Yöntem makalesi

Fizyolojik Olarak İlgili Tahliller Kullanılarak 3-D Kök Hücre Kültürlerinin Sorgulanması İçin HiPSC Türevi Serum Serbest Embriyoid Cisim Geliştirilmesi

DOI:

10.3791/55799

⸱

20 Temmuz 2017

 ,  , 
1The Hussman Institute for Autism

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, insandan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) serum serbest embriyo gövdesi (SFEB) denilen üç boyutlu (3 boyutlu) bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 Boyutlu model, insan kortikal gelişimini modellemek için organotipik dilim kültürü gibi ve gelişmekte olan sinir devrelerinin fizyolojik sorgusu için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HiPSC'leri kullanarak bir dizi in vitro hastalık modeli geliştirilmiş olsa da, bir sınırlama, bu iki boyutlu (2-B) sistemlerin, şüpheli hastalık varyantlarını taşıyan etkilenen bireylerin altında yatan sitolojik mimari ve fonksiyonel karmaşıklığı temsil etmeyebileceğidir. Konvansiyonel 2 boyutlu modeller in vivo benzeri yapıların eksik temsillerini tutar ve beynin karmaşıklığını yeterince yakalar. Dolayısıyla, in vivo bir sistemde görülen hücresel etkileşimleri ve işlevleri daha iyi özetleyebilen daha fazla 3-D hiPSC'ye dayalı modeller için yeni bir ihtiyaç ortaya çıkmaktadır.

Serbest embriyo gövdeye (SFEB) dayalı farklılaşmamış hiPSC'lerden 3 boyutlu bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 boyutlu model, gelişmekte olan bir ventralize neokorteksin özelliklerini yansıtır ve yaşayan sinir hücreleri ile göç, bağlantı, iletişim ve mat gibi bozulmamış dokular için ayrılmaz fonksiyonlara yönelik çalışmalara izin veriruration. Özellikle, protokolümüzü kullanan SFEB'lerin kalsiyum görüntüleme ve kriyoseksiyonsuz çok elektrotlu dizi (MEA) kayıtları gibi fizyolojik olarak alakalı ve içeriği yüksek hücre bazlı analizleri kullanarak sorguya çekilebileceğini gösteriyoruz. ÇÇ kayıtlarında, SFEB'lerin uzun süreli kültürde hem başak aktivitesini hem de şebeke seviyesinde patlama aktivitesini arttırdığını gösteriyoruz. Bu SFEB protokolü, erken kortikal gelişimin özelliklerini yakalayan 3 boyutlu bir modelde ağ oluşumunun geliştirilmesi çalışması için sağlam ve ölçeklenebilir bir sistem sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce erken kortikal ağ 1 geliştirme bazı yönlerini tekrarlar hasta-türevi insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) oluşturulmuş bir 3-boyutlu bir model sistemi, bildirmişlerdir. Serumsuz bir embriyo gövdesi (SFEB) olan bu 3 boyutlu model, önceki basit toplama hiPSC modelleri 2 , 3'ü geliştirir . Işin artan vücut 5 / tek tabakalı hiPSC modelleri 4 eden SFEBs gibi 3-B yapısı, sinir gelişme yaklaşık yönleri genel olarak in vivo ve 2-boyutlu (2-D) 'de gözlenenden daha önceki bir zaman noktasında gözlemlenen açıklayıcıdır. İlk çalışmalar, fizyolojik karmaşıklığını göstermeksizin üç boyutlu cisimciklerin kendilerini organize eden karmaşıklığına odaklanmıştır 2 .

Burada açıklanan protokol, fibroblastlardan türeyen farklılaşmamış hiPSC'lerde ve Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler). Bu hücreler γ-ışınlanmış fare embriyonik besleyicilerinde (MEFler) muhafaza edilir. Bu hiPSC kolonileri kendiliğinden farklılaşmış hücrelerden manuel olarak temizlenir, enzimatik olarak hasat edilir ve Rho-Kinaz inhibitörü Y-27632 (ROCKi) içeren ortamda yeniden süspanse edilir. Farklılaşmamış hiPSC'ler 96 oyuk düşük yapışma V-alt plakalarına aktarılmadan önce ayrışma ve santrifüje tabi tutulur. Kaplama sonra sinir indüksiyon çift Smad inhibisyonu kullanılarak başlatılır (birlikte SB431542 ve LDN193189 dickkopf 1 (dkk-1)), bir ön-cephe ön beyin nöron kaderini soy 6 sürücü. 14 gün sonra, SFEB'ler 6 oyuklu bir plaka içerisinde hücre kültür eklerine aktarılır. Bir kez aktarıldıktan sonra yuvarlak SFEB'ler yayılmaya ve inceltmeye başlarken, benzer hücre kültürü ekleri kullanan hipokampal organotipik dilim kültürü preparatlarında sıklıkla gözlendiği gibi yerel ağ bağlantılarını muhafaza ederek 1 ,Ss = "xref"> 7.

Bu formatta bir SFEB tabanlı 3 boyutlu platformun kullanımı kalsiyum görüntüleme veya tek hücreli kayıtlar veya çok elektrotlu dizi (MEA) gibi elektrofizyolojik testler gibi hücre bazlı fizyolojik tahliller kullanılarak sorgulanabilecek kortikal şebekelerin etkili bir şekilde üretilmesine uygundur ) 1 . 3 boyutlu sistemler erken kortikal gelişim işaretleri ayı rağmen, diğer çalışmalar bu 3 boyutlu cisimler insan dokusu gelişimi 8'in doğal olarak daha yavaş bir hızda izin vermek için daha uzun inkübasyon süreleri gerekebilir göstermiştir. Bu SFEB protokolü, kortekste erken gelişim özelliklerini yakalayan farklılaşmamış hiPSC'lerden başarıyla 3-D SFEB'ler üretir.

SFEB'lerin nörolojik bozukluklarda ağ aberasyonlarını modelleme potansiyeli bu sistemin gücüdür. Hasta dokusundan türetilen hiPSC'ler, sinir sisteminin kıçına tabi olan hücrelere yetiştirilebilirHücre biyolojisine ve aynı zamanda gen ekspresyonuna ilişkindir. İnsan iPSC'leri, otizm spektrum bozukluğu (ASD), şizofreni 9 , Rett Sendromu 10 ve Alzheimer hastalığı 11 , 12 gibi karmaşık etyolojilere sahip çeşitli nörolojik bozukluklara sahip geniş birey gruplarının genetik profilini tespit etmek için kullanılmaktadır. Yakın zamana kadar, iPSC modelleri tipik olarak, moleküler etkileşimleri değerlendirmede yeterli iken , in vivo görülen karmaşık hücresel etkileşimleri deşifrelemede yetersiz kalan tek tabaka preparatlarıydı. Hayvan modelleri, tümör organı platformunun yeniden oluşturulması için varsayılan ikame olmuştur. Bu hayvan modelleri, bulguların zayıf bir şekilde çevrilmesinden dolayı rahatsızdır ve büyük genetik tarama çalışmaları ile tanımlanan insan genetik profillerini çoğaltma yeteneği sınırlıdır. Böylece, iPSC'lerden 3-B sistemlerin geliştirilmesi, insan için gerekli bir katman katma- sını katarHastalık modelleme 13 , 14 . 3D hiPSC platformları için bir sonraki adım, hücre bazlı tahliller kullanılarak yüksek verimli taramada büyük ölçekli gereksinimleri karşılamaktır 15 .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sinirsel Öncü Hücrelerin Üretilmesi

  1. Küçük moleküllü eklenmiş insan iPSC ortamında γ-ışınlanmış bir fare embriyonik besleyici (MEF) hücre tabakasında 6 gözlü plakalarda fibroblastlardan ve PBMClerden türeyen hiPSC'leri muhafaza edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Günlük bakım, daha önce bildirilen 1 , 16 numaralı prosedürlerin değiştirilmiş bir versiyonudur.
    1. 300 μL / iyi önerilen ortamda (üretici protokolünden sonra) 6 oyuklu bir doku kültürü sınıfı plakanın her oyuğuna 6 x 10 5 MEF tabakası yerleştirilir.
    2. 48 saat sonra, hiPSCleri eklemeden önce 1 saat süreyle 300 μL / well hiPSC ortamı ile MEFs ortamını değiştirin.
    3. HİPSC'leri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözülür ve yavaş yavaş damla damla 1 mL hiPSC ortamı ekler. HiPSC'leri ve ortamı 15 mL'lik konik bir tüp haline getirin. Toplam hacmi 5 mL'ye getirmek için orta ekleyin. 129 xg'de 4 dakika boyunca santrifüjleyin, supernata'yı aspire edinNt, hafifçe 1: 1000 konsantrasyonda ROCK inhibitörü ile 1 mL hiPSC ortamda pellet askıya alınız.
    4. MEF hücre tabakası üzerine (tipik olarak 300,000 hücre / oyuk tohumlanmış) hücre süspansiyonu Plate ve 37 ° C'de,% 5 CO2,% 95 nemde inkübe edin.
    5. Işık mikroskopu kullanarak iPSC kültürünü yakından izleyin. 48 saat sonra, pürüzlü kenarlara sahip kültürleri çıkarın, spontan farklılaşmayı en aza indirgemek için ışık mikroskopu altında kistik gibi görünen veya sarımsı kahverengi görünen bir materyal haline gelin.
      NOT: 7-10 gün sonra hiPSC kolonileri oluşmalıdır. Koloniler açıkça tanımlanmış sınırlar ve düzgün hücre yoğunluklarıyla yuvarlak olmalı ve gevşek biçimde paketlenmiş düzensiz hücrelerden yoksun olmalıdır.
    6. Elle kendiliğinden farklılaşmış hücrelerin kültürünü temizlemek için yuvarlak hiPSC kolonileri seçin. Kolonileri taze MEF katmanlarına yerleştirerek genişletin. 1 genişletin: 3 7 günde birleşmeye yakınlaştığı kültürler ve 1, 16 dondurmak zaman.
  2. Genişletme ve hücreleri dondurma (yedekleme için) sonrasında,% 50 - 75 konfluence olana kadar plakalarda hiPSC kolonileri büyütün.
  3. Kaplamadan yedi gün sonra nöral öncül hücre farklılaşması için hiPSC'leri hasat etmek ve hazırlamak için hafif enzimatik muameleyi (300 uL enzim çözeltisi ile 5-10 dakika ve hafif öğütme (1000 ul'lik bir pipetle 2-4 kez) kullanın.
  4. 4 dakika boyunca 129 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin, süpernatantı aspire edin ve pelet 5 mL insan iPSC ortamında tekrar süspansiyon haline getirin. MEF'leri ortadan kaldırmak ve hiPSC verimini en üst düzeye çıkarmak için hücre süspansiyonunu 37 ° C'de 1 saat boyunca% 0.1 jelatin kaplı 5 cm hücre kültürü çanağına aktarın. Ortamı (yapışkan olmayan hücrelerle birlikte) başka bir 5 cm jelatin kaplı çanağa aktarın.
  5. Yapışkan olmayan hücreleri, bir transfer pipeti kullanarak 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. 3 mL ortam ile plakaları hafifçe durulayın ve 15 mL tüpüne ekleyin.
  6. 4 dakika için 129 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin, süper aspiratNatant ve nazikçe pellet orta tekrar süspansiyon haline getirin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını belirleyin. 96-yuva düşük yapışma V-alt plakasında 9,000 hücre / çanağı plakala.
  7. Plakayı 3 dakika 163 xg'de santrifüjleyin. 37 ° C'de inkübe plakası,% 95 nem ve% 5 CO2. Bir pipet kullanarak, orta her yarım kaldırarak ve taze kimyasal olarak tanımlanmış ayırıcı madde 1 (DM1; Şekil 1 ; Malzeme Tablosu) ile 14 gün boyunca değiştirerek% 50 ortamı her gün değiştirin.

2. Serum Free Embriyoid Gövde (SFEB) İndüksiyonu ( Şekil 2 )

  1. 40 μm hücre kültür ekler 6 kuyucuklu plakalar yerleştirin ve agrega eklemeden önce en az 1 saat 1 ml DM1 orta ekleyin.
  2. 14. günde 40 μM hücre kültür eklerine 200 mcL geniş ağız ucuyla 20 μL ortam ile agrega aktarın ve ortamı DM2'ye değiştirin.
    NOT: Hücre kültürü ekleri, kuyunun tabanından hafifçe oturan ve plastik bir çerçeve içine asılmış bir politetrafloroetilen zarfından oluşan uzmanlaşmış eklerdir. Bu membran, biyolojik olarak uyumludur ve en üstte yer alan SFEB'lere besleyici ve oksijen taşınmasını etkili bir şekilde destekleyebilir. Genellikle organotipik hipokampal dilim kültürleri ile fare veya sıçandan alınan 7 , 17 , 18 kullanılır .
    1. 4-6 agregaları bir hücre kültürü insertine aktarın ve agregalar arasında yeterli boşluk bırakın. İnce bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla çözelti çıkarın ( örn. 200 mcL uç).
      NOT: SFEB'yi, SFEB'lerin çevresinden çıkarılan çözelti olarak hücre kültürü girdisi üzerinde hareket edecekleri için kısaca rahatsız etmek kabul edilebilir.
    2. 37 ° C,% 95 nem ve% 5 CO2 de DM2 1 mL kültürleri koruyun. Bir pipet kullanarak,% 75Ortamın dörtte üçünü çıkararak ve ç çeyrekte taze ortamla değiştirerek, iki günde bir öğün. Örneğin, 750 μL ortamı çıkarın ve 750 μL taze ortam ekleyin.
  3. Kültürden 14 gün sonra, her gün% 75 orta değişimli ve 16 gün daha DM3 ortamına geçin.
  4. Hücre kültürü ekinde SFEB'leri 30 günün ötesinde korumak için ortamı her gün 60, 90 ve 120 gün boyunca değiştirin.
    NOT: SFEB'ler yaklaşık 1,000 μm çapa kadar büyür ve tipik olarak 100-150 μm kalınlıktadır 1 .

3. SFEB Bileşimini Belirleme

  1. 200 uL geniş ağızlı pipet ucu kullanarak orta derecede pipetleme aracı ile ekteki SFEB'leri ayırın. SFEB'leri aktarmak için, cesetleri pipet ucuna yavaşça emmek için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanın. SFEB'yi pipetin ucuna yükledikten sonra, hafifçe 12 oyuklu plakalara aktarın ve 300 uL fosfat tamponlu salinle yıkayın(PBS) ilave edin.
    NOT: SFEB'ler, 12 oyuklu plakalarda çözeltiyle süspanse edilir. Bu, fiksatifin, bloke edici çözeltinin ve antikorların tam penetrasyonuna izin vermek için önemlidir. Boyama için birden çok SFEB kullanılıyorsa, bir 12 kuyucuğun kuyucuğuna 10 SFEB eklenebilir. Bu, çözümleri ve antikorları koruyacaktır.
  2. SFEB'leri oda sıcaklığında 30-45 dakika süre ile% 4 paraformaldehit ile oyuk başına 300 mcL ile fikse edin. Sabit SFEB'leri 300 mcL PBS ile iki kez yıkayın, 3-5 dakika her yıkayın.
    Dikkat: Paraformaldehid ile uğraşırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
    NOT: Bu çalışmada nöronları işaretlemek için 1: 500'de tavuk-Tuj1 kullanılmış, ek belirteçler için Tablo 2 ve referanslar 1 , 16'ya bakınız .
  3. PBS'de% 0.1 Triton-X100 ve% 10 normal eşek serumu (engelleme solüsyonu; 300 μ) ile geçirgen hale getirin ve bloke edinL başına) oda sıcaklığında 1 saat süreyle yıkanır.
  4. Bloke edici çözeltiyi çıkartın ve SFEB'leri engelleme çözeltisinde 300 μL birincil antikorlarla muamele edin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. SFEBs% 0.1 Triton-X içeren 300 uL PBS içinde yıkama (yıkama başına 3-5 dakika) yıkayın.
  5. Bloke edici çözeltide 1: 1000 sekonder antikorları hazırlayın. SFEB'leri ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. SFEB'leri 300 uL PBS ile yıkayın, her biri 3-5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    NOT: Bu aşamada, SFEB'ler görüntüleme için hazırlanabilir.
  6. Görüntü için, SFEB'leri geniş gözenekli bir pipet kullanarak cam slayt üzerine pipetleyin. Nazik emme ile fazla miktarda SFEB çözeltisini çözün.
    NOT: Benzer boyama koşulları için, aynı cam slaydına birden çok SFEB yerleştirilebilir.
  7. SFEB'lere bir damla montaj aracı ekleyin, cam bir lamel yerleştirin ve hava kabarcıklarının bulunmadığından emin olmak için hafifçe bastırın. Montaj maddesinin sertleşmesine izin verin ve görüntüleme ve ölçmeye geçin (adım 3.8).
    NOT: Montaj ortamı sertleştikten sonra, SFEBler görüntüleme için hazırdır.
  8. SFEB boyunca birden fazla ilgi alanı (ROI) alarak ve referanslar 1 , 16'da açıklandığı üzere standart bir konfokal mikroskopta her bir ROI boyunca maksimum bir projeksiyon görüntüsü ile birlikte bir z-yığını kullanarak hücre kantifikasyonu uygulayın.
    NOT: Tüm SFEB'ler, görüntü tabanlı fayans kullanılarak nicelendirilebilir (ayrıntılar için referans 1 , 16'ya bakın). SFEB'ler yaklaşık 100 μm'ye incelttiği için, dokuda ışığın çok az dağılması vardır ve bu nedenle 2-foton mikroskopisine gerek yoktur. Bu protokolün fibroblasttan türeyen iPSC'ler ile daha önce kullanıldığı durumlarda SFEB kaderi haritası üretildi ve SFEB kaderi haritası CGE ve ön ön beyin kaderini andıran 1 , 16 nolu transkripsiyonel kimliklerle birlikte interneuronların alt popülasyonlarıyla kompleks ve çeşitli yapı ortaya koydu .

ÇÇA'ları Kullanan SFEB'lerde Nöronal Aktivitenin Kaydedilmesi

  1. Üreticinin talimatlarına göre 12 oyuklu MEA plakaları hazırlayın.
  2. MEA plakalarını temizlemek için steril H 2 O ile aseptik koşullar altında 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Plakayı sterilize etmek için% 75 etanolle 5 dakika yıkayın ve daha sonra% 100 etanolle yıkayın.
  3. Sterilizasyon işlemini tamamlamak için plakayı fırında 50 ° C'de 4-5 saat pişirin.
  4. Her göze 500 μL% 0.2 polietilenimin çözeltisi (PEI) ilave edin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. PEI'yı aspire edin ve kuyucukları steril damıtılmış H 2 O ile 4 kez yıkayın. Havadaki kapanır hava kuruması.
  5. L15 ortamda bir 20 mcL / mL laminin çözeltisi hazırlayın ve her bir kuyunun merkezine 10 mcL laminin ekleyin.
    NOT: Çevredeki referans ve topraklama elektrotlarını kaplamayın.
  6. Orta veya laminin buharlaşmayı önlemek için çevre rezervuar steril dH 2 O ekleyin.Plakayı 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  7. Laminin kaplı MEA plakalarına SFEB'leri (bkz. Bölüm 1 ve 2) geniş bir ağızdan pipet ucu içine yavaşça emerek ve aktararak ekleyin. Her bir kuyu için 200 uL DM2 ortamı ilave edin ve 37 ° C'de,% 95 nem ve% 5 CO2 ile bir gece boyunca inkübe edilir.
  8. 24 saat sonra ek bir 200 μL orta ekleyin ve plaka okumadan önce 37 ° C,% 95 nem,% 5 CO 2 30 dakika için kurtarmak için izin.
  9. Nöronal aktivite kaydetmek için MEA plakasını plaka okuyucusuna (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) yerleştirin. İlgili MEA kayıt yazılımı ile 10 dakika etkinliği kaydedin. Ayrıntılar için referans 19'a bakın.
  10. Ham veri üretmek - istatistiksel analiz yazılımı kullanarak sürekli akıntılar ve nöronal aktivitenin raster çizelgeleri 19 .
    NOT: MEA kayıtları SFEB kaplamasından 7 gün sonra çekilir. Bu çalışma için, ağ burst aktivitesini tespit etmek için kayıtlar 10 dakika süreyle alındı;Ardışık iz ve raster araziler. SFEB'ler MEA plakalarında uzun süre muhafaza edilebilir ve çevreyle kontrol edilen koşullar kullanarak daha uzun süreler boyunca kaydedilebilir ( Şekil 6 ).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekniğimiz kullanılarak yetiştirilen SFEB'ler, geniş Tuj1 pozitif nöronların yanı sıra sinir öncüleri ile dolu erken gelişimsel bir kortikal subventriküler bölgeye benzeyen morfolojik özelliklere sahip doku üretmiştir ( Şekil 3A ). SFEB'nin dış katmanlarında ve iç katmanlarında çok sayıda gelişmekte olan korteks rozet gözlenmiştir ( Şekil 3B ). SFEB'nin dış kenarı, postmitotik nöronlar içeren gelişmekte olan bir korteks plakasın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, bir hiPSC kaynağının frontal korteksin erken gelişim evresini yineleyen 3 boyutlu bir yapıya ayırma koşullarını sağlar. Bu prosedür, aynı zamanda mikroskopi yapılmaya elverişli olan elektrofizyoloji için sorgulanabilen yapılar üretir. SFEB'nin son morfolojisi, organotipik beyin dilim kültürlerine benzemekte ve yüksek kaliteli ayrıntılı konfokal görüntülemeye olanak sağlamaktadır. Bu protokol, hem fibroblast hem de periferik-kan mononükleer hücre kaynaklı hiPSC'lerden başarıyla SFEB'...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların rekabette finansal çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makaleyi düzeltmek için Elizabeth Benevides'e teşekkür ediyoruz. Dr Dr teşekkür ederim. John Hussman ve Gene Blatt'ın yararlı tartışmaları ve yorumları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SFEB Nöronal Farklılaşma Hücre kültürü Ortamı. Reaktif. Bileşenler 
STEMdiff Nöral İndüksiyon Ortamı (hiPSC Ortamı)STEMCELL Teknolojileri0-5835250 mL
PluriQ ES-DMEM Ortamı (MEF Ortamı)GlobalStemGSM-2001
NameCompany  Katalog NumarasıComments
DM1 Medya Bileşenleri
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax sıvı, 1: 1Invitrogen10565018385 mL
Nakavt Serum Değiştirmeİnvitrojen10828028%20 100 mL
Kalem/Strepİnvitrojen151401225 mL
Glutamax 200 mMİnvitrojen35050061 5 mL
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi 10 mM (100x), sıvıInvitrogen111400505 mL
2-Merkaptoetanol (1.000x), sıvıİnvitrojen21985023900 & mu; L
NameCompany  Katalog NumarasıComments
DM2 Medya Bileşenleri
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax sıvı, 1:1Invitrogen10565018500
mL Glutamax 200 mMInvitrogen35050061 5 mL
Pen/StrepInvitrogen151401225 mL
N-2 Takviyesi (100x), sıvıİnvitrojen1750204810 mL
AdıCompany  Katalog NumarasıComments
DM3 Medya Bileşenleri
NEUROBAZAL Ortam (1x), sıvıInvitrogen21103049500 mL
B-27 Takviyesi Eksi A Vitamini (50x), sıvıInvitrogen1258701010 mL
Glutamax 200 mMInvitrogen350500615 mL
Pen/StrepInvitrogen151401225 mL
Name<strong>Company  Katalog NumarasıComments
Küçük Moleküller
ThiazovivinStemgent04-00172 & mu; M
SB431542Stemgent04-0010-101:1.000 (10 μ M)
DorsomorfinStemgent04-00241 μ M
LDN-193189Stemgent04-0074-10250 nM
Y27632 (ROCKi)Stemgent04-0012-1010 μ M
NameCompany  Katalog NumarasıComments
Rekombinant Protiens
DKK-1Peprotech120-30200 ng/mL
NameCompany  Katalog NumarasıComments
Components/Materials
Cell Culture ekleri 0.4 & mu; M, 30mm ÇaplıMillicellPICM0RG50
Fare Embriyonik FibroblastlarGlobalStemGSC-6301G
96 kuyulu V alt w / KapaklarEvergreen222-8031-01V
StemPro Accutase Hücre Ayrışma ReaktifiThermoFisherA1110501
TritonX-100ThermoFisher85111
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)ThermoFisher10010023500 mL
Normal Eşek SerumuJackson Labs017-000-121
Leibovitz'in L-15 Orta BoyThermoFisher11415114500 mL
DRAQ5 (Nükleer İşaretleyici)ThermoFisher65-0880-96
MEA PlakalarıAxion BiosystemsM768-GL1-30Pt200
6 kuyulu düz tabanlıFalcon353046
NameCompany  Katalog NumarasıComments
>Antikor
NestinMillipore MAB5326
Brn-2Protein teknolojisi14596-1-AP
VGLUT1Sinaptik Sistemler135 303
Pax6abcamab5790
kalretininabcamab702
Calbindinabcamab11426
CoupTFII R& D SistemleriPPH714700
Nkx 2.1abcamab12650
Tuj1abcamab41489
ReelinMilliporeMAB5364
Tbr1MilliporeMAB2261
NFHDakoM0762

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
  2. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  3. Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
  4. Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
  5. Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418(2014).
  6. Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547(2014).
  7. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  8. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
  9. Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
  10. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  11. Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
  12. Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
  13. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
  14. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  15. Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
  16. Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
  17. Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
  18. Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
  19. Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
  20. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  21. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  22. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  23. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  24. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  25. Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
  26. Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223(2015).
  27. Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
  28. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  29. Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910(2012).
  30. Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Serumsuz Embriyoid Cisimnsan iPSC Diferansiyasyonu3D K k H cre K lt rKortikal Geli im Modeliok Elektrotlu Dizi KaydKalsiyum G r nt leme DeneyiN ral A Olu umuK k H cre Mark r AnaliziD k Adhezyonlu K lt r

İlgili makaleler