamponu8 M üre, 2 M tiyoüre, %4 w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
UreaSigma aldrichU6504-1KGÜre tamponu için kullanılacak
ThioureaSigma aldrichT8656Üre tamponu için kullanılacak
CHAPSSigma aldrichC3023-5GRÜre tamponu
için kullanılacakDithiotreitolSigma aldrichD0632-5GÜre tamponu
Şırınga 50 mLiçin kullanılacak PICÜre tamponu
0.22 ve mikroyu filtrelemek için kullanılacak; m filtreMilliporeSLGP033RBÜre tamponunu filtrelemek için kullanılacak
PFTE Havaneli, 2 mLKartell6302Potter-Elvehjem homojenizatörün bir parçası
Borosilikat cam harcıKartell6102Potter-Elvehjem homojenizatörün bir parçası
KarıştırıcıVELP scientificaKarıştırıcı DLHPotter-Elvehjem
Bradford Protein tahlili ile homojenizasyon için kullanılmak üzereBio-Rad laboratuvarları5000006
Tüp döndürücüPbi InternationalF205
Sıvı nitrojen
Alüminyum folyo
Buz Polistiren
kutu
Kuru buz
Santrifüjü13.000 x g'da 1,7 mL santrifüj tüplerinin santrifüjlenmesi için
Dondurucu -80 derece; C
Hassas denge
OtoklavSterilizasyon
için Sıvı nitrojen
Eldivenler
Profesyonel cebri havalandırma ve doğal hava konveksiyonlu fırınSterilizasyon için
Proteaz inhibitörü kokteyliSigma aldrichP8340-5ML100X çözümü
ProteoExtract Protein Çökeltme KitiCalbiochem539180
RapiGestSuları186001861
Cytoscapewww.cytoscape.orgsürüm 2.7Gen Ontolojisi analizi için yazılım platformu
BiNGOhttp://apps.cytoscape.org/apps/bingosürüm 3.0.3Eklentisi Gen ontolojisi analizi için
AlphaB Crystallin/CRYAB AntikoruNovus BiologicalsNBP1-97494CryAB'ye karşı fare monoklonal antikoru
Septin-11 AntikoruNovus BiologicalsNBP1-83824Septin-11
FHL1 AntikorunaNovus BiologicalsNBP-188745karşı tavşan poliklonal
antikoruNovus BiologicalsNB110-68135Dermatopontin Keçi Anti faresine karşı tavşan poliklonal antikoru
IgGHRP Sigma aldrichA4416-0.5MLİmmünoblotlama için ikincil antikor
Keçi Anti tavşan IgG HRPBio-Rad laboratuvarları170-5046İmmünoblotlama için ikincil antikor
ile sterilizasyon solüsyonu ile sterilizasyon solüsyonu için kriyojenik eldivenler karşı tavşan poliklonal antikoru FHL-1 Dermatopontin Antikoruna

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699(2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein ExtractionMitral ValveProteomic AnalysisUrea BufferLiquid Nitrogen GrindingBradford AssayTwo Dimensional ElectrophoresisLiquid Chromatography Mass SpectrometryGene Ontology AnalysisCardiac Valve Disease

Related Articles