Yöntem makalesi

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

DOI:

10.3791/55800

⸱

7 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood (COPSAC), Herlev and Gentofte Hospital, University of Copenhagen, 2Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı için üst solunum yolları rahatsız edilmeden Mukozal astar sıvı örnekleme invaziv olmayan bir teknik anlatılmaktadır. Vivo düzeyleri sitokinler ve kemokinler, gibi protein arabulucu miktar her yaştan bireylerde gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı rahatsız edilmeden üst solunum yolu Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme açıklar. Ayrıca sıvı eluates bağışıklık arabulucu analizini önce (genellikle diğer teknikleri tarafından kullanılan) stimülasyon yordamlar için gerek kalmadan havayolu topikal bağışıklık imza çalışma için kullanılan ayıklama yordam ayrıntıları. Mukozal astar sıvı bir şerit filtre kağıdı üzerindeki örneklenir alt konka ve emme 2 min için sol ön kısmına yerleştirilmiş. Analitlerin filtre gazetelerden eluted ve ayıklanan protein bazlı eluates düşük ve yüksek seviye analitler aynı örnek içinde yüksek-duyarlı miktar için izin veren bir electrochemiluminescence tabanlı immunoassay tarafından incelenir. Biz 20 önceden seçilmiş bağışıklık arabulucu yolları üst solunum yolu mukozasında sinyal belirli bağışıklık ile ilgili vivo içinde düzeyleri ölçüldü, ama tekniği o belirli paneli veya örnekleme sitesine sınırlı değildir. Bu teknik ilk 7 yaşındaki çocuklarda astım üzerine Kopenhag prospektif çalışmalar çocukluk2000 (COPSAC2000) kohort alerjik rinit ile uygulanmıştır. Bundan sonra 1 ay, 2 yıl ve 6 yaşın ve akut solunum yolu semptomları örneklerini örneklenmiş boyuna COPSAC2010 doğum kohort, kullanıldı. Biz başarıyla elde edilen ve 620 (% 89) 700 1 aylık çocukların örnekleri analiz; (Medyan (arası DÖRTTEBİRLİK aralığı (IQR)) bildirdi. tahlil algılama sınırın altındaki birkaç edildi Her aracı için (Yani 0 algılama alt sınırı için set noktasına) algılama sınırın altındaki örnekleri sayısı 29 (7.25-119.5) oldu. Bu teknik doğum içinde vivo hava yolu Mukozal bağışıklık profilden miktar sağlar, boyuna uygulanabilir ve çalışmalar genetik ve gençliği çevre pozlama, patofizyolojisi, endotyping ve solunum yolu hastalıkları ve geliştirme ve roman therapeutics değerlendirilmesi izleme etkisi üzerinde uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burun Mukozal astar sıvı üst hava yolu sistem sıvı kısmını yukarı yapar. Epitel ve mikroorganizmaların istila karşı savunma ilk satırı oluşturan bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi türetilen arabulucu karmaşık matris oluşur. Nazal mukoza kolayca erişilebilir ve burun ve bronşlar1arasında güçlü bir işlevsel ve immünolojik ilişkisi. Bu bölümü çocukluk, astım ve alerjik rinit gibi aynı zamanda diğer solunum bozukluğu daha sonra hayatında daha yaygın bir dizi ortak olan solunum yolu hastalıkları ile ilgili olarak özel ilgi var.

Burada, örnek Mukozal burun boşluğuna sıvı astar bir filtre kağıt tabanlı, noninvaziv teknik yanı sıra bir sonraki çıkarma yordamı kullanarak, protein bazlı analitler filtre kağıtları önce onların miktar üzerinden elute için kullanılan bozulmamış bir yöntemin uygulanması açıklanmaktadır. Bu teknik, vivo sağlıklı bireyler ve bireylerin çeşitli solunum yolu hastalıkları ile bağışıklık imzaları elde etmek için kullanılabilir. Ayrıca, belirli bir bağışıklık imza için önemli Etkilenmeler incelemenize ve predictor veya aracı daha sonra hastalığı gelişme ise değerlendirmek mümkündür.

Mukozal astar sıvı daha önce nazal lavaj2kez bir burun meydan okuma testi ile nerede bir alerjen bir enflamatuar yanıt3,4uyarmak için yüksek seviyelerinde tanıtıldı önce gelmelidir tarafından elde edilmiştir. Ancak, nazal lavaj teknik genç çocuklarda mümkün değildir ve sonuçlar düzeyleri tahlil5algılama sınırın altına düşebilir seyreltilmiş aracı olarak zihnimi karıştıran bir bilinmeyen seyreltme faktörü tanıttı. Ayrıca, bilinmeyen seyreltme faktörü nedeniyle burun meydan okuma testleri ölçülen analit yanıtlarını bireyler, böylece burun lavaj tekniği ayarlama bir kohort kullanışlılığı sınırlayarak arasında karşılaştırılabilir değildir. Son olarak, alerjen meydan yalnızca duyarlilasmis bireylerde geçerlidir ve histamin sorun gibi başka sorunlar fizyolojik ilgili, potansiyel olarak arabulucu yayın tavan etkisi neden değildir. Bu sorunların sıvı ve analit düzeyleri bireysel salgı arası tek tek farkı etkileyen faktörler nerede Mukozal astar sıvı koleksiyonu için sunulan filtre kağıt tabanlı teknik hile.

Ayıklama işlemi sırasında analitler için tüm örnekleri özdeş birimi arabelleği eklenmesinden sonra filtre gazetelerden eluted. Bu tüm örnekleri benzer ex vivo seyreltme tercih eder. İzotonik tuz solüsyonu albümin tabanlı bir ayıklama arabellek ayıklama adım için kullanılır; Bu protein bazlı arabulucu çıkarma sağlar ve protein miktar önce eluted proteinlerin sonraki donma sırasında denatürasyon sınırlamak için stabilize. Ekstraksiyon aşamasında protein yıkımı önlemek için proteaz inhibitörleri bir kokteyl ayıklama arabelleğe eklenir.

Rahatsız edilmeden vivo içindemiktar için izin teknikleri uygulanması-Mukozal sitelerinde oluşturulan bağışıklık arabulucu olduğunu çok önemli. İlk olarak, vücudun en büyük immünolojik organ Mukozal sitesi oluşturur. İkincisi, burun konum birincil site hava maruz kalma ve1akciğerler solunum immünolojik yuvası için sıkı bir şekilde bağlı. Üçüncü olarak, bu önemli organ invaziv olmayan bir teknik ile ölçme imkanı olasılığı sağlık ve hastalığında solunum yolları ile ilgili olarak önemli mikrop-bağışıklık etkileşim ekseninde bir bolluk bilgi sağlamak için açılır. Dördüncü, bu tekniğin randomize, kontrollü çalışmalarda yerel immünolojik değişiklikler uyuşturucu ve mikro eğitim gibi diğer birçok olası uygulama vardır.

Biz başlangıçta teknik astım tarihinde Kopenhag prospektif çalışmalarda çocukluk2000 (COPSAC2000) kohort Mukozal astar sıvı sağlıklı kontrol13karşı alerjik rinit ile 7 yaşındaki çocuklarda bağışıklık profil belirlendiği yerde, hayata. Daha sonra biz başarılı bir şekilde bu teknik boyuna COPSAC2010 kohort ve biçilen hava yolu bağışıklık profilleri için 1 ay, 2 yıl ve 6 yaşın ve akut solunum yolu semptomları örneklerini uygulanır. Sonuçlar 1 aylık Yenidoğan Bebeklerin bağışıklık imza ve gençliği çevre pozlama7,8,9,10,11,12arasındaki önemli ilişkileri gösterdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Helsinki Deklarasyonu yol gösterici ilkeler doğrultusunda çalışmalar yapılmıştır. Etik Komitesi (KF 01-289/96 COPSAC2000 için) ve H-B-2008-093 COPSAC2010için Kopenhag ve Danimarka veri koruma ajansı için onayları elde edilmiştir ve her iki ebeveyn kayıt önce her konunun üzerinden yazılı Onam alındı.

1. deneysel Kur

  1. Adet filtre kağıt kullanın (fibröz hydroxylated-polyester sayfaları, bkz: Malzemeler tablo)6,7.
    1. Kesip şeritler 3 x 15 mm 1 aylık çocuk için boyutu ve L şekil büyük çocuk ve yetişkinler (5 x 20 x 10 mm (m kısa kol)).
  2. Bir filtre kağıt parçası forseps kullanarak bir bebek her burun yerleştirin. Filtre kağıdı alt konka (yaklaşık 1 cm içinde Yenidoğan Bebeklerin burun ve diğer tüm yaş için 1,5 cm) ön kısmına yerleştirin.
    1. Yenidoğan Bebeklerin bir yatağa yerleştirin ve konfor için şekerli su verin.
      Not: diğer tüm yaş çocuklar için örnekleme en kolay bir sandalyeye oturmuş konu ile gerçekleştirilir.
    2. Büyük çocuklar için L şeklindeki filtre kağıdı uzun kolu her burun yerleştirin.
  3. Bir burun kıskacı rahatsızlık en aza indirmek için ve filtre kağıdı yanlışlıkla kaybedilmesini önlemek için burun delikleri çevresinde geçerli.
  4. Filtre kağıtları emme 2 dk sonra kaldırın.
  5. Filtre kağıtları etiketli tüplerde yerleştirin ve bunları hemen-80 ° C'de dondurmak
  6. Herhangi bir çocuk tarafından gösterilen örnekleme gününde hava yolu enfeksiyonu belirtileri not edin.
  7. Tüm hapşırma, sürekli ağlayan veya örnekleme sırasında 2 dk oluşur epistaksis kaydedin.

2. hava yolu bağışıklık-arabulucu miktar

  1. En çok 10 rasgele örnek dondurucudan almam. Kaydın kimlik numarası. Buz üzerinde örnekleri tüm çalışma işlemi sırasında tutmak.
  2. Buz çözdürme sonra filtre kağıtları (her konu) her iki burun delikleri 300 bırakın µL taze hazırlanmış, tampon (bkz: Malzemeler tablo) içeren bir tam proteaz inhibitörü tablet ( Tablo reçetesigörmek) arabelleği 25 mL başına.
    1. Arabellek filtre kağıt boyutuna göre ses düzeyini ayarlayın.
      1. 300 µL arabellek filtre kağıtları 3 x 15 mm boyutunda için kullanın.
      2. Sadece bir filtre kağıdı varsa, yarım arabellek birim (150 µL) kullanın.
  3. Örnekleri bir plaka shaker (400 d/d) 5 dk. kullanım için bir zamanlayıcı aktarın.
  4. Nemli filtre kağıtları ve tahlil arabellek selüloz asetat tüp filtre (0,22 µm gözenek boyutu) bir microcentrifuge içinde yer fincan içine transfer ( Tablo reçetesigörmek) tüp.
  5. 16.000 x g 5 dakika içinde soğutmalı santrifüj (4 ° C'de) için filtre uygulanmış burun hulâsa tüp içinde elde etmek için santrifüj kapasitesi.
  6. Fincan kaldırın ve buz aliquoting süre tüpler burun özü düşük proteinli bağlama depolama tabak ( Tablo reçetesigörmek) kuyu tutun.
  7. -80 ° C'de analiz kadar saklayın.
  8. Sitokinler ve yüksek-duyarlı, electrochemiluminesce tabanlı çoğaltılmış array sistemi kullanılarak nazal özleri kemokinler konsantrasyonları belirleyin (bkz. Tablo malzeme).
    Not: İnsan 10-plex TH1/TH2 sitokin tahlil, 9-plex Kemokin tahlil ve tek-plex IL-17A, TGF-β1 ve TSLP burada yapıldı.
    1. Gecede 4 ° C'de burun özleri deneyleri için kuluçkaya (Bkz. Tablo reçetesi) standart üretici protokol gibi ölçümleri yapmak.
      Not: Uzun ( Tablo reçetesigörmek) genellikle yüksek dinamik aralık 1 arasında değişen ölçüm için var & 10.000 pg/mL, ama bazı deneyleri için 100.000 pg/mL olabilir. Bu tüm örnekleri, diğer benzer uzun olduğu gibi böylece bireylerde sağlıklı ve hastalıklı birbirine benzemeyen dilutions etkisini sınırlama aynı seyreltme çalıştırılabilir anlamına gelir. Tüm sitokinler için algılama alt sınırı 1 pg/mL ya da daha az ve kemokinler için 1 arasında değişmektedir & 50 pg/mL. TSLP 1 ayda örnekleri % 98'i içinde tespit değildi.

3. istatistik

  1. Günlük-analiz sitokin ve Kemokin düzeyleri normal dağılım kalıntıları elde etmek için önce verileri dönüştürme.
  2. Eğer birden fazla toplu iş iş işlemde örnekleri analiz edilir, batch-wise günlük dönüştürülmüş veriler üzerinde merkezleme için sitokin ve Kemokin verileri düzeltmek.
    1. Genel ortalama ve özgün ölçü birimleriyle verileri elde etmek için anti-günlük dönüştürme dahil.
      Not: yapılan analizler her dizi için sitokinler ve kemokinler düzeyini etkileyen değişkenleri ayarlama göz önünde bulundurun. Bu anne etkileri (Örneğin, alkol tüketimi ve hamilelik sırasında sigara), emzirme, istenmeyen olaylar olabilir örnekleme, kardeşler, pets içinde ev, vb sırasında

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hava Yolu Bağışıklık Profillerinin Temel Özellikleri:
COPSAC2010


Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan tekniği ile biz çocuk için 1 ay daha önce bitmiş değil yaş gibi erken vivo içinde üst hava yolu Mukozal bağışıklık profilinde belirlemek başardık. Biz o varlığı belirli hava yolu bakteri ve picornaviruses7,11, yanı sıra diğer öncesi ve perinatal Etkilenmeler, Yenidoğan Bebeklerin hava yolu bağışıklık profilinde yansıtılmış gözlenen. Ayrıca, biz bu hava yolu bağışıklık profil verileri bir randomize mikro besin deneme yüksek doz vitamin d et...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar hiçbir potansiyel, algılanan ya da gerçek çıkar çatışması bu yazının içeriği ile ilgili olarak ilan ediyorum. Finansmanı kuruluşları tasarım ve çalışma yürütülmesi herhangi bir rolü yoktu; toplanması, yönetim ve verilerin yorumlanması; veya hazırlık, gözden geçirme ve onay şekilde alt alta yazılmalıdır. Hiçbir ilaç firması çalışmaya dahil.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz çocuklar ve ailelerine COPSAC2010 kohort çalışmanın tüm destek ve bağlılık için minnettarlığımızı. Biz kabul ve COPSAC araştırma ekibi ve teknisyen Lisbeth Buus Rosholm, Danimarka Teknik Üniversitesi, teknik yardım sitokinler ve kemokinler ölçüm için benzersiz çaba için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lifli hidroksillenmiş polyester levhalarAccuwik Ultra SPR0730Filtre kağıdı
Milliplex Test Tamponu MilliporeL-ABTampon
Düşük proteinli bağlayıcı saklama plakaları Thermo ScientificCLS8161Plakaları
Proteaz İnhibitörüRoche11873580001komple EDTA içermeyen Proteaz İnhibitörü
Çok noktalı plakaların kokteyl okuyucusuMesoscaleNASektör görüntüleyici 6000
Tahlil Orta Ölçekliİnsan 10-pleks TH1/TH2 sitokin testi ve 9-pleks kemokin tahlili ve singlepleks IL-17A, TGF-β 1ve TSLP. Bir açıklama çevrimiçi olarak şu adreste bulunabilir: www.mesoscale.com

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
  2. Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), Supplement 414-441 (2005).
  3. Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
  4. Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
  5. Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
  6. Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
  7. Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
  8. Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
  9. Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
  10. Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700(2013).
  11. Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
  12. Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
  13. Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
  14. Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
  15. Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
  16. Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
  17. Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
  18. Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mucosal Lining FluidUpper AirwayImmune Mediator QuantificationNoninvasive SamplingFilter Paper AbsorptionElectrochemiluminescence ImmunoassayNasal Extract AnalysisProtease Inhibitor SupplementLow Protein Binding StoragePediatric Respiratory Diseases

İlgili makaleler