Method Article

Murin Makat Boğazlarında Gap, Sıkı ve Aderans Bağlantılarının Bileşenleri Arasındaki Protein-Protein Etkileşimlerinin ve Ortak Lokalizasyon Analizleri

DOI:

10.3791/55772

⸱

May 30th, 2017

 , 
1INRS, Institut Armand-Frappier, 2Biomed, UQAM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi kavşak, meme bezi aşamasına özgü fonksiyonlar ve gelişim için şarttır. Bu el yazması, protein-protein etkileşimlerinin (PPI'lar) çalışılması ve murin meme bezlerinin birlikte lokalizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu teknikler, farklı gelişim evrelerinde hücre-içi kavşaklar arasındaki fiziksel ilişkinin dinamiklerinin araştırılmasına olanak tanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre-hücre etkileşimleri doku bütünlüğünü ve meme bezinin farklı bölmeleri arasındaki bariyerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Bu etkileşimler, komşu hücreler arasında bağlar oluşturan bağlantılı proteinler tarafından sağlanmaktadır. Junctional protein mislokalizasyonu ve bağlanma partnerleriyle fiziksel birleşmelerin azalması, fonksiyon kaybına ve dolayısıyla organ işlev bozukluğuna neden olabilir. Bu nedenle, normal ve hastalıkla ilişkili dokulardaki protein lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşimlerini (PPI'leri) tanımlamak, gelişme durumundaki hastalıkların veya değişikliklerin ilerlemesine yol açan yeni kanıt ve mekanizmalar bulmak için gereklidir. Bu el yazması, murin meme bezlerinde PPI'ları değerlendirmek için iki aşamalı bir yöntem sunmaktadır. Protokol bölüm 1'de, ilgilenilen proteinlere karşı geliştirilen antikorları, ardından florokromlarla etiketlenmiş ikincil antikorları kullanarak birlikte immünofloresans (co-IF) gerçekleştirmek için bir yöntem anlatılmıştır. Hep birlikte olsa daProteinlerin yakınlığının gösterilmesi için, fiziksel etkileşimlerini incelemeyi mümkün kılar. Bu nedenle, birlikte immüno çökelme (co-IP) için ayrıntılı bir protokol, protokol bölüm 2'de sağlanmaktadır. Bu yöntem, bu etkileşimlerin doğrudan veya dolaylı olup olmadığını teyit etmeden proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri belirlemek için kullanılır. Son birkaç yılda birlikte-IF ve birlikte IP teknikleri, hücrelerarası kavşaklardaki belirli bileşenlerin birlikte nöbetleşip birbirleriyle etkileşimde bulunduğunu ve meme bezi gelişiminde değişen aşamaya bağlı bileşke bağları oluşturduğunu göstermiştir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meme bezi büyüme ve gelişme esas olarak doğumdan sonra gerçekleşir. Bu organ, bir memelinin üreme hayatında kendisini sürekli olarak yeniden şekillendirir 1 . Yetişkin meme bezi epitelyumu luminal epitelyal hücrelerin bir iç tabaka ve esasen miyoepitelyal hücrelerden oluşan, bazal membranla çevrili 2 bir bazal hücre tabakasından oluşur. Meme bezi yapısı ve gelişimiyle ilgili iyi bir inceleme için, okuyucu Sternlicht 1'e başvurabilir. Boşluk (GJ), sıkı (TJ) ve adherens (AJ) kavşakları yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, bezin normal gelişimi ve fonksiyonu için 1 , 3 , 4 , 5 , 6 için gereklidir. Bu fare bağırsağındaki bu kavşakların ana bileşenleri Cx26, Cx30, Cx32 ve Cx43'tür (GJ); Claudin-1, -3, -4 ve -7 veZ0-1 (TJ); Ve E-cadherin, P-kadherin ve β-katenin (AJ) 7,8. Bu farklı jonksiyonel proteinlerin ekspresyon seviyeleri, meme bezi gelişimi esnasında aşamaya bağlı bir şekilde değişir ve farklı hücre-hücre etkileşim gereksinimlerini önermektedir 9 . GJ, TJ ve AJ yapısal ve işlevsel olarak birbirine bağlanır ve diğer yapısal veya düzenleyici proteinleri komşu hücrelere komşu bölgelere bağlarlar ve böylece bir bağlantılı bağ 10 oluştururlar. Bağlantılı bağın bileşimi, alttaki hücre iskeletiyle köprü oluşturmayı, ayrıca bağın geçirgenliğini ve stabilitesini etkileyebilir ve dolayısıyla bezin işlevini etkileyebilir 8 , 9 , 10 , 11 . Bileşik bağlarda bulunan veya diferansiyel olarak birbirleri ile etkileşen hücrelerarası kavşak bileşenleriMeme bezi gelişiminin gelişmekte olan aşamaları, yakın zamanda, birlikte immünfloresans (co-IF) ve birlikte immüno çöktürme (co-IP) 9 kullanılarak analiz edildi. Diğer teknikler, proteinler arasındaki fonksiyonel ilişkinin değerlendirilmesini sağlarken, bu metotlar bu elyazmasında sunulmamaktadır.

Proteinlerin sadece işlev için tek başına hareket etmesi nedeniyle, sinyal transdüksiyonları ve biyokimyasal kaskadlar gibi protein-protein etkileşimlerinin (PPI'lar) çalışılması birçok araştırmacı için çok önemlidir ve proteinlerin fonksiyonu hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Eş-IF ve mikroskobik analiz, aynı hücre altı alanı paylaşan birkaç proteinin değerlendirilmesine yardımcı olur. Bununla birlikte, hedeflerin sayısı, farklı hayvanlarda yetiştirilmesi gereken antikorlarla ve farklı dalga boylu lazerler ve çoklama için bir spektral dedektör ile donatılmış bir konfokal mikroskopa erişimle sınırlandırılmıştır. Co-IP, yüksek afiniteli fiziksel etkileşimleri teyit eder veya ortaya çıkarırBir protein kompleksinde bulunan iki veya daha fazla protein. Eşzamanlı olarak proteinlerin lokalizasyonunu ve etkileşimlerini saptayabilen floresans rezonans enerji transferi (FRET) 12 ve yakınlık ligasyonu deneyi (PLA) 13 gibi yeni teknikler geliştirilmesine rağmen, co-IP, arasındaki karşılıklı etkileşimleri incelemek için uygun ve uygun bir teknik olarak kalmaya devam etmektedir Endojen proteinler.

Bu el yazmasında anlatılan adım adım yöntem, protein lokalizasyonu ve ÜFE'lerin incelenmesini kolaylaştıracak ve meme bezlerinde endojen PPI'ları incelerken kaçınmak için tuzaklara işaret edecektir. Metodoloji, her bir teknik için gerekli olan dokular için farklı koruma prosedürlerinin sunulmasıyla başlar. Bölüm 1, üç aşamalı olarak protein ortak lokalizasyonu üzerinde çalışmayı göstermektedir: i) meme bezlerinin kesitlenmesi, ii) ko-IF tekniği kullanılarak farklı proteinlerin çift veya üçlü etiketlenmesi ve iii)Protein lokalizasyonu. Bölüm 2, endojen bir proteinin çökeltilmesi ve etkileşen proteinlerin üç aşamada nasıl belirleneceğini göstermektedir: i) lizat hazırlama, ii) dolaylı protein immunopresipitasyonu ve iii) SDS-PAGE ve Western blot ile partner tanımlamanın bağlanması. Bu protokolün her basamağı kemirgen meme bezi dokuları için optimize edilmiştir ve yüksek kaliteli, spesifik ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Bu protokol, diğer dokulardaki veya hücre hatlarındaki PPI çalışmalarının başlangıç ​​noktası olarak da kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan protokolleri, Üniversite Hayvan Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada).

1. Proteinlerin birlikte lokalizasyonunu tanımlama

  1. Dokudan mikroskopik slaytlara
    NOT: Dokular ve bölümler kuru buz üzerinde ele alınmalıdır.
    1. Memede bezlerini bir hayvandan tüketin (bu prosedürün tam açıklaması için, Plante ve diğerlerine başvurun). 14 .
    2. Çıkarılan dokuyu dondurma / kurulum ortamında kuru buz üzerine katıştırın. Bezi kapatacak kadar orta ekleyin. Ortam katılaştığında, dokuları daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de bir dondurucuya aktarın 9 .
    3. ≤ -35 ​​° C'de bir cryomicrotome seti kullanarak, dokuları 7-10 μm kalınlıkta kesitlere bölün ve mikroskop lamlarına yerleştirin.
      NOT: Mümkün olduğunda her slayta iki bölüm yerleştirin; Sol bölüm birAntikorların özgüllüğünü ve dokunun otofloresansını doğrulamak için egal kontrol, sağ taraf antikorlarla etiketlenecek.
    4. Daha sonra kullanmak için bölümleri -80 ° C'de tutun.
  2. Co-IF boyama
    1. Dondurucudan uygun mikroskopik slaytları alın ve bölümleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca% 4 formaldehit içine daldırarak hemen sabitleyin.
    2. Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) içine daldırın. Bir sonraki adıma geçinceye kadar plakları RT'de bırakın.
    3. Saydamın her bir bölümünü, piyasada bulunan bir hidrofobik bariyer veya su itici bir laboratuar kalemi kullanarak daire içine alın (bkz . Malzeme Tablosu ). Doku dokunmamaya özen gösterin. Hemen dokuya PBS damlası ekleyin ve sondayı prosedürün geri kalan kısmı için nemli bir histoloji odasına yerleştirin.
      NOT: Doku parçaları nemli kalmalıdır. AlternatifLy, kapaklı bir kutu kullanın ve altına ıslak kağıt havlu koyun.
    4. Her bir doku kesitini oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 100-200 μL% 3 sığır serum albümini (BSA) -Tris tamponlu salin (TBS) -0.1% polisorbat 20 ile bloke edin (Malzeme Listesine bakın ). Numuneler bloke ederken, antikorları TBS-% 0.1 polisorbat 20'de sulandırarak primer ve sekonder antikor solüsyonlarını hazırlayın.
      NOT: Antikor için gereken konsantrasyon üretici tarafından sağlanır; Örnekler için Malzeme Tablosu ve Şekil 1 ve 2'ye ve Dianati ve ark. 9 . Çoğu fluorofor konjuge antikoru kullanırken karanlık ortamda çalışmanız gerekmese de, antikor solüsyonlarını veya lekelenmiş dokuları yoğun, parlak ışığa maruz bırakmaktan kaçının.
    5. Engelleme solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve 100-200 μL seyreltilmiş primer antikor içindeki bölümleri RT'de 60 dakika inkübe edin. Seçenek olarakY, birincil antikor ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    6. Aspire edilerek birincil antikor çözeltisini çıkarın ve bölümleri 5 dakika için 250-500 μL TBS-% 0.1 polisorbat 20 ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve yıkamayı iki kez tekrarlayın.
    7. Yıkama solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve bölümleri oda sıcaklığında 60 dakika boyunca uygun florofor konjuge sekonder antikor ile 100-200 μL inkübe edin.
    8. Aspirasyon ile ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve bölümleri 5 dakika için 250-500 mcL TBS-% 0.1 polisorbat 20 ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu çıkarın ve iki kez tekrarlayın.
    9. İlgili protein (ler) için birincil ve ikincil antikorların uygun birleşimini kullanarak adım 2.5-2.8'yi tekrarlayın.
    10. Yıkama solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve 100-200 μL 1 mg / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile TBS-% 0.1 polisorbat 20'de 5 dakika inkübe ederek çekirdekler boyama işlemini gerçekleştirin.RT.
    11. DAPI özümünü aspirasyonla çıkartın ve slaytları, suda çözünür, fluoresan olmayan bir montaj ortamı ( Malzeme Tablosuna bakın ) ve lamelleri kullanarak monte edin. Her seferinde bir slaydı ilerleyin.
      NOT: Çekirdek lekesini 5 dakikadan fazla inkübe ederek lekelenme yoğunluğu değişmez. Alternatif olarak, tüm slaytlardaki DAPI özümünü çıkarın ve slaytları takarken dokuları PBS'de inkübe edin.
    12. Slaytları 4 ° C'lik bir buzdolabında düz olarak en az 8 saat bekletin. Floresan mikroskopik görüntülemeye devam edin (bakınız Şekil 1 ve 2 ).
  3. Mikroskobik görüntüleme
    1. Floroforlara konjuge sekonder antikorları, spesifik dalga boylarında fluoroforları uyarmak için gereken çeşitli lazerlerle donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak görselleştirin.
      Not: Kanalları ve alveolleri görselleştirmek için sayısal açıklık 0.95 olan 40X objektif önerilir. Bir örnekE, Şekil 1'de verilmiştir .
    2. O zaman bir dalga boyundaki görüntüyü tarayarak her bir proteinin lokalizasyonunu tek tek doğrulayın.
      Not: Bu aşamada, bağlantı proteinlerinin lokalizasyonunu eleştirel olarak analiz etmek önemlidir. Jonksiyonel bağları oluşturabilmek için bu proteinlerin plazma membranında lokalize edilmesi gerekir.
    3. Farklı dalga boylarındaki lazerlerle taranan görüntüleri birleştirerek proteinlerin birlikte lokalizasyonunu belirleyin.
      Not: Protein ko-lokalizasyonu, aynı yerde iki veya daha fazla floroforun emisyonundan kaynaklanan renk değişikliği ile görülebilir ve uygun yazılım kullanılarak ölçülebilir ( Şekil 1 ve 2 ; ayrıca bkz. Referans 9).

2. ÜFE'lerin incelenmesi

NOT: Göğüs bezleri pektoral ile yakın ilişki içindedir, PPI'ları incelemek için abdominal meme bezleri kullanılmalıdırkaslar. Memeler bezlerini ayırın (bu prosedürün tam bir açıklaması için, Plante ve ark.na bakın) 14 ve daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de tutun.

  1. Lisat hazırlama
    1. Tartı kağıdı ve 2 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini bir sonraki adımlara geçmeden önce soğutmak için kuru buz üzerine yerleştirin.
    2. -80 ° C'den meme bezi dokusunu alın ve kuru buzda tutun.
    3. Dokuları önceden soğutulmuş tartım kağıtlarına tartın ve sonra dokuyu 2 mL mikrosantrifüj tüplerine (kuru buz üzerinde tutun) aktarın. Numune başına 50 ila 100 mg arasında doku kullanın. Doku 2.1.5 adıma kadar kuru buzda tutun.
    4. Aşağıdaki formülleri kullanarak, Malzemelerin Tablosunda belirtildiği üzere, NaF, NaVO3 ve proteaz / fosfataz inhibitörü ile takviye edilmiş gerekli üçlü deterjan liziz tamponunu hazırlayın. Fareler: gerekli tampon maddesi (μL) = fare dokusu ağırlığı (mg) x 3; Sıçan: gerekliTampon (μL) = sıçan doku ağırlığı (mg) x 5.
    5. Doku içeren 2 mL'lik tüp içine gereken miktarda buz gibi lizis tamponu (adım 2.1.4'de hesaplanmıştır) ekleyin.
      NOT: Adım 2.1.5-2.1.6'da, aynı anda tek bir boru ile devam edin.
    6. Doku değirmeni üzerinde sürekli homojenleştirme kullanarak dokuyu 30-40 s boyunca homojenize edin; Tüpü daima buzda tutun. Doku homojenleştiricisini orta hıza ayarlayın ve öğütücü tüpün içinde yukarı ve aşağı hareket ettirin.
    7. Diğer tüplerle birlikte 1.6 ve 1.7 adımlarını tekrarlayın.
    8. Lizatları buz üzerinde 10-30 dakika inkübe edin.
    9. Tüpleri 170 xg'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
    10. Bu arada, her numune için 6-10 mikro santrifüj tüpünü (0.6 mL) belirleyin ve buz üzerinde saklayın.
    11. Santrifüj tamamlandıktan sonra tüpleri kontrol edin. Yağların en üst tabakasını, berrak, sarıdan pembe lizatları (gelişme aşamasına bağlı olarak) ve bir pelet içerdiklerinden emin olun.
    12. Lipid tabakasında bir delik açSıvı faza erişmek için 200 μL'lik bir pipet kullanarak. Ucu değiştirin ve pelleti bozmadan veya lipit katmanını aspiremeden lisatı toplayın. Lizatı önceden etiketli tüpler halinde buz üzerinde paylaştırın (adım 2.1.11) ve -80 ° C'de saklayın.
    13. Uygun bir piyasada bulunan kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için bir kısım kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Dolaylı immüno çökelme
    1. Buz üzerinde, daha önce hazırlanan toplam meme bezi lizatlarının iki alikurosunu çözdürün.
      NOT: Hedef proteinin IP'si için bir alikot kullanılırken diğeri negatif kontrol olarak kullanılır.
    2. Her 1,5 mL'lik tüpte 200 μL'lik nihai bir hacme ulaşmak için 500-1,000 μg lizat toplayın ve PBS'de seyreltin.
      NOT: Kullanılacak lisat miktarı, ilgili proteinin bolluğuna ve antikorun etkinliğine bağlıdır (bakınız Şekil 3N örneği ve Malzeme Tablosu ). Her hedef için optimize etmek için, farklı miktarlarda lizat ( örn., 500, 750 ve 1000 μg) ve antikor ( örn., 5, 10 ve 20 μg) kullanılmalıdır. Aşağıdaki adımları uygulayın (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Antijeni ilgi antijenine karşı lizatın ilk tüpüne ekleyin ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Gerekli miktar genellikle her şirket tarafından verilen talimat sayfasında önerilir (Malzeme Tablosuna bakınız ).
    4. İkinci tüpte, adım 2.2.3'te kullanılan antikor ile aynı konsantrasyonda izotip IgG kontrolü ekleyerek negatif bir kontrol hazırlayın.
    5. Tüpleri gece boyunca 4 ° C'de düşük hızda bir tüp makaralı karıştırıcıda inkübe edin.
    6. Ertesi gün, ön yıkama için yeni 1.5 mL tüplere 50 μL manyetik boncuk ekleyin.
      1. Antikora göreceli yakınlık temelinde Protein A veya Protein G manyetik boncuklardan birini seçin.
      2. Birikmiş boncuk kullanmaktan kaçınmak önemlidir; Boncuk süspansiyonunu tüplere eklemeden önce eşit olarak tekrar süspanse edilinceye kadar hafifçe karıştırın.
    7. Boncukları içeren tüpleri manyetik standa yerleştirin ve boncukların mıknatısa geçmesine izin verin. 200 uL'lik bir pipet kullanarak boncuklardan saklama tamponunu çıkarın.
    8. 500 μL PBS-% 0.1 polisorbat 20 ekleyerek boncuk yıkayın ve 10 saniye boyunca şiddetle vorteks tüpleri.
    9. Tüpleri tekrar manyetik standa koyun ve boncukların mıknatısa geçmesine izin verin.
    10. 200 uL'lik bir pipetle pipetle aşırı yıkama tamponunu çıkarın.
    11. Adım 2.2.5'ten gelen reaksiyon kompleksini (lizat-antikor) boncuklara ekleyin ve oda sıcaklığında 90 dakika rulo karıştırıcıda inkübe edin.
    12. Tüpleri manyetik standa yerleştirin ve boncukların mıknatısa geçmesine izin verin. 200 mcL'lik bir pipet kullanarak lisatı aspire edin ve atın ve tüpleri buz üzerine yerleştirin.
    13. Boncuğu yıkaS PBS 500 mcL ekleyerek, manyetik stand tüpler yerleştirerek ve 200 mcL pipet kullanarak sıvı kaldırma. Bu yıkama adımı tekrarlayın. Yıkama basamakları sırasında vorteks oluşumundan kaçının ve örnekleri buzda tutun.
    14. Boncukları bir kez vortekslenmeden PBS-% 0.1 polisorbat 20 ile yıkayın ve 200 μL pipet ucu kullanarak son yıkama tamponunu atın.
    15. Elüte etmek için, tüplere 0.2 M asit glisin (pH = 2.5) 20 uL ekleyin ve silindir mikseri üzerinde 7 dakika boyunca sallayın.
    16. Birkaç saniye yüksek hızda santrifüjleyin (hızlı sıkma) ve süpernatanı taze, buz gibi bir tüp içerisinde toplayın.
    17. Her bir tüp için 2.2.14 ve 2.2.15 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Nihai hacim 40 μL olacaktır.
    18. Adım 2.2.16'dan 40 μL seyreltilmiş numuneye 10 uL 4x Laemmli tamponu ekleyin.
      NOT: Asitik pH nedeniyle renk sarı renge dönecektir.
    19. Hemen adım adım 2.2.18'den çıkan elüsyon örneğine, bir defada bir damla 1 M Tris (pH = 8), renkMaviye dönüyor. Bir sonraki tüplere geçin.
    20. Adım 2.2.18'den 70-90 ° C'de 10 dakika kaynatın. Jel elektroforezine hemen devam edin. Alternatif olarak, numuneleri yükleyene kadar -80 ° C'de bir dondurucuya aktarın.
  3. Aşağı akım uygulaması: jel elektroforezi ardından Western blot
    1. Standart prosedürler izlenerek 15 SDS-PAGE akrilamid jelleri ayırma ve istifleme hazırlayın ( 15 mm kalınlık).
      NOT: Jel seçimi (% 8-15 akrilamid, gradyan: Malzeme Tablosuna bakınız ), çöktürülecek proteinin molekül boyutuna ve analiz edilecek potansiyel bağlanma ortaklarına göre belirlenmelidir. Bu proteinler, uygun bağışıklık tespiti için birbirinden ayrılmalıdır.
    2. İmmünopresipitasyon (IP) ile akıtılmış örnekleri (adım 2.2.20) buz üzerinde çözün.
    3. Aynı numunelerden protein lizatları hazırlayın (yukarıdaki IP prosedürü için kullanılır). 50'yi kullanΜg toplam lizat ilave edin ve 4X Laemmli numune tamponu ilave edin. Numuneleri 70-90 ° C'de 5 dakika kaynatın ve yükleme yapana kadar buz üzerine koyun.
      NOT: Bu numuneler, toplam lisatta çökelen proteinlerin varlığını göstermek için ayrılmış IP örneğinin yanında yüklenecektir.
    4. Adım 2.3.3'ten hazırlanan lizatları ve adım 2.2.20'deki çökelen numuneleri bir akrilamid jeline yükleyin ve akan tamponda (10x akan tampon: 30.3 g Tris, 144.1 g glisin ve 10 G SDS, 1 L damıtılmış su içinde) yaklaşık olarak 95 dakika süreyle 100 V'de veya göç eden proteinlerin kenarı jelin tabanına erişene kadar karıştırın.
    5. Jelleri standart bir protokol 9 , 15 kullanarak bir nitroselüloz veya PVDF zarına aktarın.
    6. Memeyi,% 5 kuru süt-TTBS'de (20 mM Tris, 500 mM NaCl ve% 0.05 polisorbat 20) düşük hızda bir rocker üzerinde 1 saat bloke edin.
    7. Yağışın başarılı olup olmadığını belirleyincessful.
      1. Çökeltilmiş proteine ​​karşı ilk antikoru kullanarak membranı probleyin, üretici tarafından önerilen konsantrasyonda% 5 kuru süt-TTBS'de seyreltin, yavaşça çalkalanarak sallanan bir platformda gece boyunca 4 ° C'de.
        NOT: Öneriler için Malzeme Tablosu'na bakın.
      2. Ertesi gün, membranı yüksek sallanma ile sallanan bir platformda TTBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
      3. Membranı, yavaş çalkalanarak sallanan bir platformda RT'de 1 saat süreyle, TTBS'de seyreltilmiş yaban turbu peroksidazı (HRP) ile konjüge konmuş uygun sekonder antikorda inkübe edin.
        NOT: Alternatif olarak, bir florokrom ile konjuge edilmiş ikincil bir antikor, sinyali algılamak için uygun bir cihaz bulunduğu takdirde kullanılabilir.
      4. Yüksek çalkalamayla sallanan bir platformda TTBS ile, her biri 5 dakika boyunca 3 ila 6 yıkama gerçekleştirin. Memeyi, ticari olarak bir a ile inkübe etmek suretiyle ikincil antikorun sinyalini analiz edin(Bkz . Malzeme Tablosu ) ve üreticinin talimatlarını izleyin. Bir kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak sinyali algılayın (Malzeme Tablosuna bakın ).
        NOT: Western blot analizi ile ilgili ayrıntılı bir protokol için Referans 16'ya bakın.
    8. Etkileşen proteinleri tanımlamak için aynı leke uygun antikorları kullanarak 2.3.7.1-2.3.7.4 adımlarını uygulayın.
      NOT: Proteinler etkileşime giriyorsa, bağlanma ortakları hedef protein ile birlikte immüno-çökeltilmiş olacak ve bu nedenle Western blotlama ile saptanabilecektir. Adım 2.3.8, proteinlerin moleküler ağırlıkları jel ve zar üzerinde iyi ayrılmaya yetecek kadar farklı olduğu sürece, diğer proteinlerin aynı protein kompleksinde bulunup bulunmadığını belirlemek için daha fazla antikorla tekrarlanabilir.
    9. Tanımlanan bağlayıcı ortakların eserler olmadığını doğrulamak için karşılıklı IP yapılmalıdır.
      NOT: Bu,Adım 2.2.1-2.2.20'de aynı lizata sahip olmakla birlikte adım 3.8'de tanımlanan bağlayıcı ortaklardan birini tırmandı. Ardından, adımlar 3.1-3.8, ilgilenilen ilk proteine ​​karşı birincil antikor kullanılarak tekrarlanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GJ, AJ ve TJ bileşenlerinin meme bezinde birlikte etkileşip etkileşip etkileşip değişime uğramayacağını belirlemek için, ilk önce co-IF testleri gerçekleştirildi. Bir GJ protein olan Cx26 ve bir AJ proteini olan β-Catenin, spesifik antikorlarla araştırıldı ve sırasıyla florofor konjuge fare-647 (yeşil, sahte renkler) ve keçi-568 (kırmızı) antikorları kullandıklarını ortaya koydu ( Şekil 1B ve C ) . Veriler, sarı renkli ( Şekil 1D ) yansı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, meme bezi gibi birçok organın düzgün işleyişi ve gelişimi için gereklidir. Araştırmalar junctional proteinlerin birbirlerinin işlev ve istikrarını düzenleyebildiğini ve sinyal iletimini hücre zarı 10'da birbirine bağlayarak aktive edebildiğini göstermiştir. Mevcut el yazmasında sunulan protokoller, normal fare bezi gelişiminde junctional protein diferansiyel ifadesi, lokalizasyonu ve etkileşimi hakkında ilginç bulgular sağlamıştır ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IP, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmektedir (NSERC # 418233-2012); Bir Quebec Meme Kanseri Vakfı kariyer ödülü olan bir Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS) ve Canadian Foundation for Innovation hibe için bir Leader Founds yardımı. ED, Fondation universitaire Armand-Frappier'den bir burs aldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fareler suşu ve evreSt. Constant, Quebec, KanadaC57BL / 6 Femals; hamilelik günü 18 (P18) ve emzirme günü 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stok)1) 80 g NaCl (FW: 58.44), 2 g KCl (FW 74.55), 26.8 g Na2HPO4· çözün; 7H2O (F.W. 268.07) ve 2.4 g KH2PO4 (FW:136.09) 800 mL damıtılmış suda;
2) PH'ı 7.4'e ayarlayın;
3) 1 L son hacme ulaşmak için su ekleyin.
TBS 10x (stok)1) 60,5 g TRIS, 87,6 g NaCl'yi 800 mL damıtılmış suda çözün;
2) pH'ı 7.5'e ayarlayın;
3) 1 L son hacme ulaşmak için su ekleyin.
Bölüm 1: İmmünofloresan
dondurucu ortamVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Kanada95067-840VMR dondurulmuş kesitler bileşiği 
MicrotomeMississauga, ON, Kanada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Kriyostat 115 V 60 Hz
BıçaklarCL Sturkey, Inc. Les Produits  Scientifiques  ESBE  St-Laurent, QC, KanadaBLM1001CYüksek profilli altın kaplamalı bıçaklar
Pap kalemCedarlane, Burlington, ON, Kanada8899Süper PAP Kalem, Thermo fisher bilimsel
Mikroskobik slaytlarFisher Scientific, Burlington, ON, Kanada12-550-15Fisherbrand  Superfrost Plus Mikroskop Slaytları
FormaldehitBioShop Canada Inc, Burlington, ON, KanadaFOR201.1Forlmadehyde
Sığır Serumu Albümini (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, ABD
TBSçözeltisinde
TBS-Tween 20% 0.1
KanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Montaj ortamıCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
Birinci ve ikincil antikorlarHücre Sinyali, Beverly, MA, ABDYorumlara BakınE-Cadherin (4A2) Fare mAb (#14472s) 1/50 (Hücre Sinyali) anti-fare IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Hücre Sinyali 
Birinci ve ikincil antikorlar Yaşam teknolojileri, Waltham, MA, ABD & Hücre Sinyali, Beverly, MA, ABDYorumlara BakınClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Yaşam Teknolojileri) anti-tavşan IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Hücre Sinyalizasyonu) 
Birinci ve ikincil antikorlar Santa Cruz Biyoteknoloji, Inc, Kaliforniya, ABD; Fischer Scientific, Burlington, ON, Kanada Yorumlara bakınβ-Katenin Antikoru (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) ile anti-Keçi IgG (H + L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Moleküler Prob (Fisher Scientific)
Birinci ve ikincil antikorlar Yaşam teknolojileri, Waltham, MA, ABD & Hücre Sinyali, Beverly, MA, ABDYorumlara BakınConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Yaşam Teknolojileri) anti-fare IgG Fab2 Alexa Fluor 647 ile (#4410s) 
Çekirdek lekesiFisher Scientific, Burlington, ON, KanadaD1306DAPI (4 ',6-Diamidino-2-fenilindol, Dihidroklorür) 1/1,000 PBS
Floresan mikroskobuNikon Kanada, Mississauga, On, KanadaSpektral dedektör ile donatılmış Nikon A1R + konfokal mikroskobik lazer 
IF görüntü analizi yazılımıNikon Kanada, Mississauga, On, KanadaNIS elemanları yazılımı (sürüm 4)
Bölüm 2: İmmünopresipitasyon
Üçlü deterjan Lizis tamponu (100  mL) pH=8.01) 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150  karıştırın; mM NaCl (FW: 58.44),% 0.02 Sodyum Azide,% 0.1 SDS,% 1 NONIdET P40,% 0.5 Sodyum Deoksikolat 80 mL damıtılmış H 2< / sub >O.
2) HCl 6  ile pH'ı 8.0'a ayarlayın; N (~0.5  mL).
3) Ses seviyesini 100  mL. Buzdolabında saklayın.
Protein ekstraksiyonu gününde, hesaplanan miktarda 1/100 NaVo3, 1/100 proteaz/fosfataz inhibitörü ve 1/25 NAF kullanın. Üçlü deterjan lizis tamponu:
Sodyum Florür (stok) çözeltisi 1.25 & nbsp; M (F.W.: 41.98), Sodyum Ortovanadat (stok) Çözelti 1  M (F.W.: 183.9)
Proteaz/fosfataz inhibitörüFisher Scientific, Burlington, ON78441Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitörü Kokteyli, EDTA içermeyen (100x)
Protein dozuThermo Scientific, Rockford, Illinois, ABD23225Pierce BCA protein test kiti ve nbsp;
Doku öğütücüFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Model FTH-115
Manyetik boncuklar ve standMillipore, Etobicoke, ON, KanadaPureProteome Protein G Manyetik Boncuk Sistemi (LSKMAGG02)
PBS veya PBS-Tween20 için yıkama solüsyonu Adıma bağlı olarak %0,1
İmmünopresipitasyon için birincil antikorlarHücre Sinyali, Beverly, MA, ABDYorumlara BakınIgG Tavşan (tavşan (DA1E) mAb IgG İzotip kontrolü (#3900s) (Hücre Sinyali) 0.5 &mikro; L/200 ve mikro; L
İmmünopresipitasyon için birincil antikorlarHücre Sinyali, Beverly, MA, ABDYorumlara BakınIgG Fare faresi (G3A1) mAb IgG İzotip kontrolü (#5415s) (Hücre Sinyali) 0.5 & mikro; L/200 ve mikro; L
İmmünopresipitasyon için birincil antikorlarSigma-Aldrich, Oakville, ON, KanadaYorumlara BakınConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4  &mikro; L / 200  &mikro; L
İmmünopresipitasyon için birincil antikorlarHücre Sinyali, Beverly, MA, ABDYorumlara BakınE-kaderin (4A2) Fare mAb (#14472s) (Hücre Sinyali) 1 &mikro; L/200 ve mikro; L
Laemmli tampon BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Kanada16107474x Laemmli Numune Tamponu (Üretici tavsiyesine göre β-merkaptoetanol ekleyin)
Asidik glisin Fisher Scientific, Burlington,PB381-5ÜZERİNDE 0.2 M glisin; pH = 2.5'i HCl ve nbsp ile ayarlayın;
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
SDS-PAGE akrilamid jeller BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1610180 -5TGX Lekesiz FastCast Akrilamid Solüsyonları (%7,8, %10, %12)
Çalışma tamponu 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1704272Tris 30.3  g / glisin 144.1 & g /SDS 10  g in 1 L damıtılmış su
MembranlarıBIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1704272PVDF membranları, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer
Kiti Transfer yöntemiBIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1704155Trans-Blot Turbo Transfer Sistemi
Kuru SütSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, KanadaYağsız Anında Yağsız Süt Tozu, Karanfil
Engelleme çözümü %5 kuru süt TBS-Tween 20 %0.1
Lekelersolüsyonları TBS-Tween 20 %0.1
Lekeler için primer ve ikincil antikorlar (10  mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, KanadaYorumlara BakınConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 IP ikincil antikoru için HRP konjuge Veriblot ile (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Blotlar için birincil ve ikincil antikorlar (10  mL)Hücre Sinyalizasyonu, Beverly, MA, ABD & Abcam, Toronto, ON, KanadaYorumlara BakınE-kaderin (24E10) tavşan mAb 1/1.000 (#3195s) (Hücre Sinyali) 1/1.000 HRP ile konjuge Veriblot ile IP ikincil antikoru (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Lekeler için birincil ve ikincil antikorlar (10  mL)Yaşam teknolojileri, Waltham, MA, ABD & Abcam, Toronto, ON, KanadaYorumlara BakınClaudin-7 (#34-9100) (Yaşam teknolojileri) 1/1.000, IP ikincil antikoru için HRP ile konjuge Veriblot (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Lekeler için birincil ve ikincil antikorlar (10  mL)Yaşam teknolojileri, Waltham, MA, ABD & Abcam, Toronto, ON, KanadaYorumlara BakınClaudin3 (#34-1700) (Yaşam teknolojileri) 1/1.000, IP ikincil antikoru için HRP ile konjuge Veriblot (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Lekelerde sinyal algılama için luminol çözümüBIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1705061Clarity Western ECL Lekeleme Substrat
Görüntüleme lekeleriBIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1708280ChemiDoc MP görüntüleme sistem
Analayzing lekeleriBIO-RAD, Mississauga, ON, KanadaImageLab 5.2 yazılımı 
Yıkama engelleme çözeltisi% 3 BSA Polisorbat 20 Oakville, AÇIK,IP lekeler için yıkama

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074(2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein protein InteractionsCo immunofluorescenceCo immunoprecipitationGap JunctionsTight JunctionsAdherens JunctionsMammary GlandsFluorescence MicroscopyWestern BlotMagnetic Beads

Related Articles