Yöntem makalesi

Cpf1'i Kullanarak C-Brick DNA Standart Montajı İçin Protokoller

DOI:

10.3791/55775

⸱

15 Haziran 2017

 ,  , 
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR ile ilişkili protein Cpf1, özel olarak tasarlanmış bir CRISPR RNA (crRNA) yardımıyla, istenilen noktalarda çift sarmallı DNA'yı parçalayıp yapışkan uçlar üretebilir. Bu karakteristiğe dayanarak, bir DNA montaj standardı (C-Brick) oluşturuldu ve kullanımını ayrıntılandıran bir protokol burada açıklandı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR ile ilişkili protein Cpf1 çift sarmallı DNA'yı CRISPR RNA'nın (crRNA) rehberliğinde parçalayıp yapışkan uçlar üretir. Bu özellikten dolayı Cpf1, C-Brick adı verilen ve uzun tanıma yerleri ve kısa izlerin avantajına sahip bir DNA montaj standardının oluşturulması için kullanılmıştır. Standart bir C-Tuğla vektöründe, dört Cpf1 tanıma bölgesi vardır - ön ek (T1 ve T2 siteleri) ve son ek (T3 ve T4 bölgeleri) - biyolojik DNA parçalarını çevreleyen. T2 ve T3 bölgelerinin bölünmesi tamamlayıcı yapışkan uçlar üretir ve bu da T2 ve T3 bölgeleriyle DNA parçalarının birleştirilmesini sağlar. Bu arada, montajdan sonra parçalar arasında kısa bir "GGATCC" skarı meydana gelir. Yeni oluşturulan plazmid dört kez Cpf1 bölünme yerini bir kez daha içerdiğinden yöntem, DNA parçalarının yinelenen montajını sağlar ve bu da, BioBrick ve BglBrick standartlarına benzer. DNA parçalarını bir araya getirmek için C-Brick standardının kullanımını özetleyen bir prosedürBurada açıklanmaktadır. C-Brick standardı, bilim adamları, lisansüstü öğrenciler ve lisans öğrencileri ve hatta amatörler tarafından yaygın bir şekilde kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA biyolojik parçalarının standardizasyonu sentetik biyolojinin gelişimi için önemlidir 1 . Bir DNA montaj prosedürünün geliştirilmesi, geçici test tasarımlarının yerini alabilir ve genetik bileşenlerin daha büyük sistemlere montajı sırasında ortaya çıkan beklenmedik sonuçların çoğunu kaldırabilir. BioBrick standardı (BBF RFC 10), önerilen en erken DNA montaj standartlarından biriydi. Önek dizisini (EcoRI ve Xbal kesim bölgeleri içeren) ve son ekleme dizisini (SpeI ve PstI kesme bölgelerini içeren) 2 , 3 kullanır . XbaI ve SpeI'nin birbirine tamamlayıcı uçları olduğu için, XbaI ve SpeI ile kesilen BioBrick DNA parçaları, tekrar tekrar montaj için yeni bir BioBrick üretecek şekilde birleştirilebilir.

Bazı kusurlar, BioBrick standardı 4 kullanılarak tanımlanmıştır. Örneğin, 8 bp'lik bir skar üretirFüzyon proteinlerinin inşasına izin vermeyen DNA parçaları arasında. Ayrıca, yukarıda sözü edilen dört 6-bp kısıtlama sahası türü DNA parçalardan çıkarılmalıdır; bu çok rahatsız edicidir. İlk problemi çözmek için BglBrick standardı kuruldu 5 . Gly-Ser üreten ve çoklu proteinlerin veya protein alanlarının kaynaşmasına izin veren 6 bp "GGATCT" skarını oluşturur. IBrick, ikinci problemle başa çıkmak için geliştirildi 6 . Uzun DNA sekanslarını tanıyan homojenleştirme endonükleazları (HE) kullanır. HE tanıma siteleri nadiren doğal DNA dizilerinde mevcut olduğundan, iBrick standardı, DNA dizilerini değiştirmeden iBrick parçalarının doğrudan yapımı için kullanılabilir. Bununla birlikte, iBrick standardı DNA parçaları arasında 21 bp'lik bir skar bırakır ve bu da onun hoşnutsuzluğunun nedeni olabilir.

Son yıllarda kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) sistemi hızla gelişti 7 , 8 . CRISPR ile ilişkili (Cas) proteinler arasında, Streptococcus pyogenes'ten Cas9 endonuclease şimdi yaygın olarak kullanılmaktadır . Çoğunlukla künt uçları olan çift sarmal DNA kopmaları (DSB'ler) getirir 9 .

2015'te Zhang ve arkadaşları, Cpf1'i ( Prevotella ve Francisella 1'den CRISPR) ilk kez karakterize etti . Sınıf 2 tip V CRISPR-Cas sistemine aittir ve bir CRISRP RNA (crRNA) rehberli endonükleaz 10'dur . Cas9'un aksine, Cpf1, 4 veya 5 nt 5 'çıkıntı 10 içeren bir DSB'yi sunar. Bu özelliğe dayanarak Cpf1, bir DNA montaj standardı olan C-Brick 4'ü geliştirmek için kullanıldı. Bir C-Tuğla standart vektöründe, ön ek T1 / T2'nin ve bitişik T3 / T4'ün dört Cpf1 hedef bölgesi biyolojik kısımlara kenetlenir; Bu, BioBrick standardına benzer. T2 ve T3 bölmelerinin bölünmesi pTamamlayıcı yapışkan uçları geliştirir, parçaların arasına bir "GGATCC" yara üretirken DNA bölümlerinin yinelemeli montajını gerçekleştirmek mümkündür. Özellikle, C-Brick standardının iki ana avantajı vardır: uzun hedef sekansları tanımak ve kısa izleri bırakmak. C-Brick tarafından üretilen 6 bp'lik "GGATCC" skar, füzyon proteinlerinin oluşturulmasına izin veren Gly-Seriyi kodlar. Ayrıca, C-Brick standardı da kısmen BglBrick ve BioBrick standartlarıyla uyumludur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. crRNA'nın hazırlanması

  1. CrRNA şablonlarının hazırlanması
    1. Tekli oligonükleotidleri ( Tablo 1 ) RNaz içermeyen suda 10 uM'lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin.
    2. 22.5 uL üst şeritli oligonükleotid ( Tablo 1'de T7-F), 22.5 uL alt-şeritli oligonükleotid ( Tablo 1 ) ve 5 uL 10x tavlama tamponu 0.2 mL PCR tüpüne ilave edin. Toplam hacmin 50 μL olduğundan emin olun.
      NOT: Altı farklı alt zincirli oligonükleotidler Tablo 1'de gösterilmiştir, bunların her biri ayrı ayrı üst iplikçikli T7-F ile eşleştirilmelidir. Tablo 1'deki küçük harfler, crRNA'nın rehber dizisine transkribe edilecek sekansı temsil etmektedir. 10x Taq PCR tamponu, 10x tavlama tamponunun yerine kullanılabilir.
    3. PCR tüpünü bir termostatöre yerleştirin.
    4. Tavlama programını çalıştırın: İlk denatürasyon için 95 ° C'de5 dakika sonra 95-20 ° C arasında bir cooldown, termosiklörde dakikada 1 ° C düşüş.
      NOT: Adımları derhal adım 1.2.1 için kullanın.
  2. CrRNA'nın transkripsiyonu ve saflaştırılması
    1. RNaz içermeyen suya 38 μL, adım 1.1.4'deki şablondan 8 μL, 5x T7 transkripsiyon tamponu 20 uL, NTP karışımından (10 uM) 20 μL, rekombinant RNaz inhibitöründen (RRI) 4 μL ve 10 μM ML T7 RNA polimeraz'dan 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. Toplam hacmin 100 μL olduğundan emin olun.
    2. Mikrosantrifüj tüpünü bir gece boyunca (yaklaşık 16 saat boyunca) 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
    3. Transkribe RNA'yı arındırmak için bir RNA temizleme ve konsantrasyon kiti kullanın; Üreticinin protokolünü izleyin.
    4. RNA'ları UV-Vis spektrofotometreleri ile ölçün ve RNA'yı 10 uM'lik bir konsantrasyona kadar sulandırın. Numuneleri derhal kullanın veya -80 ° C'de saklayın.
      NOT: crRNA dizisiS Tablo 2'de listelenmiştir .

2. C-Tuğla Parçalarının Yapımı ( yani, Biyolojik Parçaların C-Tuğla Standart Vektörüne Yerleştirilmesi)

NOT: Bu adımın üç alt aşaması vardır. Kısa biyolojik kısımlar ( örn. Promoterler ve sonlandırıcılar) için biyolojik parçaları C-Brick standart vektör 4'e eklemek için doğrudan PCR yöntemini kullanmak en iyisidir. Bütün vektör sekansı ek veride gösterilir ve önek ve son ek sırası Şekil 1'de gösterilmiştir (aşama 2.1, aşağıda). PCR ile kolaylıkla elde edilebilen biyolojik kısımlar için ( örn., Genomik DNA şablonları, plazmidler veya yeni sentezlenmiş DNA dizileri), biyolojik parçaları bir C-Brick standart vektörüne eklemek için kesintisiz montaj yöntemini kullanmak en iyisidir (Aşama 2.2, aşağıda). BioBrick ve BglBrick standartlarından edinilen parçalar için sınırlamaEnzim aracılı sindirim ve T4 DNA ligaz aracılı ligasyon biyolojik parçaları bir C-Brick standart vektörüne yerleştirmek için kullanılabilir (aşama 2.3, aşağıda).

  1. Doğrudan PCR amplifikasyonu ile yapı
    1. PCR amplifikasyonu için oligonükleotitler dizayn ve sipariş etmek.
      NOT: Oligonükleotitin 5'-ucu, DNA bölümünün dizisini içerir ve oligonükleotitin 3 'ucu, vektör dizisini ( yani, ileri bandın 3' ucunda "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" ve "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" Ters yörede). Oligonükleotitin 5'-ucunda çıkıntı veya ~ 20 bp çıkıntı tasarlanamaz. Spesifik örnekler daha önceki bir çalışmada bulunabilir 4 .
    2. 10 uM'lik bir konsantrasyona kadar ultra saf su içindeki tek tek oligonükleotitleri yeniden süspanse edin.
    3. 0.2 mL'lik bir PCR tüpünde buz üzerinde PCR reaksiyonları oluşturun: 18 μL ultra saf su ekleyin, 25 μL 2x PCR tamponu, adım 2.1.2'den ileri ve geri primerlerden her biri 2.5 uL (10 uM), şablon olarak 0.5 uL C-Brick standart vektörü (50 ng) ve 0.5 uL'lik bir şablon olarak dNTP'lerin (10 uM) Yüksek doğrulukta DNA polimerazın Toplam hacmin 50 μL olduğundan emin olun.
    4. Tüpü doğrudan bir termosiklleye yerleştirin ve termosiklör programını çalıştırın. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
    5. Thermocycler programı: 98 ° C'de 3 dakika süreyle bir devir; 98 ° C'de 10 saniye, 55 ° C'de 20 saniye ve 72 ° C'de 2 dakika için otuz döngü; Ve 72 ° C'de 10 dakika boyunca bir döngü. Numuneyi 16 ° C'de tutun.
    6. Adım 2.1.4'ten 9 μL karışım 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ilave edilir.
    7. 1 uL DpnI ekleyin ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat inkübe edin.
      NOT: Primerler üst üste binen sekanslara sahip değillerse 0.5 μL T4 polinükleotid kinaz (PNK) ve 0.5 μL T4 DNA ligaz ekleyin ve1 saat boyunca 22 ° C su banyosu. Aksi takdirde, primerler ~ 20 nt örtüşen diziyi içeriyorsa, doğrudan DpnI ile işleme tabi tutulan ürünleri E. coli (DH10B) -kompetent hücrelere dönüştürün (basamak 2.4). Doğrusallaştırılmış PCR ürünü konakçıdaki rekombinasyon sistemi ile dairesize hale getirilecektir.
    8. Numuneleri hemen kullanın veya -20 ° C'de saklayın.
  2. Dikişsiz montaj ile inşaat
    1. PCR amplifikasyonu için oligonükleotitler dizayn ve sipariş etmek.
      NOT: Oligonükleotitin 3'-ucu, DNA bölümünün terminal dizisini içerir ve oligonükleotitin 5'-ucu, doğrusallaştırılmış C-Brick standart vektör dizisinin terminalini içerir ( yani, 5 'için standart olarak kullanılan "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" İleriye doğru ipliğin ucunu ve "CGAGCTAGAGACTAGTGGCCT" ters iplikçikinin 5'-ucu için). Spesifik örnekler daha önceki bir çalışmada bulunabilir 4 .
    2. Bireyi yeniden askıya alUltra saf sularda 10 uM konsantrasyona kadar ual oligonükleotitler.
    3. 0.2 mL'lik bir PCR tüpünde buz üzerinde PCR reaksiyonlarını ayarlayın: ultra saf su, 25 μL 2x PCR tamponu, 1 μL dNTPs (10 μM), 2.5 μL ileri ve geri primerlerin her biri (10 μM ), Adım 2.2.2, 0.5 uL şablon (20-500 ng) ve 0.5 uL yüksek-sadakat DNA polimeraz'dan hazırlandı. Toplam hacmin 50 μL olduğundan emin olun.
    4. Tüpü doğrudan termosiklleye yerleştirin ve termosiklör programını çalıştırın. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Thermocycler programını şu şekilde ayarlayın: 98 ° C'de 3 dakika süreyle bir devir; 98 ° C'de 10 saniye, 55 ° C'de 20 saniye sonra (primerin tavlama sıcaklığına göre) 30 döngü ve 72 ° C'de 1 dakika (biyolojik parçaların uzunluğuna göre) 30 döngü; Ve 72 ° C'de 10 dakika boyunca bir döngü. Numuneyi 16 ° C'de tutun.
    5. Bir PCR temizleme sistemi kullanarak PCR ürününü arıtınTem kiti; Üreticinin protokolünü izleyin.
    6. C-Brick standart vektörünü BamHI ile sindirin: 34 μL ultra saf su, 10 μL plazmid (1 μg), 5 μL 10x tampon ve 1 μL BamHI'yi mikrosantrifüj tüpüne ilave edin. Su banyosunda 37 ° C'de 2 saate kadar inkübe edin.
    7. Bir jel temizleme sistemi kiti kullanarak yukarıdaki ürünü arındırın; Üreticinin protokolünü izleyin.
    8. Adım 2.2.7'den 2 mcL doğrusallaştırılmış vektör (50 ng), adım 2.2.4'ten 5 uL parça (200 ng), 5x kesintisiz montaj tamponu 2 mcL ve kesintisiz montaj kitinden 1 μL kesintisiz montaj enzimi ekleyin. 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne uygulayın. Toplam hacmin 10 mcL olduğunu kontrol edin.
    9. Bunu 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
  3. Restriksiyon enzim aracılı sindirim ve T4 DNA ligaz aracılı ligasyon yoluyla yapı.
    NOT: BioBrick (basamak 2.3.4-2.3.7) ve BglBrick (basamak 2.3.1-2.3.3) standartlarından elde edilen parçalar için kısıtlama enzimi aracılı sindirim ve T4 DNA ligaz aracılı ligasyon, Biyolojik parçaları bir C-Tuğla standart vektörüne dönüştürür.
    1. BamHI ve BglII ile BglBrick standart parçalarını sindirin: 34 μL ultra saf su, 10 μl plazmid (2 μg), 5 μL 10x tampon 3, 0.5 μL BamHI ve 0.5 μL BglII'yi mikrosantrifüj tüpüne ilave edin. 37 ° C su banyosunda 2 saat inkübe edin.
    2. % 1 agaroz jel elektroforezi çalıştırın ve bir jel temizleme sistemi kiti kullanarak fragmanı arındırın.
    3. Parçayı ve C-Brick standart vektörünü ligate edin: Adım 2.1.12'den doğrusallaştırılmış vektörün (50 ng) 2 mL ve adım 2.3.3'ten 6 uL parça (200 ng) 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. 1 uL 10 x T4 DNA ligaz tamponu ve 1 μL T4 DNA ligaz ekleyin. 22 ° C'de 2 saat inkübe edin. Numuneleri derhal kullanın veya buz özütüE -20 ° C'de saklayın.
    4. XbaI ve SpeI ile BioBrick standart parçalarını sindirin: 34 μL ultra saf su, 10 μL plazmid (2 μg), 5 μL 10x tampon, 0.5 μL Xbal ve 0.5 μL SpeI mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. 37 ° C su banyosunda 2 saat inkübe edin.
    5. C-Brick standart vektörünü XbaI ve SpeI ile sindirin: 34 μL ultra saf su, 10 μL plazmid (1 μg), 5 μL 10x tampon, 0.5 μL Xbal ve 0.5 μL SpeI mikrosantrifüj tüpüne ekleyin . 37 ° C su banyosunda 2 saat inkübe edin.
    6. % 1 agaroz jel elektroforezi çalıştırın ve safha 2.3.4 adımından ve adım 2.5.5'deki doğrusallaştırılmış vektörü jel temizleme sistemi kitiyle saflaştırın; Üreticinin protokolünü izleyerek.
    7. Parçayı ve C-Brick vektörünü ligate edin: Adım 2.3.5'den 2 mcL doğrusallaştırılmış vektör (50 ng) ve adım 2.3.4'ten 6 uL parça (200 ng) 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. ilanD 1 uL 10x T4 DNA ligaz tamponu ve 1 uL T4 DNA ligazı. 22 ° C'de 2 saat inkübe edin. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
  4. E. coli'nin yetkili hücrelerine (DH10B) kimyasal transformasyon için adım 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 veya 2.3.7'den 10 uL ürün ekleyin.
  5. Birkaç klonu 5 mL sıvı Luria-Bertani (LB) tüpü içine alın ve gece boyunca çalkalayıcıda (220 rpm) 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Bir plazmid hazırlama kiti kullanarak plazmid ayıklayın; Üreticinin protokolünü izleyin.
  7. Sanger dizilemesi ile doğru klonları tanımlayın 11 .

3. C-Tuğla Montajı ( Şekil 2 )

  1. C-Brick vektörünün Cpf1 ile sindirimi
    1. 22.5 uL RNaz içermeyen su, 4 μL 10x Cpf1 tamponu, adım 2.6'dan (1 μg) plazmidden 10 μL, RRI'nin 0.5 μL'si ve 1 μl# 181; L Cpfl'den (5 uM) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne.
      NOT: Cpf1 ticari olarak satın alınabilir veya önceki bir çalışmada protokolden sonra saflaştırılabilir 4 .
    2. T1 ve T2 bölgelerine yabancı bir DNA parçası eklemek için, 1 μL crRNA-T2 (10 uM) ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosunda inkübe edin. Bir dd 1 μL crRNA-T1 (10 uM) ve Cpfl (5 uM) 30 dakika daha.
      NOT: Alternatif olarak, T3 ve T4 bölgelerine yabancı bir DNA parçası eklemek için 1 μL crRNA-T3 (10 uM) ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosunda inkübe edin. Başka bir 30 dakika boyunca 1 μL crRNA-T4 (10 uM) ekleyin.
    3. 1 μL termal duyarlı alkalin fosfataz ekleyin ve tüp 37 ° C su banyosunda 1 saat daha inkübe edin.
    4. Bir agaroz jel elektroforezi çalıştırın ve bir jel temizleme sistemi kiti kullanarak vektörü arındırın. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
  2. DNA parçasının Cpfl ile sindirimi
    1. RNase içermeyen 21.5 μL su, 4 μL 10x Cpf1 tamponu, adım 2.6'dan (2 μg) plazmid 10 μL, RRI 0.5 μL ve Cpf1'den (5 μM) 2 mL Tl 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
    2. T1 ve T2 bölgeleri içine yabancı bir DNA parçası eklemek için, 1 μL crRNA-T1 (10 μM) ve 1 μL crRNA-T3 (10 μM) ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat su banyosunda inkübe edin.
      NOT: Alternatif olarak, 1 μL crRNA-T2 (10 μM) ve 1 μL crRNA-T4 (10 μM) ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat su banyosunda inkübe edin.
    3. Bir agaroz jel elektroforez çalıştırın ve bir jel temizleme sistemi kiti kullanarak parça saflaştırmak. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
  3. C-Tuğla montajı ve ileri doğrulama
    1. Yabancı DNA parçasını ve C-Brick vektörünü ligatlayın: 2 μL doğrusal vektörü ekleyin (50 ng) adım 3.1.4'ten ve 6 mcL DNA fragmanı (200 ng) adım 3.2.3'ten 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarılmıştır. 1 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu ve 1 μL T4 DNA ligaz ekleyin. 22 ° C'de 2 saat inkübe edin. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
    2. E. coli (DH10B) -erkentent hücrelere kimyasal transformasyon için 10 μL ligasyon ürünlerini (adım 3.3.1) ekleyin.
    3. 5 mL'lik bir sıvı LB tüpüne birkaç klon ekleyin ve gece boyunca 220 rpm ve 37 ° C'de çalkalayıcıda inkübe edin.
    4. Bir plazmid hazırlama kiti kullanarak plazmid ayıklayın; Üreticinin protokolünü izleyin.
    5. Sanger dizilemesi ile doğru klonları tanımlayın 11 .
  4. C-Tuğla montajının yeni turunu yapın. Adım 3.3.4'teki doğru klonlar, adım 3.1-3.3'teki aynı protokol izlenerek, tekrar tekrar C-Brick montajı için yeni bir C-Tuğla vektörü veya DNA parçası olarak kullanılabilir.
    NOT: T2 've T3'ünItes, T2 ve T3 bölgelerinin yedeği olarak tasarlanmıştır ( Şekil 1a ). Adım 2.3.7'den elde edilen plasmidler için, sadece C-Tuğla standart montajı için T2 've T3' kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, üç kromoprotein kasetinin (cjBlue (BBa_K592011), red (BBa_K592012) ve amilGFP'nin (BBa_K592010) montajını gösterdi. Birincisi, yukarıda bahsedilen üç genin ve sonlandırıcıların kodlama dizileri ayrı ayrı bir C-Brick standart vektörüne klonlanmıştır. Kısa DNA kısımları, promotör ve terminatör, 5 'terminalindeki kısa DNA kısımlarını içeren primerler kullanılarak PCR amplifikasyonuyla C-Brick vektörüne sokuldu. Bunu self-ligasyon yöntemi izledi. Üç kromoprotein kodlayan sekans ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol DNA montaj standardı C-Brick için bir prosedürü açıklamaktadır. Bu protokolün en önemli adımı, C-Brick standart vektörünün doğrusallaştırılmasıdır; Vektörün tamamlanmamış bölünmesi başarı oranını ciddi şekilde etkileyebilir. Buna ek olarak, Cpf1 esas olarak "18-23" bölünme paterninde hedef DNA sekanslarını parçalasa da, DNA toplanmasından sonra az sayıda mutasyona neden olabilecek iki baz yakınındaki yanlişlı bölünme 4 de tespit edilmiştir4. Bu nedenle, Sanger dizilemesi, bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C-Tuğla standardının geliştirilmesi sırasında teknik yardımları için Shanghai Tolo Biotech'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Çin Bilimler Akademisinin Stratejik Öncelik Araştırma Programından hibelerle desteklenmiştir (Grund No XDB19040200).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ticari OligonükleotidSangon Biotech
10x Taq PCR TamponTransgen#J40928
Ultra Saf Damıtılmış SuInvitrogen10977-015
5x RNA Transkripsiyon TamponuThermo ScientificK0441
T7 RNA polimerazThermo Scientific#EP0111
NTP karışımıSangon#ND0056
RRI (Rekombinant RNaz İnhibitörü)Takara2313A
RNA Temiz ve Konsantratör-5Zymo ResearchR1015
UV-Vis SpektrometresiThermo ScientificNano-Drop 2000c
2x Phanta Max TamponVazymePB505PCR tamponu
dNTP'lerTransgenAD101
Phanta Max Süper Sadakat DNA PolimerazVazymeP505-d1
Tek Adımlı Klonlama Tolobio için Ezmax24303-1dikişsiz montaj kiti
Ezmax Tek Adımlı Klonlama için 5x TamponTolobio32006
BamHINEB#R0136L
BamHI-HFNEB#R3136L
BglII NEB#R0144L
XbaINEB#R0145L
SpeINEB#R3133L
10x Tampon 3NEB#B7003S
10x CutSmart TamponNEBB7204S
10x T4 DNA ligaz TamponuTolobio32002
T4 PNKTolobio32206
T4 DNA ligazTolobio32210
DpnINEB#R01762
SV Jel ve PCR temizleme sistemiPromegaA9282
Plazmid Mini Kit IOmegaD6943-02plazmit hazırlama kiti
ısıya duyarlı alkalin fosfataz Thermo Scientific#EF0651FastAP
10x Cpf1 tamponuTolobio32008
Cpf1Tolobio32105FnCpf1
termodöngüleyiciUygulamalı Biyosistemlerveriti 96 kuyulu
C-Tuğla standart vektörTolobio98101
E. coli [DH10B]Canlandırıcı18297010
Luria-Bertani ortamı (tripton)OxoidLP0042
Luria-Bertani ortamı (maya özütü)OxoidLP0021
Luria-Bertani ortamı (NaCl)Sangon BiotechB126BA0007

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852(2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C Brick StandardCpf1 AssemblyDNA Part AssemblyCRISPR RNASeamless AssemblyVector DigestionChromoprotein CassettesPlasmid PreparationSanger SequencingChemical Transformation

İlgili makaleler