Method Article

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

DOI:

10.3791/55765

⸱

June 15th, 2017

 , 
1Transgenic Animal Unit, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetik olarak modifiye edilmiş farelerin kullanımı hem fizyolojik hem de patolojik in vivo süreçler üzerinde çalışmalara önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. DNA ekspresyon yapılarının fare devirde döllenen oositlere enjekte edilmesi, aşırı ekspresyon için transgenik fareler üretmek için en sık kullanılan teknik olarak kalır. Gen hedeflemesi için CRISPR teknolojisinin kullanıma girmesiyle, döllenmiş oositlere pronükleer enjeksiyon, hem nakavt hem de knockin farelerinin nesline kadar genişletildi. Bu çalışma, enjeksiyon için DNA'nın hazırlanmasını ve gen kontrolü için özel bir vurguyla gen hedeflemesi için CRISPR kılavuzlarının oluşturulmasını açıklamaktadır. Potansiyel kurucuların tespiti için gerekli genotiplendirme prosedürleri kritik öneme sahiptir. CRISPR'nin "çoğullama" yeteneklerinden yararlanan yenilikçi genotipleme stratejileri burada sunulmuştur. Cerrahi işlemler de özetlenmektedir. Birlikte, protokolün aşamaları genin üretilmesini sağlayacaktırImmünoloji, nörobilim, kanser, fizyoloji, gelişim ve diğerleri dahil olmak üzere bir çok araştırma alanı için fare kolonilerinin kurulması için kullanılmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalılarda ve omurgasız hayvanlarda hayvan modelleri, Alzheimer hastalığı 1 , 2 gibi insan koşullarının patofizyolojisini incelemek için bir araç olmuştur. Ayrıca, hastalık düzenleyicileri aramak ve sonuçta tedaviyi umut ederek yeni tedavi stratejileri geliştirmek için paha biçilemez araçlar. Her model özünde sınırlamalara sahip olsa da, hayvanların tüm sistemik modeller olarak kullanılması, biyomedikal araştırmalar için hayati öneme sahiptir. Bunun nedeni, metabolik ve kompleks fizyolojik ortamın doku kültüründe tamamen simüle edilememesi.

Bugüne kadar, fare birçok avantaja sa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler Yeni Güney Galler Hayvan Bakımı ve Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Transgenin Hazırlanması (Rasgele Entegrasyon)

  1. Analitik agaroz jel elektroforezi.
    1. Üreticinin tavsiyelerini izleyerek uygun bir enzim (1 saat inkübasyon) veya hızlı sindirim enzimleri (15 ila 30 dakika inkübasyon) kullanarak transgeni tüketmek için plazmidi özümleyin (bkz. Şekil 2A ve efsanesi).
    2. 0.5-1.0 ug / mL etidyum bromid (EtBr) ile boyanan% 1 tris-asetat-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (TEA) agaroz jeli dökün.
      NOT: EtBr kullanırken dikkatli olun; Bu güçlü bir....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda, rasgele entegrasyon ve CRISPR aracılı gen hedeflemesi durumunda mikroenjeksiyon için iş akışları açıklanmaktadır ( Şekil 1 ).

figure-results-1
Şekil 1: Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretimi için Tipik İş Akışı. Rastgele entegrasyon için, saflaştırılmış transgen, döllenmiş oositlerin pronukleusuna, tıka.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol dahilinde kritik adımlar

Genetiği değiştirilmiş farelerin üretimi teknik açıdan zorlayıcı olarak bilinir. Bununla birlikte, burada sunulan protokol tekniğin rekor düzeyde hakim olmasına ve gidermesine olanak tanıyan optimize edilmiş ve basitleştirilmiş bir yöntemdir. Tekniğin başarılı bir şekilde tamamlanması için iki adım vardır. Birincisi, lineer DNA şablonlarının sentezi (sgRNA'ların sentezi için) magnezyum klorid (MgCl2) olmadan başarılabilir. Bununla birlikte, sistemik olarak .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Yeni Güney Galler Üniversitesi Mark Wainwright Analitik Merkezi aracılığıyla farelerde akademik transgenesis hizmetleri sunmaktadır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, devam eden destekleri için hayvan tesisi personeline (BRC) teşekkür ederler. Bu çalışma Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi ve Avustralya Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikropipet 0.1-2.5 μ LEppendorf4920000016
Mikropipet 2 - 20 & mu; LEppendorf4920000040
Mikropipet 20 - 200 μ LEppendorf4920000067
Mikropipet 100 - 1.000 μ LEppendorf4920000083
Moleküler ağırlık işaretleyicisi BiolineBIO-33025HyperLadder 1 kb
Molekül ağırlığı markörüBiolineBIO-33056HyperLadder 100 bp
AgaroseBiolineBIO-41025
EDTA tamponuSigma-Aldrich9329610x - 1x
Etidyum bromürThermo Fisher Scientific15585011
SYBR Güvenli jel lekesiInvitrogenS33102
Jel ekstraksiyon kitiQiagen28706
PCR saflaştırma kiti (Qiaquick)Qiagen28106
Vakum sistemi (Manifold)PromegaA7231
Nükleaz içermeyen mikroenjeksiyon tamponu MilliporeMR-095-10F
Ultrafree-MC mikrosantrifüj filtresi MilliporeUFC30GV00
Cas9 mRNASigma-AldrichCAS9MRNA
CRISPR eksprese eden plazmit (px330)Addgene42230
Nükleaz içermeyen suSigma-AldrichW4502
Phusion polimerazNew England BiolabsM0530L
T7 Hızlı Yüksek Verimli RNA kitiNew England BiolabsE2050S
RNA saflaştırma spin kolonları (NucAway)Thermo Fisher ScientificAM10070
ssOligosSigma-AldrichOLIGO STANDARD
Donör plazmidiThermo Fisher ScientificGeneArt
HyaluronidazSigma-AldrichH3884
KSOMaa embriyo kültürü ortamıZenith Biotech ZEKS-100
Mineral yağZenith Biotech ZSCO-100
M2 OrtaSigma-AldrichM7167
Sitokalasin BSigma-AldrichC6762
AğızlıkSigma-AldrichA5177
Cam mikro kılcal damarlarSutter AletiBF100-78-10
Proteinaz KAplikesiA3830.0100
Dumont # 5 forsepsGüzel Bilim Araçları 91150-20
İris makasıGüzel Bilim Aletleri 91460-11
Gemi kelepçesiGüzel Bilim Aletleri 18374-43
Yara klipsleri Güzel Bilim Araçları 12040-01
Klips uygulayıcısı Güzel Bilim Araçları 12018-12
Mikro makas Güzel Bilim Araçları 15000-03
KoterizatörGüzel Bilim Aletleri 18000-00
Emilmeyen cerrahi sütürler (Ethilon 3-0)Ethicon1691H
%5 CO2 inkübatörMG ScientificGalaxy 14S
SpektrofotometreThermo Fisher ScientificNanodrop 2000c
ThermocyclerEppendorf6321 000.515
Elektroforez kurulumuBioRad1640300
UV TransilluminatorBioRad1708110EDU
ThermocyclerEppendorf6334000069
Stereoskopik mikroskopOlympusSZX7
Ters mikroskopOlympusIX71
2x MikromanipülatörlerEppendorf5188000.012
Oositler manipülatörEppendorf5176000.025
Mikroenjektör (Femtojet)Eppendorf5247000.013
Fareler C57BL/6J suşuAvustralya BiyokaynaklarıC57BL/6JAusb 
ile seyreltin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
  2. Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetically Modified MiceOocyte MicroinjectionPronuclear InjectionCRISPR Gene TargetingGuide RNA SynthesisDNA PurificationRNA TranscriptionSurgical ReimplantationGenotyping ProceduresFounder Identification

Related Articles