Yöntem makalesi

Cpf1'i Kullanarak C-Brick DNA Standart Montajı İçin Protokoller

DOI:

10.3791/55775

⸱

15 Haziran 2017

 ,  , 
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR ile ilişkili protein Cpf1, özel olarak tasarlanmış bir CRISPR RNA (crRNA) yardımıyla, istenilen noktalarda çift sarmallı DNA'yı parçalayıp yapışkan uçlar üretebilir. Bu karakteristiğe dayanarak, bir DNA montaj standardı (C-Brick) oluşturuldu ve kullanımını ayrıntılandıran bir protokol burada açıklandı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR ile ilişkili protein Cpf1 çift sarmallı DNA'yı CRISPR RNA'nın (crRNA) rehberliğinde parçalayıp yapışkan uçlar üretir. Bu özellikten dolayı Cpf1, C-Brick adı verilen ve uzun tanıma yerleri ve kısa izlerin avantajına sahip bir DNA montaj standardının oluşturulması için kullanılmıştır. Standart bir C-Tuğla vektöründe, dört Cpf1 tanıma bölgesi vardır - ön ek (T1 ve T2 siteleri) ve son ek (T3 ve T4 bölgeleri) - biyolojik DNA parçalarını çevreleyen. T2 ve T3 bölgelerinin bölünmesi tamamlayıcı yapışkan uçlar üretir ve bu da T2 ve T3 bölgeleriyle DNA parçalarının birleştirilmesini sağlar. Bu arada, montajdan sonra parçalar arasında kısa bir "GGATCC" skarı meydana gelir. Yeni oluşturulan plazmid dört kez Cpf1 bölünme yerini bir kez daha içerdiğinden yöntem, DNA parçalarının yinelenen montajını sağlar ve bu da, BioBrick ve BglBrick standartlarına benzer. DNA parçalarını bir araya getirmek için C-Brick standardının kullanımını özetleyen bir prosedürBurada açıklanmaktadır. C-Brick standardı, bilim adamları, lisansüstü öğrenciler ve lisans öğrencileri ve hatta amatörler tarafından yaygın bir şekilde kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA biyolojik parçalarının standardizasyonu sentetik biyolojinin gelişimi için önemlidir 1 . Bir DNA montaj prosedürünün geliştirilmesi, geçici test tasarımlarının yerini alabilir ve genetik bileşenlerin daha büyük sistemlere montajı sırasında ortaya çıkan beklenmedik sonuçların çoğunu kaldırabilir. BioBrick standardı (BBF RFC 10), önerilen en erken DNA montaj standartlarından biriydi. Önek dizisini (EcoRI ve Xbal kesim bölgeleri içeren) ve son ekleme dizisini (SpeI ve PstI kesme bölgelerini içeren) 2 , 3 kullanır . XbaI ve SpeI'nin birbirine tamamlayıcı uçları olduğu için....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. crRNA'nın hazırlanması

  1. CrRNA şablonlarının hazırlanması
    1. Tekli oligonükleotidleri ( Tablo 1 ) RNaz içermeyen suda 10 uM'lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin.
    2. 22.5 uL üst şeritli oligonükleotid ( Tablo 1'de T7-F), 22.5 uL alt-şeritli oligonükleotid ( Tablo 1 ) ve 5 uL 10x tavlama tamponu 0.2 mL PCR tüpüne ilave edin. Toplam hacmin 50 μL olduğundan emin olun.
      NOT: Altı farklı alt zincirli oligonükleotidler Tablo 1'de gösterilmiştir, bunların her biri ayrı ayrı üst iplikçikli T7-F ile eşleştirilmelidir. Tablo 1....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, üç kromoprotein kasetinin (cjBlue (BBa_K592011), red (BBa_K592012) ve amilGFP'nin (BBa_K592010) montajını gösterdi. Birincisi, yukarıda bahsedilen üç genin ve sonlandırıcıların kodlama dizileri ayrı ayrı bir C-Brick standart vektörüne klonlanmıştır. Kısa DNA kısımları, promotör ve terminatör, 5 'terminalindeki kısa DNA kısımlarını içeren primerler kullanılarak PCR amplifikasyonuyla C-Brick vektörüne sokuldu. Bunu self-ligasyon yöntemi izledi. Üç kromoprotein kodlayan sekans .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol DNA montaj standardı C-Brick için bir prosedürü açıklamaktadır. Bu protokolün en önemli adımı, C-Brick standart vektörünün doğrusallaştırılmasıdır; Vektörün tamamlanmamış bölünmesi başarı oranını ciddi şekilde etkileyebilir. Buna ek olarak, Cpf1 esas olarak "18-23" bölünme paterninde hedef DNA sekanslarını parçalasa da, DNA toplanmasından sonra az sayıda mutasyona neden olabilecek iki baz yakınındaki yanlişlı bölünme 4 de tespit edilmiştir4. Bu nedenle, Sanger dizilemesi, bi.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C-Tuğla standardının geliştirilmesi sırasında teknik yardımları için Shanghai Tolo Biotech'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Çin Bilimler Akademisinin Stratejik Öncelik Araştırma Programından hibelerle desteklenmiştir (Grund No XDB19040200).

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ticari OligonükleotidSangon Biotech
10x Taq PCR TamponTransgen#J40928
Ultra Saf Damıtılmış SuInvitrogen10977-015
5x RNA Transkripsiyon TamponuThermo ScientificK0441
T7 RNA polimerazThermo Scientific#EP0111
NTP karışımıSangon#ND0056
RRI (Rekombinant RNaz İnhibitörü)Takara2313A
RNA Temiz ve Konsantratör-5Zymo ResearchR1015
UV-Vis SpektrometresiThermo ScientificNano-Drop 2000c
2x Phanta Max TamponVazymePB505PCR tamponu
dNTP'lerTransgenAD101
Phanta Max Süper Sadakat DNA PolimerazVazymeP505-d1
Tek Adımlı Klonlama Tolobio için Ezmax24303-1dikişsiz montaj kiti
Ezmax Tek Adımlı Klonlama için 5x TamponTolobio32006
BamHINEB#R0136L
BamHI-HFNEB#R3136L
BglII NEB#R0144L
XbaINEB#R0145L
SpeINEB#R3133L
10x Tampon 3NEB#B7003S
10x CutSmart TamponNEBB7204S
10x T4 DNA ligaz TamponuTolobio32002
T4 PNKTolobio32206
T4 DNA ligazTolobio32210
DpnINEB#R01762
SV Jel ve PCR temizleme sistemiPromegaA9282
Plazmid Mini Kit IOmegaD6943-02plazmit hazırlama kiti
ısıya duyarlı alkalin fosfataz Thermo Scientific#EF0651FastAP
10x Cpf1 tamponuTolobio32008
Cpf1Tolobio32105FnCpf1
termodöngüleyiciUygulamalı Biyosistemlerveriti 96 kuyulu
C-Tuğla standart vektörTolobio98101
E. coli [DH10B]Canlandırıcı18297010
Luria-Bertani ortamı (tripton)OxoidLP0042
Luria-Bertani ortamı (maya özütü)OxoidLP0021
Luria-Bertani ortamı (NaCl)Sangon BiotechB126BA0007

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C Brick StandardCpf1 AssemblyDNA Part AssemblyCRISPR RNASeamless AssemblyVector DigestionChromoprotein CassettesPlasmid PreparationSanger SequencingChemical Transformation

İlgili makaleler