Bu çalışma, kronik lenfositik lösemi (KL) hastalarında farklı şekilde metilasyona uğramış CpG bakımından zengin bölgelerin tanımlanması için optimize edilmiş bir metil-CpG-bağlanma alanı (MBD) sıralama protokolünü ve bir hesaplama hattını açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Kansere karşı uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) rolü, kanser gelişiminde ve ilerlemesinde mekanik işlevlerinin anlaşılmasına olan artan ilgiden ötürü ön plana çıkmaktadır. Buna rağmen, lncRNA'ların global epigenetik düzenlenmesi ve kanserdeki tekrarlayıcı sekanslar, özellikle kronik lenfositik lösemi (CLL) 'de iyi araştırılmamıştır. Bu çalışma, benzersiz bir yaklaşım üzerinde yoğunlaşmaktadır: metil bağlanma alanı (MBD) proteinleri kullanılarak çift sarmallı, metillenmiş DNA fragmanlarının immüno çökeltme bazlı yakalanması, bunu takiben yeni nesil sıralama (MBD-seq). Bu çalışmada iki prognostik alt gruba (5 IGVH mutasyonlu numuneye + 5 IGVH mutasyona uğramamış örnek) ait CLL hasta örnekleri kullanılmıştır. Analiz, normal sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında 5,800 hipermetilatlı ve 12,570 hipometillenmiş CLL-spesifik diferansiyel metillenmiş geni (cllDMGs) ortaya çıkarmıştır. Daha da önemlisi, bu sonuçlar farklı CLL'ye spesifik, farklı şekilde metillenmiş lncRNA'ları tanımladı.Petitive elementleri ve potansiyel prognostik değeri olan protein kodlayan genleri içerir. Bu çalışma, CLL hasta numunelerini kullanarak CpG bakımından zengin bölgelerde küresel metilasyon profillerinin kapsamlı analizi için geliştirilen bir MBD-seq ve biyoinformatik boru hattı için ayrıntılı bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Son olarak, bir protein kodlayıcı gen ve bir lncRNA, MBD-seq protokolünden elde edilen bulguları daha da desteklemek için CpG metilasyon seviyelerini analiz etmek için oldukça nicel bir yöntem olan pirozleme kullanılarak doğrulandı.
Giriş
Küresel DNA metilasyon profillerini analiz etmek için yeni nesil sıralama tekniklerinin kullanılması son yıllarda giderek daha fazla popüler olmuştur. Genetik DNA'nın bisülfit dönüşümü, metilasyona duyarlı kısıtlama enzimi sindirimleri ve metil CpG'ye spesifik antikorlar kullanılarak metilatlanmış DNA'nın immüno-çökeltilmesi, mikroarray ve mikroarray esaslı olmayan yöntemler de dahil olmak üzere genom çapında metilasyon tahlilleri geliştirildi .
Vahşi DNA metilasyonu, lösemi ve lenfomaların, kronik lenfositik lösemi (CLL) de dahil olmak üzere en belirgin özelliklerinden biridir. Daha önceleri, bizimkileri de içeren birkaç grup....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
CLL örneklerini toplamak için etik onay, 2007-05-21 arasında aşağıdaki kayıt numarası ile verilmiştir: EPN Gbg dnr 239/07. Tüm KLL hastalarına yakın zamanda gözden geçirilmiş kriterlere göre tanı konuldu ve örnekler tanı anında toplandı. Çalışmaya katılan hastalar, yazılı izin alındığında İsveç'in batı kesimindeki farklı hematoloji departmanlarından alındı. Bu çalışmada, lümenli hücrelerin yüzdesi ≥% 70 olan sadece CLL periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örnekleri seçilmiştir.
1. Preparatlar
- Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir izolasyon kiti (Malzeme Tablosu'na bakın) kullanarak CLL ve normal, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MBD-seq son zamanlarda CLL hastalarına ve CLL'ye özgü farklı hiper ve metil amilasyonlu genleri tanımlamak için eşleştirilmiş, normal, sağlıklı kontrollere uygulandı. CLL ve normal sağlıklı örneklerden elde edilen verileri analiz etmek için kullanılan deneysel ve biyoenformatik boru hatları Şekil 1A ve 1B'de gösterilmektedir. Bu analizler, kontrol numuneleri ile karşılaştırıldığında IGHV mutasyona uğramış ve IGHV ile değiştirilmemiş .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
MBD-seq, genom çapında kapsamlı kapsama alanı ile metilasyon modellerini incelemek için kullanılabilecek, maliyet etkin, immüno çökeltme tabanlı bir tekniktir. Hem MeDIP sekansı (metilleştirilen DNA immüno çökeltme, ardından dizilim) ve MBD-seq, CpG bakımından zengin metillenmiş DNA'yı zenginleştirir. Bununla birlikte, MBD-seq, MeDIP sekansı 19 ile karşılaştırıldığında yüksek CpG-zengin bölgelerine bağlanma yönünde daha fazla afinite göstermektedir. Bir metil bağlayıcı zenginleştirme kiti kul.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Kanser Topluluğu, Knut ve Alice Wallenberg Vakfı (KAW) ve FoU VästraGötalandsregionen tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dneasy Kan ve doku kiti | Qaigen | 69504 | |
| Lenforep çözeltisi | A X I SS H I E L D | ||
| Nano damla 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE tamponu pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standart sonikasyon cihazı | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tüpleri 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodyum asetat | Diagenode | C03030002 | |
| E-jel iBase güvenli görüntüleyici birleşik kiti | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-jel %2 Agaroz jeller | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Metillenmiş DNA zenginleştirme kiti | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tüp Çalkalayıcı / Döndürücüler | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vorteks karıştırıcı | VWR | 12620-848 | |
| Mutlak Etanol | Herhangi bir şirket | ||
| % 70 Ethanool | Herhangi bir şirket | ||
| DNAse ücretsiz su | Milli Q | ||
| DNA çökeltici (3M sodyum asetat) | Diagenode | C03030002 | |
| Güvenli sızdırmazlık 1,5 mL eppendorf tüpleri | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Test Kiti | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tüpler | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Su Banyo | Hibesi | ||
| Isı bloğu | hibesi | ||
| Tüp döndürücü | Labquake |
Kaynaklar
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
