Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

8.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55795

⸱

3 Ağustos 2017

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, mikroskopik gözlem için tüm montaj dokusu hazırlığının ardından meme yağ padi transplantasyonu yoluyla vasküler endotel kök hücrelerinin (VESC'lerin) çoğalmasını, farklılaşmasını ve damar oluşturma potansiyelini değerlendirmek için yeni bir yaklaşımı göstermektedir. VESC'lerin in vivo davranışlarını araştırmak için bir soy izleme stratejisi de sunulmuştur.

Özet

Endotel hücreleri (AK) vasküler mimarisinin temel yapı taşlarıdır ve uygun damar gelişimini ve homeostazı sağlamak için vasküler büyümeye ve yeniden şekillenmeye aracılık eder. Bununla birlikte, endotelyal soy hiyerarşisi üzerine yapılan çalışmalar, erişim kazanma araçlarının eksikliği ve davranışlarını doğrudan in vivo olarak değerlendirmeleri nedeniyle hala kaçınılmazdır. Bu eksikliği gidermek için meme yağ pedini kullanarak anjiyogenezi incelemek için yeni bir doku modeli geliştirildi. Memeli bezi, ergenlik ve gebelik de dahil olmak üzere doğum sonrası evrelerde gelişirken, bu süreçte sağlam epitel çoğalması geniş damar tadilatıyla birlikte gerçekleşir. Meme yağ yastıkları, büyüyen meme epitelinden alan, matris ve zengin anjiyojenik uyaranlar sağlar. Dahası, meme yağ padleri peritoneal boşluğun dışında bulunur ve bu sayede ekzojen hücrelerin anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için kolayca erişilebilir bir aşılama alanı haline getirilir. Bu çalışma ayrıca,Vivo endotel kök hücre hedefli popülasyonunu (VESC'ler) in vivo olarak özel olarak etiketlemek için floresan muhabir farelerini kullanan nt izlem yaklaşımı. Bu soy takibi yöntemi, daha sonra doku bütün montaj mikroskopisi ile birleştiğinde, çoğalma kapasitesinin ölçülebileceği ve farklılaşma taahhüdünün kader eşleştirilebileceği hedeflenen hücrelerin ve torunlarının doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Bu yöntemleri kullanarak, VESC'leri ifade eden iki kutuplu protein C reseptör (Procr) popülasyonu son zamanlarda birçok vasküler sistemde tanımlanmıştır. Procr + VESC'ler hem yeni EC'lere hem de perisitlere neden olarak, gelişme, homeostaz ve hasar onarımı sırasında anjiogenezise aktif olarak katkıda bulunurlar. Genel olarak, bu el yazması VESC'lerin kök hücre özelliklerini değerlendirmek için kullanılabilecek yeni bir göğüs yağ padi transplantasyonunu ve canlı organizma izleme tekniğini tanımlamaktadır.

Giriş

Gelişme ve homeostaz sırasında, vasküler büyüme ve yeniden şekillendirme, organ gelişimine ve onarımı uyarınca sadık kalarak gerçekleşir. Anjiyogenez, mevcut kan damarlarından yeni damarların oluşumunu açıklar ve bu dinamik vasküler değişikliklere aracılık eden önemli bir kuvvet olarak kabul edilir. Her kan damarı, bir dizi endotel hücresi (EC) ile astarlanmış olup, bunlar gemi yapısının temelini oluşturmuş gibi görünmektedir. Uzun süre, homeostaz sırasında EC havuzunun doldurulması mekanizması belirsiz kaldı ve vasküler ciro, olgunlaşan AT çoğalmasının bir sonucu olup olmadığı veya vasküler kök / progenitör hücre aktivitelerinin katkısı olup olmadığı üzerine tartışmalar yapıldı. Doğrudan fizyolojik kanıt bulunmaması nedeniyle, vasküler endotelyal kök hücrelerin (VESC'ler) varlığı ve hücresel kimliğini de tartışmalı olarak kaldı.

Kök hücre davranışını doğrulamak için kullanılan en yaygın yaklaşımlardan biri transplanstan geçmektedirFarazi kök hücrelerin alıcı farelere tayin edilmesi. Bu yöntem, aday kök hücrelerin köklenme potansiyelini in vivo olarak ölçer . Transplantasyon ilk hematopoietik sistem 2 hiyerarşik özellikleri kurulmasına katkıda kemik iliği kök hücrelerinin 1, çalışma uygulanmıştır. Endotel sahasında, yan deri altına subkutan yoldan sokulan bir bazal membran matrisi ( ör., Matrigel) tıpası, nakledilen EC'lerin damar oluşum yeteneklerini ele alan standart bir in vivo anjiyogenez tahlilidir. 3D kültür sistemlerinde koloni oluşumu ve transplantasyon da dahil olmak üzere çok sayıda deneysel yöntem, EC progenitörü / VESC popülasyonunda 3 , 4 , 5 , 6'yı önermişlerdir. Bununla birlikte, bazal membran matrisine gömülü EC'ler,Çevredeki doku, bu, nakledilen hücrelerin anjiyojenik potansiyelini tam olarak keşfetmek için gerekli en uygun niş ortamı sağlamaz. Sonuç olarak, matris tıpası içerisinde oluşan kaplar ağırlıklı olarak kılcal benzeri olup fonksiyonel olarak ölçülemezdirler.

Memeli bezi postnatal dönemde gelişir, en sağlam büyüme ergenlik ve gebelik sırasında gerçekleşir. Ergenlik evresinde, meme epiteli tüm meme yastığını işgal etmek için hızlı genişlemeye, çevredeki vasküler yapıların etkili şekilde yeniden şekillenmesine eşlik eder. Böylece, meme bezi anjiyogenez çalışması için mükemmel bir model sunar. Uzanan meme epitelinden boşluk, matris ve zengin anjiyojenik uyaranlar sağlar ve bu nedenle ekzojen hücrelerin anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için ideal bir aşılama alanıdır. Buna ek olarak, meme yağ yastığı, oluşturulan eksojen damarların ev sahibi dolaşım sistemi ile entegrasyonunu sağlar ve daha fazla fTek dereceli değerlendirme ve subkutan transplantasyona kıyasla bir avantaj sağlamaktadır.

In vitro kültürleme ve transplantasyon tahlilleri, bir hücre popülasyonunun rejenerasyon özelliklerini araştırmak için etkili bir yol olmasına rağmen , hücrelerin doğal yaşam alanlarından uzaklaştırıldıklarında bu tahlillerin plastisiteyi uyardığı bilinir ve hücreler koparsa değişiklikler meydana gelebilir Fizyolojik çevreleri 7 . Dolayısıyla, doğrudan in vivo hücre akıbetiyle ilgili kanıt elde etmek, endotel popülasyonlarının mevcut davranış anlayışının geliştirilmesine yönelik temel yaklaşımdır.

VESC'lerin tanımlanması ve vücut sistemindeki özelliklerinin incelenmesi için, fizyolojik bağlamında in vivo kök hücre davranışını ortaya koyabileceği ve gerçek köklenme olabileceği için genetik kader haritalaması zorunludur ( örn., In vivo soy travması) değerlendirdi. Lineage traciNG, aday VESC'lerin uzun süreli kalıcılığının ( örn. Kendiliğinden yenilenmesi) ve orijin dokusu için hücre tipleri üretme kabiliyetinin ( yani, farklılaşma potensi) doğrudan kanıtını sağlar.

Bu protokol, yeni bir meme yağ padi transplantasyon tekniğini ve VESC'lerin damar üretim yeteneğini gözlemlemek için bir soy travma metodunu açıklamaktadır. Bu teknikler mevcut testlerin eksikliklerinin üstesinden gelir ve VESC'lerin kök hücre özelliklerini en iyi şekilde değerlendirmenin yeni bir yolunu sağlar. Bu yaklaşımlar, patolojik bir ortamda vasküler hücre potens alterasyonunu belirlemenin yanı sıra, endotel popülasyonlarının damar oluşum özelliklerini ve davranışı değerlendirmek için kullanılabilecek etkili araçlardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneysel prosedürler, Şanghay Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokol SIBCB-NAF-15-002-S335-003 kapsamında onaylandı.

1. Fare Meme Bandı'ndan VESC'lerin izolasyonu

  1. Meme bezi hasadı ve doku sindirimi.
    1. Ağırlıkları 20 ile 25 g arasında değişen dokuz bağışçı olarak 8 haftalık Actin-GFP olgun bakire raportör farelerini kullanın.
      Not: Donör kaynaklı hücreler, GFP ifadesi ile kolayca izlenebilir.
    2. RPMI1640 içinde% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 1 kalem / strep ve 25 mM HEPES içeren doku sindirim ortamı orta hazırlayın. Karışımı 0.22 μm'lik bir filtreyle süzün ve bir su banyosu içerisinde 37 ° C'ye ısıtın.
    3. Bir CO2 odası içinde fareler kurban. Dördüncü inguinal meme bezi çifti ilk önce dikey bir cilt yaparak ayırın(Veya cerrahi makas) alt karın orta hattında ncision. Forseps kullanarak kasık meme bezini ortaya çıkarmak için cildi yavaşça bir taraftan soyun. Dördüncü kasığa ait meme bezlerini her iki taraftan alın ve makas kullanarak 6 cm'lik bir Petri kabında ince parçalar halinde kesin.
      1. Kıyılmış dokunun toplam ağırlığını ölçün ve 50 mL tüp içine yerleştirin.
        Not: Sonuçtaki doku kıymanın her bir parça için 1 mm 3'den küçük olduğundan emin olun. Tipik bir verim, her hayvan için yaklaşık 5.000 VESC'dir.
    4. 1 ml doku kıyma başına 10 ml'lik bir hacimde 50 ml'lik kapaklı bir santrifüj tüpüne sindirim ortamı ortamı hazırlayın. Sindirim tamponu oluşturmak için 10 mL sindirim ortamı ortamı için 300 ünite konsantrasyonda kollajenaz Tip 3 ekleyin. Eşit şekilde karıştırın ve ince kağıt mendiline ilave edin.
    5. Yatay olarak 50 mL'lik santrifüj tüpünü sallanan bir platform üzerine yerleştirin ve hızı 100 rpm'ye ayarlayın ve sıcaklık 37 ° C'ye ayarlayın. kışkırtmakMeme dokusunu 2 saat boyunca. Doğru sindirimi sağlamak için boruyu her 20 dakikada bir kontrol edin ve elle çalkalayın.
      Not: FACS öncesi doku sindiriminin amacı katı dokudan tek hücreli bir solüsyon hazırlamaktır. Bu nedenle, sindirimin sonunda içerik, görünür doku parçaları olmadan kalın bir solüsyonda olmalıdır.
  2. Tek hücreli çözelti hazırlama.
    1. Sindirimden sonra, önceden ısıtılmış, steril PBS ile 50 mL santrifüj tüpünü ekleyin ve eşit şekilde karıştırmak için tüpü tersine çevirin. Hücre pelleti elde etmek için tüp 200 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    2. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini gevşetmek için tüpün tabanını oynatın. Kırmızı kan hücrelerini yok etmek için, 3 mL kırmızı kan hücresi parçalama tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında (RT) doku kültürü kapağında inkübe edin.
    3. 10 mL steril PBS ekleyin ve eşit şekilde karıştırmak için tübü tersine çevirin. 5 dakika 200 xg'de doku içeriğini santrifüjleyin ve diskArdından süpernatant. 3 mL önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin ekleyin ve kalan dokuyu daha da sindirmek için tüp 37 ° C'de 5 dakika saklayın.
    4. 3 mL önceden ısınmış IMDM'yi ekleyin ve daha sonra 100 μL DNaz I çözeltisi (1 mL PBS içinde seyreltilmiş 0.25 mg DNaz) ilave edin. DNA filamentlerini parçalamak için tüpü 37 ° C'de saklayın. Hücre solüsyonu elde etmek için doku karışımını 70 μm hücre süzgeçten geçirin. Enzimatik sindirimi nötralize etmek için süzgeç 2 mL PBS +% 5 FBS ile iki kez durulayın.
    5. Hücreleri peletlemek için hücre karışımı 200 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve antikor boyama için hücre pelletini 1 mL PBS +% 5 FBS içinde tekrar süspanse edin.
  3. FACS tabanlı Procr + VESC izolasyonu.
    1. Verilen rutin protokolleri izleyen donör meme dokusundan elde edilen hücre karışımını antikor boyamasına tabi tutun 8 .
      Not: Aşağıdaki antikorlar kullanılmıştır: anti-fareKan serisi-FITC, anti-fare CD31 (PECAM1) -PECY7, anti-fare CD105-APC (hepsi 1 ug / mL konsantrasyonda kullanılır), anti-fare CD201 (Procr) -biotin Μg / mL) ve streptavidin-v450 (0.5 μg / mL konsantrasyonda kullanılır).
      1. Antikor boyamadan sonra, hücreleri PBS +% 5 FBS ile tamamlayın ve daha sonra 5 dakika 200 g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve 1 mL PBS +% 5 FBS ile hücreleri tekrar süspanse edin. 40 μm hücre süzgeçten geçirin. FACS sıralama kadar buz üzerine yerleştirin.
    2. Procr + VESC'leri izole etmek için FACS tabanlı sıralama gerçekleştirmeye devam edin.
      1. Her bir rengin voltajını belirlemek için renklendirilmemiş numuneyi ve her tek renkli kontrolü analiz edin. Otomatik floresans veya arka plan boyamayı önlemek için kompanzasyon parametrelerini hesaplayın. İstenilen hücre popülasyonları için uygun gating ve sıralama için şablon oluşturun.
      2. FACS sıralama hiyerarşisini oluşturmak için, öncelikleTüm etkinlikler ve ardından çiftler veya yapışkan hücre kümelerini genişlikle tetikleyerek atın. Kan serpintisi hücrelerini kapatın ve daha sonra endotelial popülasyonları tanımlamak için CD31 + ve CD105 + kullanın.
        Not: Procr + hücreleri bir FMO kontrolüne kıyasla CD31 + CD105 + EC'lerden izole edilmiştir. Temsili bir FACS analiz şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bir FACS ile izole edilmiş VESC popülasyonu IMDM +% 50 FBS'de askıya alınmalı ve sonraki işleme kadar buz üzerinde saklanmalıdır.

2. In Vivo VESC Damar Oluşturma Deneyi Meme Fat Padini Kullanarak

  1. Transplantasyon için primer EC'leri hazırlayın.
    1. FACS ile sıralanmış hücreleri 10 mL PBS +% 5 FBS ile toplayın ve ardından hücreleri altına yerleştirmek için 5 dakika boyunca 200 xg'de santrifüjleyin.
    2. Sıvıyı dikkatli bir şekilde aspire edin, hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve hücre zerresini bazal membran matris karışımı ile tekrar süspansiyon haline getirin (consi% 50 taban membranı matrisi ve 100 ng / mL rmVEGF ve 60 U / mL heparin ile takviye edilmiş% 20 FBS içeren PBS) 15,000 hücre / 15 | iL'lik bir çalışma yoğunluğuna ulaşmak için kullanıldı.
      Not: Bazal membran matriks karışımı daima buzda saklanmalıdır.
    3. Nihai enjeksiyon hacimlerinin toplam olarak 15 μL'yi aşmamasına dikkat ederek, 1.5 mL'lik bir mikro tüp içinde gerekli girdi konsantrasyonlarına ulaşmak için sıralanmış ve sayılmış hücreleri ciddi olarak seyreltin. Transplantasyon sırasında daha iyi içerik görselleştirmesi için her bir tüpe% 0.1 Tripan mavisi ekleyin. Karıştırmak için iyice pipetleyin. Kullanana kadar tüpleri buz üzerinde saklayın.
      Not: Başarılı bir damar üretimi, en az 100 VESC ile sağlanabilir.
  2. Primer EC'leri meme yağ yastığına naklet.
    1. Cerrahi aletleri ve tezgahı dezenfekte edin. Aynı araçları birden çok hayvanda kullanıyorsa, dezenfeksiyon için bir boncuk sterilizatör kullanılabilir.
    2. 3 haftalık BALB / c çıplak mikrofonunu anestezi altına alE, kurumunuzun veteriner hekimi ve IACUC tarafından önerilen anestetik protokolü kullanarak. Her fare sırtüstü pozisyonda, sırtını da ameliyat masasına koyun. Bacaklarını yapışkan bantla sabitleyin.
    3. Pamuklu çubuğu iyot bazlı antiseptik solüsyona batırın. Ameliyattan önce cildin yüzeyini sterilize etmek için farenin tüm karın bölgesini iyice silin.
    4. Forseps ile farenin karın cildi tutun ve kaldırın. Küçük, 1 cm'lik dikey kesi yapmak için cerrahi bir neşrubat kullanın. Baş aşağı, Y şeklinde insizyon elde etmek için her biri arka bacağa doğru 0,5 - 1 cm uzunluğunda iki kesik yapın.
      1. Cildinizi karından hafifçe ayırmak için forseps ve pamuklu çubuk kullanın ve kasık meme bezlerini ortaya çıkarmak için cildi yana doğru döndürün. Fareyi bir stereoskopun altına yerleştirin ve büyütmeyi 2.0X olarak ayarlayın. Odaklamayı, meme yağ pedinin açıkça görülüp çalıştırılabileceği şekilde ayarladığınızdan emin olun.
    5. 27G 1/2 "iğne yerleştirinBuz ön ısıtmak için. İğne ile birleşen bölgede sıkışan olası hava kabarcıklarını gidermek için temel membran matriks karışımlı bir 1 mL'lik şırıngayı önceden boşaltın. Mikrosantrifüj tüpünün kapağına 15 μL karışık çözeltiyi pipetleyin ve ardından tüm hacmi astarlanmış şırıngaya aspire edin.
    6. İnce cımbız kullanarak inguinal lenf nodunun önündeki meme yağ pedini tutun ve kolay enjeksiyon için hafifçe kaldırın. Şırınga iğnesinin yaklaşık 1/4'ünü yağ yastığına yavaşça yerleştirin.
      1. Şırınga iğnesini kavramak ve dengelemek için cımbızı tıraş pedinden bırakın. Sıvı sızıntısını önlemek için çözeltiyi yavaşça enjekte edin. İğneyi çekerken sızıntıyı en aza indirgemek için hücre karışımının katılaştığından emin olmak için birkaç saniye bekleyin.
    7. Emici dikişlerle cilt kapağını kapatın. Boyut 5-0 non-reaktif monofilament dikiş kullanarak cilt flepini dikin ve cerrahın tarzı düğümlerle yaraları kapatın, her düğüm yaklaşık olarak0.3 cm uzaklıktadır. Alternatif olarak, yara zımbaları ile cildi kapatın.
    8. Çalıştırılmış fareleri kurtarmak için ayrı bir kafese yerleştirin. Anestezi uygulanmış farelerin hipotermiye maruz kalmasını önlemek için kafesin üzerine bir ısıtma lambası yerleştirin. Fareyi ameliyat sonrası sıcak tutmak için kafesin altına yumuşak kağıt ve pamuk koyun.
      1. Tüm alıcılar tamamen uyanık oluncaya kadar farelere dikkatle bakın. Önümüzdeki birkaç gün boyunca, post-cerrahi analjezikleri tüm hayvanlara ya da tesis veteriner hekiminin talimatına göre önceden uygulayın. Yara enfeksiyonu ortaya çıkarsa, onaylanmış hayvan protokolüne göre antibiyotik uygulayın. Cerrahi yara zımba teli ile kapatılmışsa, yara tamamen kapatıldığında ameliyattan 10 gün sonra yara klipslerini çıkarın.

3. Mikroskobik Gözlem için Bütünüyle Dayanıklı Doku Hazırlama

  1. Doku hasatı
    1. İmplantasyondan 2-4 hafta sonra alıcı BALB / c'yi anestezi altına alınızAdım 2.2.2'de olduğu gibi 20 g vücut ağırlığı başına 0.12 mL'lik bir dozda% 2.5 anestezi edici maddenin intra-peritoneal bir enjeksiyonu ile çıplak fareler.
      Not: Pozitif damar büyümesi hücre transplantasyonundan 2-4 hafta sonra tespit edilebilir.
    2. Alıcı sistemik dolaşımı 50 μg / 25 g vücut ağırlığı dozunda isolectin-647 boya kuyruk damar enjeksiyonu ile etiketleyin, 50 μL steril PBS'ye tekrar süspansiyon haline getirin. 5 - 10 dakika dinlenme süresine izin verin. Fareleri CO 2 kullanarak kurutun.
    3. Adım 2.2.4'ten sonra hücrelerin başlangıçta enjekte edildiği meme dokusu bölgesini inceleyin; Cerrahi makas kullanın. Bir cerrahi bıçak kullanılarak, 6-cm Petri kabaca 3- 4-mm-3 küpler halinde doku doğranır.
  2. Antikor boyama için doku sindirimi ve hazırlanması.
    1. Doku parçalarını, kollajenaz III ile takviye edilmiş 10 mL önceden ısıtılmış sindirim ortamı (adım 1.1.2) ile doldurulmuş 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde özümleyin.(10 mL başına 300 U).
    2. 15 mL'lik santrifüj tübünü, hız 100 rpm'e ayarlanmış ve doku yapısını gevşetmek ve aşırı adiposit dokusunu çıkarmak için yaklaşık 1 saat boyunca 37 ° C'ye ayarlanmış sallanan bir platform üzerine yatay olarak yerleştirin.
      Not: Adipositler, gürültülü bir flüoresan arka plana neden olabilecek oto-flüoresan üretme eğilimindedir. Sindirimin sonunda, doku parçaları yumuşak, bulutlu bir görünüme sahip olmalıdır. En iyi sindirim periyodu doğranmış doku parçalarının büyüklüğüne bağlıdır ve bu nedenle en iyi sonucu elde etmek için buna göre ayarlanmalıdır. Doku damarı zaten flüoresan etiketli izoelektin ile etiketlendiğinden, aşağıdaki prosedürlerin tamamı ışığa karşı korunmalıdır.
    3. Doku parçalarını RT'de 10 dakika PBS ile yıkayın. Floresansı korumak için parçaları% 6'luk PFA (pH 7.2 - 7.4) ile yarı dolu 6 cm'lik bir Petri kabına dikkatlice yerleştirerek bütün montaj dokusunu düzeltin. Petri kabını yerleştirinSallanan bir platform üzerine yerleştirin ve 30 dakika oda sıcaklığında dokuyu nazikçe çalkalayın.
      Not: PFA kanserojendir ve dikkatli kullanılmalıdır.
    4. Kalan PFA'yı çıkarın ve sabit dokuyu üç kez yıkama tamponuyla (PBS'de% 0.1 ara ile) yıkayın ve her yıkama işleminin 10 dakikalık bir aralıkla yıkayın.
  3. Bütün montaj dokusu antikor boyama.
    1. Antikor boyama tamponundaki birincil antikoru 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde seyreltin. Bir gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor ile doku inkübe edin.
      Not: Sıçan anti-CD31 (konsantrasyon: 10 ug / mL) veya sıçan anti-VE-Cadherin (CD144 / Cdh5; konsantrasyon: 2.5 ug / mL) primer antikor olarak kullanıldı. Hem CD31 hem de VE-Cadherin, endoteli tanımak için kullanılan hücre yüzeyi markörleridir. 5x antikor boyama tamponu 500 mM maleik asit, pH 7.5 ile hazırlanır; 750 mM NaCl; Ve% 0.5 (v / v) ara madde PBS içinde çözülür. Taze 1x çalışma solüsyonu hazırlanırken sadece uygun bir serum hacmine (% 5) ekleyin9 .
    2. Antikor boyama tampon kaldırmak ve 10 dakika arayla, yıkama tamponu ile üç kez tüm monte doku yıkayın. Dokuyu ikincil antikorla ( Malzeme Tablosuna bakın) artı DAPI'yi sallanan bir platformda 4 saat oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
      Not: Çekirdekleri görselleştirmek için 5 μg / mL'lik nihai konsantrasyonda DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) kullanın.
    3. Tüm montaj dokusunu yıkama tamponu ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Daha iyi korunması için dokuyu kurutmak için gece boyunca% 80 gliserol veya% 80 sakaroz içindeki doku parçalarını kuluçkalayın.
    4. Tekli doku parçalarını bir cam slayt üzerine yerleştirin ve aşırı dehidrasyon tamponunu çıkarın. Kurulum malzemesi ile dokuyu örtün, bir lamel yerleştirin ve ayarlamak için dokuyu hafifçe sıkıştırın.
    5. Konfokal mikroskopik görüntü elde etmeyi gerçekleştirir. Tamamen monte edilmiş meme bezleri için, NA = 1.3 yağ nesnesiyle 40X kullanarak görüntü elde edinettik. 1,024 x 1,024'lük bir optik kesit çözünürlüğü ve 1,0 ila 1,2 μm'lik bir katman ayrımı ile Z yığınlarının kiremit taramalarını edinin.
      Not: Doğru floresan ışık sinyalini elde etmek için, filtre kiriş dağıtıcı, üç renkli dikdörtgen (TD) 488/553/638 olarak ayarlanmalıdır ve kazanç ayarı PMT Kazanç 600-800'dir. Aşağıdaki uyartım / emisyon kaynakları kullanılmalıdır: mGFP, uyarma / emisyon maksimumu 488/509 nm; 532/588 nm uyarma / emisyon maksimumu ile mTomat; Uyarım / emisyon azami değeri 594/665 olan Alexa-647; Ve 350/470 uyarma / emisyon maksimumu ile DAPI.

4. Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modeli Kullanarak Lineage Tracing

  1. Procr + VESC'leri fare modeli kullanarak tespit edin.
    1. Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + ( Procr CreERT2 olarak anılacaktır) knock-in fare suşunu kullanın.
      Not: Bu fare modelinde bir CreERT2-IRES-tdTomato kasedi 10 Procr 11'in ilk ATG kodonundan sonra eklenir.
      1. In vivo endojen Procr + EClerin kaderini izlemek için Rosa26 mTtomatomGFP ( R26 mTmG olarak anılacaktır) raportör suşu ile çapraz Procr CreERT2 fareleri 11 . Etiketli tüm endojen Procr + EC'leri ve bunların soyunu GFP ifadesi kullanarak tanımlayın.
    2. Pubertal evre (5 hafta) sırasında 4 mg / 25 g vücut ağırlığı dozunda intraperitoneal olarak intraperitoneal olarak tamoksifen solüsyonu 11 (1 mL fıstık yağı içinde çözülmüş 10 mg tamoksifen + 10 mg / mL stok solüsyonu oluşturmak için% 10 etanol) uygulayın Eski) Procr + ECs gelişim kaderini takip etmek.
    3. Etiketli hücrelerin klon oluşturan verimliliğini 3. adımda belirtilen hazırlama adımlarını izleyerek tüm montajlı immün boyama ile analiz edin. Hem meme yağ pedlerini hem kısa süreli (2 gün) ve uzatılmış zaman periyotları (10 aya kadar). Bkz. Şekil 3 .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Meme VESC'lerin İzolasyonu:

Sonuçtaki transplantasyon testi için endotel popülasyonunu izole etmek için olgun (8 haftalık) bakire fare meme bezleri donör madde olarak hasat edildi. Endotel hücreleri bir antikor bazlı hücre ayırma tekniği kullanılarak izole edildi. 8 haftalık C57BL / 6 meme bezi EC'lerindeki VESC popülasyonunun FACS analizinin temsili parselleri Şekil 1'de gösterilmektedir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Anjiyogenez tahlilleri, vasküler dinamiklerin çalışılması için iyi bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Postnatal olarak gelişen fare retinal vaskülatürü, anjiyogenezi incelemek için çekici bir model olduğu kanıtlanmıştır 12 . Nispeten erişilebilir olmasına rağmen, retina vasküler yatağı içinde fiili manipülasyon oldukça zordur. Şimdiye kadar, en iyi tarif edilen in vivo transplantasyon, bir bazal membran matriks kütlesi içindeki hücreleri kapsayan ve bir alıcı fare kenar bölgesinde subku...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (315030045 ve 31371500, YAZ için 31401245, QCY için 31401245), Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2014CB964800), Çin Bilimler Akademisi (XDB19000000 ila YAZ) ve Çinli Hücre Biyolojisi Derneği (QCY'ye Erken Kariyer Bursu).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 Tripsin-Etilen Diamin Tetraasetik Asit (EDTA) (1x)Gibco (Yaşam Teknolojileri)25300-062%0.05 Tripsin
0.22 ve mikro; mFiltre Ünitesi Merck Millipore Ltd.SLGP033RB0.22 ve mikro; m
Filtre 2-Metilbutanol-2, ReagentPlusSigma-Aldrich24, 048-6Tert Amil Alkol
222, TribrometanolSigma-AldrichT48402-25g222, Tribrometanol
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)İnvitrojenD1306DAPI
70 ve mikro; m Hücre SüzgeciBD FAL35235070 & mikro; m Hücre Süzgeci
Yapışma Mikroskobu SlaytlarıCITOGLAS188105Cam slaytlar
Anti-fare CD105 APCeBioscience17-1051-82,1 ve mikroda FACS analuzisi kullanımı için klon MJ7/18; g / mL
Anti-fare CD201 BiotineBioscience13-2012-822.5 & mikro'da FACS analuzisi kullanımı için; g / mL
Anti-fare CD31 PE-Siyanin 7eBioscience25-0311-82,1 ve mikro'da FACS analuzi kullanımı için klon 390; g/mL
BD FACSJazz Hücre SıralayıcısıBD Biosciences655489FACS
Sığır Serumu AlbüminSigma100190332BSA
SantrifüjEppendorf5810RSantrifüj
Kollajenaz tip 3Worthington-Biochem#LS004183Kollajenaz III
Konfokal mikroskopiLeicasp8Konfokal
Sığır pankreasından deoksiribonükleaz ISigmaD2463-5VLDnase I
Eşek anti-sıçan Cy3Jackson ImmunResearch712-165-150İkincil antikor, 0.5 & mikro'da kullanım; g/mL
Dumont ForsepsWPI500342Froceps
Dumont Forseps - Mikro Körelmiş UçlarFST11253-20Forseps
Fetal Sığır SerumuHycloneSH30396.03FBS
FITC Ms CD3 / Gr1 / CD11b / CD45R (B220) / Ter-119BioLegend78022FACS analizi için kan soy kokteyli, 25 & mikro'da kullanım; L test başına
GliserolSigmaG6279Gliserol
Iscov'un Modifiye Dulbecco'nun Orta Gibco'su(Yaşam Teknolojileri)12440-053
Griffonia Simplicifolia'dan IMDM İzolektin GS-IB4, Alexa Fluora  647InvitrogenZ32450İzolelektin-647
Matrigel  Matris (büyüme faktörü azaltılmış)BD356231Matrigel
Fare suşu (Actin-GFP)Jax Laboratories3773Actin-GFP
Fare suşu (C57BL/6)SLACC57BL/6C57BL/6
Fare suşu  (BALB/c çıplak)SLACBALB/c çıplakÇıplak fareler
ParaformaldehitSigmaP6148PFA
Penisilin StreptomisinGibco (Yaşam Teknolojileri)5140-122Kalem/Strep
Fosfat Tamponlu Salin (pH7.2) 1xGibco (Yaşam Teknolojileri)c20012500BTPBS
PRIM1640Gibco (Yaşam Teknolojileri)c11875500CPPRIM1640
ProLong Gold antifade reaktifiLife TechnologiesP36934Montaj Ortamı
Sıçan anti CD144BD Biosciences550548tam montaj analizi için, endotelyal sıkı bağlantı için anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy, 2.5 & mikro'da kullanım; g / mL
Sıçan anti CD31-biotinBD Biosciences553371tam montajlı analuzi için, endotelyal yüzey yapışma molekülü için anti-CD31 / PECAM1 antikoru, 10 & mikro'da kullanın; g / mL
Kırmızı Hücre Lizis TamponuSigmaR7767-100MLKırmızı kan hücresi parçalama tamponu
Düz / Keskin-Künt / 10cmFST14028-10İnce Makas
Streptavidin eFluor 450 eBioscience48-4317-82FACS analizi için 0.5 ve mikroda kullanın; g/mL
TamoksifenSigma101551374TAM
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-250MLTritonX
Balmumu Kaplı Örgülü İpek (Boyut 5-0 USP (1 Metrik), 18 inç (45 cm) SİYAH C-1 İğnesi üzerinde)COVIDIENS1173Sütür 
Steril Tek Kullanımlık ScaplelsSwann Morton# 10Neşter
BetadineYifeng Tıbbi20160101Antiseptik çözelti
,

Kaynaklar

  1. Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
  2. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  3. Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
  4. Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407(2012).
  5. Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
  6. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  7. Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
  8. Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
  9. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
  10. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  11. Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
  12. Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  13. Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012(2014).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  15. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  16. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  17. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Doku TransplantasyonuBütün Dağlama MikroskopisiFACS SıralamaKonfokal MikroskopiProtein C Reseptörüİzolektin İşaretlemeAnjiyojenik OrtamSoy Hattı İzleme
Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.