Orta Ölçekli Hazırlanışı Drosophila Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Özet

Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).

Özet

Protein-protein etkileşimlerinin analizi (PPI'ler) hücre sinyalleri, organizma gelişimi ve hastalık gibi biyolojik süreçleri ve mekanizmaları incelemek için vazgeçilmez bir yaklaşım haline geldi. Etkileşim ağlarının en doğal ve yansız görüntüsünü elde etmek için genellikle in vivo materyal kullanılarak PPI bilgisini elde etmek istenir. Meyve sinekleri Drosophila melanogaster , PPI'ları in vivo olarak incelemek için mükemmel bir platformdur ve kendisini biyokimyasal deneyler için materyali izole etmek için doğrudan yaklaşımlara borç verir. Özellikle, meyve sineği embriyoları, hayvanları bu gelişim aşamasında toplama kolaylığı ve proteinlerin çoğunluğunun embriyogenezde eksprese edilmesi nedeniyle PPI'ları incelemek için uygun bir doku türü temsil eder ve böylece çoğu PPI'yı ortaya çıkaracak uygun bir ortam sağlar. Burada orta büyüklükte (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması için bir protokol sunmaktayız ki bu geniş bir aralık için ideal bir miktardırAfinite saflaştırma-kütle spektrometresi (AP-MS) ile PPI'lerin analizi de dahil olmak üzere proteomik uygulamalar. Herhangi bir laboratuarda kolaylıkla ve ucuza kurulabilen embriyo koleksiyonları için 1 L ve 5 L kafesler için tasarımlarımızı açıklıyoruz. Ayrıca, AP-MS gibi aşağı akışlı uygulamalarda doğrudan kullanılabilen lizat üretmek için embriyo toplama ve protein ekstraksiyonu için genel bir protokol de sunuyoruz. Hedefimiz, tüm araştırmacılar için PPI analizlerini in vivo gerçekleştirmek için erişilebilir bir araç sağlamaktır.

Giriş

Genetik ekranlar ve daha yakın zamanda genomik yaklaşımlar biyolojik fonksiyonların incelenmesinde devrim yarattı. Bununla birlikte, önemli hücresel bilgiler, proteinlerde ve etkileşen ortakların topluluğunda kodlanır. Geleneksel genetik modifikatör ekranlar hız sınırlayıcı yol bileşenlerini belirleyebilir ve dolaylı etkileşimleri geri kazanabilirken, proteomik yaklaşımların gücü, ilgilenilen proteinlerin tam derhal etkileşim ağı tanımlama yeteneğinde yatar. Proteomik biyolojik sistemleri incelemek için dolayısıyla değerli ortogonal bir yöntemdir ve genomik, transkriptomikler ve geleneksel genetik ekranları tamamlar. Afinite saflaştırma-kütle spektrometresi (AP-MS), protein-protein etkileşimlerini (PPI'ler) kendi doğal ortamlarındaki hücreler ve dokularda ^{1 , 2} çalışmak için güçlü bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır. Bu yöntem, spesifik gelişimde doğrudan veya dolaylı etkileşimlerin tanımlanmasına izin verir.Çeşitli aşamalardaki çeşitli PPI'leri tanımlamak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır (referans ^1'de gözden geçirilmiştir). ÜFE çalışmalarının tartışılmaz bir başarıya rağmen, çoğu ilginç "yem" proteinlerinin aşırı eksprese edildiği kültür hücrelerinde gerçekleştirildi. Hücre kültüründe ÜFE'nin incelenmesi ile ilgili iki konu vardır: Birincisi, belirli bir hücre hattı, belirli proteinlerin ekspresyon eksikliği nedeniyle etkileşimleri tam olarak tamamlayamayabilir. İkincisi, bu tür analizlerde genellikle yüksek aşırı ifade, protein hatalı katlama veya sahte pozitif etkileşimlerin belirlenmesi gibi artefaktlara yol açabilir.

Bu sınırlamaların her ikisi de PPI'ları in vivo olarak analiz ederek üstesinden gelinebilir. Bu deneylerde sınırlayıcı bir adım, protein komplekslerinin saflaştırılması için başlangıç ​​materyalinin bulunmasıdır. Drosophila melanogaster uzun zamandır fonksiyonel analize yönelik bir model olarak kullanılmıştırSis ve son zamanlarda in vivo PPI'ları incelemek için mükemmel bir sistem olduğu da gösterildi. Drosophila embriyogenezi, PPI'ları incelemek için özellikle cazip bir doku türünü temsil eder, çünkü embriyolar büyük miktarlarda kolayca toplanabilir ve ayrıca çoğu gen (>% 88) embriyogenesis boyunca eksprese edilir, bu nedenle alakalı algılama için zengin bir in vivo ortam sağlar ÜFE ³ .

Geleneksel olarak, sineklerdeki biyokimyasal çalışmalar, işlevsel transkripsiyonel lizatları ^{4 ,} 5'in saflaştırılması için gerekli olanlar gibi çok büyük ölçekli embriyo koleksiyonlarını (100-150 g) kullandı. Drosophila'daki önceki AP-MS çalışmalarında tandem afinite saflaştırması (TAP) gibi iki aşamalı bir saflaştırma yaklaşımına dayanan ve her adımda ilişkili malzeme kaybıyla ⁶ büyük miktarda embriyoya ihtiyaç duyulmuştur (5-10 g). Geniş amounBaşlangıçtaki materyalin ts'ı, (ticari olarak satın alındığında) hem pahalı, hem de ^{7 , 8 , 9'un} bakım ve temizlenmesi için zaman alıcı olan büyük popülasyon kafeslerinde embriyo koleksiyonlarının kurulmasını gerektiriyordu.

Tek aşamalı afiniteli saflaştırma yaklaşımlarının geliştirilmesindeki son gelişmelerin yanı sıra, kütle spektrometrelerinin artan duyarlılığı, gerekli miktardaki başlangıç ​​maddesini büyüklük sırasıyla azaltmıştır. Streptavidin-bağlayıcı peptit (SBP) veya yeşil floresan protein (GFP) gibi etiketleri kullanarak ve 1 g'dan daha az embriyondan başlayarak, yem proteininin miktarlarını ve tanımlama için yeterli olacak şekilde etkileşen bileşenleri izole etmek mümkündür. Kütle spektrometresi ^{10 , 11} .

Burada sunulan protokolün amacı, araştırmacılara aşırı derecede yardımcı olmaktır.Bana in vivo PPI'ların biyokimyasal analizine algılanan bir engel. Bu amaçla, orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarını toplamak için basit ve ucuz bir prosedürü takiben AP-MS veya başka yaklaşımlarla daha sonraki analizler için uygun tam hücre proteini özütlerinin bir aşamalı hazırlanması izlenmektedir . Metodumuz, herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca üretilebilen, özel olarak hazırlanmış 1-L veya 5-L popülasyon kafeslerinin kullanımına dayanır. Ayrıca burada sunulan ekstraksiyon koşulları hem kültürlenmiş hücreler hem de in vivo ^{10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17'de} yapılan birçok çalışmada doğrulanmıştır.

Protokol

1. 5 L Fly Kafes Hazırlığı (15 cm Tabaklara Sığdırmak İçin)

1. Gerekli malzemeleri elde edin: 5-quart (4.7-L) kapaklı kap ( Şekil 1A ), naylon örgü ve traş bıçağı.
2. 12 cm çapında bir daire işaretleyin ve tıraş bıçağı kullanarak kabın altındaki bir deliği kesin ( Şekil 1B ). Kapakta 15 cm çapında bir delik açın ( Şekil 1C ).
3. Naylon ağları 25 x 25 cm karelere kesin.
4. Örgüyü kabın üst kenarına yerleştirin ve kapakla aşağı bastırın ( Şekil 1C ). Örgü sıkı olduğundan ve kapağın eğik olmadığından emin olun. Kafes sineklerle doldurulmaya hazırdır (5.3. Adıma bakınız).

2. 1 L Sinekli Kafesin Hazırlanması (10 cm Tabaklara Sığdırmak İçin)

1. Gerekli malzemeleri elde edin: Elektrikli bir matkap, 76 mm (3 inç) bir kesici alet ( Şekil 1E ve FŞekil 1F), düz kenarlı 1 L kapaklı bir plastik kavanoz, naylon örgü, traş makinesi bıçağı, zımpara kağıdı, gözlük ve iş eldivenleri.
2. Alttaki 3 inç (76 mm) delik ve plastik kavanozun kapağını ( Şekil 1G ) kesin ve delik açarken kapağı sıkıca vidalanarak kullanın. Bir delik açmaya başladığınızda kesme aletini çemberin ortasına yerleştirin.
   Dikkat: Bu adım esnasında gözlerin korunması ve eldiven kullanın.
3. Deliklerin kenarlarını tıraş bıçağı ve zımpara kağıdı ile pürüzsüzleştirin.
4. Naylon ağları 18 x 18 cm karelere kesin.
5. Örgüyü kavanozun üst kenarı üzerine yerleştirin ve kapağı vidalayarak sıkın ( Şekil 1G ). Örgü sıkı olduğundan ve kapağın eğik olmadığından emin olun. Kafes sineklerle doldurulmaya hazırdır (5.3. Adıma bakınız).

3. Elma Suyu (AJ) Tabaklarının Hazırlanması

1. 2 L'lik bir şişeye 19 g agar ve 1 L 18.2 MΩ · cm su ekleyin.Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve kısaca karıştırın.
2. Otoklavda 30 dakika süreyle. Bu arada,% 100 elma suyu konsantresini dondurulmuş stoktan özün ve etanolde 10 mL% 10 (ağırlık / hacim) metil 4-hidroksibenzoat çözeltisi hazırlayın.
3. Otoklavdan sonra agarı bir karıştırma plakasında karıştırmaya başlayın ve 80 mL% 100 elma suyu konsantresi ve 10 mL% 10 (ağırlık / hacim) metil 4-hidroksibenzoat çözeltisini şişeye ekleyin. Sabit karıştırma ile oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
4. Her çanakta bulunan agar seviyesinin yaklaşık 5 mm kalınlığında olması için 15 cm petri kaplarını (5 L kafesler için) veya 10 cm petri kaplarını (1 L kafesler için) boşaltın. Oda sıcaklığında katılaşmaya ve plastik torbalara sarılmaya bırakın. AJ plakaları 4 ° C'de iki hafta saklanabilir.
   Not: Petri tabakları yıkanabilir ve tekrar kullanılabilir.
5. Islak maya yapıştırın hazırlayın: Kolayca karıştırılmasını sağlayacak bir kapaklı, 100 mL'lik bir kap içine bir miktar aktif kuru maya dökün ve karıştırırken az miktarda su ilave edin, ancak kalın ama iyice karıştırılmışyapıştırmak. 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.

4. Liziz Reaktiflerinin Hazırlanması

1. 5x liziz tamponu hazırlayın: 250 mM Tris pH 7.5,% 25 gliserol,% 1 oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanol (IGEPAL CA-630), 7.5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3V04.
   1. 200 mL yapmak için: 1 mL NaF tozu ve 184 mg Na3VO4 tozu sürekli olarak karıştırılarak 71 mL suda tamamen çözünür. 50 mL 1 M Tris pH 7.5, 2 mL% 100 IGEPAL, 1.5 mL 1 M MgCI2 ve 25 mL 5 M NaCl ilave edin. Daha sonra 50 mL gliserol ilave edin (son ekleyin) ve 1 saat karıştırmaya devam edin.
   2. Filtre-250 mL'lik filtre üniteleri kullanarak sterilize edin. Bu adım yavaş olabilir, ancak çözeltinin filtrelenmesi çözülmeyen parçacıkların giderilmesi için önemlidir. 50 mL'lik tüpler içinde 10 mL'ye bölün ve -80 ° C'de saklayın.
2. Su içinde 1 M dithiothreitol (DTT) çözeltisi hazırlayın. -20 ° C'de 1 mL'lik alikotlarda saklayın.
3. Proteini elde etAse inhibitörü kokteyl tabletleri, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile. 4 ° C'de saklayın.
4. 10 mL şırınga ve şırınga filtreleri alın: 26 mm çapında yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat (SFCA) membran, 0.45 μm gözenek boyutu.

5. Sinek Embriyolarının Toplanması

1. Şişelerde ilginç protein etiketini taşıyan transgenik sinek çizgilerini (şişe başına yaklaşık 100 sinek) genişletin ve her bir sinek hattı için 25-30 şişe birikene kadar her 2 günde bir şişeleri aktarın. Kontrol stokunu ( örneğin , yw hattı) benzer şekilde genişletin .
2. Sıcak AJ levhalarını oda sıcaklığına getirir (yaklaşık 1-2 saat boyunca gece boyunca yapılabilir). Eldivenli bir parmak kullanarak AJ plakalarının ortasına biraz ıslak maya yapıştırın. 15 cm'lik bir plaka için 6 cm'lik daire ve 10 cm'lik bir plaka için 4 cm'lik bir daire.
3. Standart bir Drosophila aşamasını kullanarak karbondioksit akışı ile sinekleri anestezi edin veKafesler (5 L kafes başına yaklaşık 15 yetişkin şişesi, 1 L kafese 5 şişe).
   1. Adım 5.2'den hazırlanmış AJ plakaları ile kafes altını örtün ve iki şerit şerit kullanarak AJ plakasını kafese bantlayın ( Şekil 1D ve 1H ). Plakları değiştirirken kolay soyulması için plakanın üzerinden geçen bandın uçlarını katlamak yararlı olacaktır.
   2. Sinekler anesteziden kurtulduktan sonra, kafesleri tabaklarla altta tutun ve üst sıraya yerleştirin.
      Not: Sinekler tam olarak iyileşinceye kadar beklemek önemlidir, aksi takdirde AJ plakasına ve maya yapıştırmasına yapışacaklardır.
   3. Deneyin sonunda, kafesi temizleme için hazırlamak için, birkaç saat boyunca kafesi dondurucuya yerleştirin. Örgüyü birkaç saat suya batırmak temizlemeyi kolaylaştıracaktır.
4. Kafeleri 2-3 gün oda sıcaklığında sineklerle inkübe edin ve AJ plakalarını günde iki kez değiştirin. Tabakları değiştirmek için kafesi ters çevirin,Bandı plakadan soyup kafese tutun, kafesin tezgahın üzerine yavaşça dokunduğunuzda ve yeni plakayı hızlıca değiştirerek sineklerin kaçmasına izin vermeyin.
   Not: Sineklerin kafese göre ayarlanması gerekir ve 3. günden başlayarak en iyisi kalır. Yaklaşık 4-5 gün boyunca zirveye çıkmaya devam edeceklerdir. Üst döşeme kapasitesinde iki 5 L kafes, bir gecelik koleksiyonda 1 g embriyo üretebilir. Daha küçük ölçekli deneyler için 1 L kafes kullanın.
5. Sineklerin taze AJ plakalarına bir gece embriyo yerleştirmesine izin verin (yaklaşık 16 saat) veya istenilen herhangi bir süre bekleyin.
6. Ertesi sabah, kullanılan her bir sinek çizgisine bir tane olmak üzere, hasır kaplarını embriyo toplama için işaretleyin ve tartın.
7. Bölüm 4'teki reaktifleri kullanarak 1x lizis tamponu hazırlayın (Not: kullanıma hazır 1x lizis tamponu ekstraksiyondan hemen önce hazırlanmalıdır): 10 mL 5x konsantre lizis tamponuna 40 mL su ekleyin (-80 ° C'de saklanır) 50 mL tüp içinde.
   1. 50 uL 1 MD ekleyinTT'yi son konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde iyice karıştırın ve her biri 25 mL olmak üzere iki 50 mL tübe bölün. Tüplerden birine bir proteaz inhibitörü tablet ekleyin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de döndürün. Tablet çözünürken, toplar ve dechorionate embriyolar (5.8 - 6.6 arası adımlar). Tabletin tamamen çözülmüş olduğundan emin olmak için kontrol edin ve tamponu buzda tutun.
      Not: DTT içeren 1x tamponun ikinci tüpü -80 ° C'de saklanabilir ve bir sonraki deneyden önce tabletin eklenmesi gerekecektir. 25 mL lik eritme tamponu, protein saflaştırma aşamaları boyunca müteakip yıkamalar dikkate alınarak, 2 numuneye kadar kadar yeterlidir.
8. Kullanılan sinek çizgilerinin genotipleri ile AJ plakalarını kafeslere işaretleyin ve plakaları yenileri için değiştirin.
   Not: Aşırı maya macunu bu aşamada plakadan kazınabilir. Embriyolar plakalar üzerinde 25 ° C'de veya oda sıcaklığında yaşlandırılarak istenilen gelişimsel zaman penceresi elde edilebilir.
9. Yeterli su ekleyin tO her AJ plakasını örtün. Embriyoları yumuşak bir boya fırçasıyla plakadan yavaşça çıkarın (yaklaşık 10 mm genişliğinde düz kafa geniş plakalar için iyi iş görür). Embriyoları daha önce tartılmış ve işaretlenmiş ağ konteynırına boşaltın ve fazla su boşaltın.
   1. Gerekirse, tüm embriyoları çıkarmak için ikinci bir durulama ve plakanın fırçalanması gerçekleştirin. Aynı sinek çizgisi için ek plak (lar) daki embriyoları aynı ağ konteyneri içine birleştirin.
10. Fazla suyunu çıkarmak için ağdaki kağıt havluları kısaca lekeleyin.

6. Embriyo Deşarjı

1. % 50 çamaşır suyu (hacimce hacim / su çözeltisi) ile 6 cm'lik bir Petri kabına yarım dolgu doldurun.
   Not: Malzemelerin ve Reaktiflerin Tablosunda çamaşır suyu markası ile ilgili önemli açıklamaya bakın.
   Dikkat: Eldiven takın ve giysilere ağartma önleyin.
2. Su ile 2 büyük Petri kabı hazırlayın.
3. Örgü kabını embriyolarla 90 s boyunca% 50 ağartma maddesine daldırın. İnkübasyon sırasında hafifçe dokununÇamaşır suyu çözeltisindeki embriyoları askıya almak için birkaç kez karıştırın.
4. 90 saniyelik kuluçka işleminin sonunda, 2 yemek tabağının her birinde bulunan ağ gözü su ile yaklaşık 10 saniye yıkanır.
5. Kabuk kutusunu, 18.2 MΩ · cm su ile püskürtme şişesini kullanarak iyice yıkayın. Ayrıca, gözlü kabın kenarlarını ve dışını yıkayın.
   Not: Yıkamadan sonra ağartma kokusu algılanmamalıdır.
6. Örgü kabını kağıt havlular üzerine lekeleyin. Örgü kabını embriyolarla tartın ve adım 5.6'da elde edilen boş kabın ağırlığını çıkarın. Oluşan embriyoların ağırlığını kaydedin. Amacıyla hedeflenecek embriyoların miktarı 0.5 - 1 g arasındadır.

7. Embriyo özütünün hazırlanması

1. Proteaz inhibitörleri (adım 5.7'den) ile birlikte 1 mL liziz tamponunu bir buzağı camı homojenleştiricisine ilave edin ve buz üzerinde saklayın. Embriyoları mesh kabından homojenleştiriciye aktarın.
   Not: Embriyolar düz uçla alınabilirFa metal spatula veya fırça ile doğrudan tampona aktarılır. Bu bölümdeki buz üzerindeki tüm adımları uygulayın.
2. Geriye kalan 1 ml'lik liziz tamponu ile mesh üzerindeki kalan embriyoları yıkayın ve homojenizatördeki maddeye ekleyin. Embriyoların homojenleştiricinin tabanına oturmasına ve süpernatanın dikkatlice aspiremesine izin verin.
3. Proteaz inhibitörleri (adım 5.7'den) ile liziz tamponunu, homojenleştiriciye ekleyin, embriyoların her gramı için 5-6 mL liziz tamponunu hedefleyin.
4. Embriyoları gevşek bir fitil ile 4-6 vuruşla homojenize edin.
   Not: İlk vuruş sırasında daha fazla direnç olacaktır. Çözeltinin sıçramasını önlemek için havanızı sürekli hareket ettirin.
5. Embriyoları sıkı bir şekilde uygun bir havyar ile 8-10 vuruşla homojenize edin.
6. Homojenatı buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
7. Homojenat mikrosantrifüj tüplerine aktarılır ve en yüksek hızda 15 dakika 4 ° C'de santrifüj edilir (yaklaşık 13.000 xg).
8. AvoidiPeletler ve çok üst lipid katmanı, süpernatantları taze mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve en üst devirde 15 dakika 4 ° C'de santrifüjleyin (yaklaşık 13.000 xg).
9. Dikkatle süpernatantları 1 mL ucu ile aspire edin ve 0.45 μm filtreler eklenmiş soğutulmuş 10 mL şırıngalaya yükleyin (aynı numuneyi alikotları bir şırınga içine birleştirin). Çözeltiyi, buz üzerinde etiketli 15 mL'lik bir tüpe koyun. Özüt, müteakip protein saflaştırma deneyleri için hemen kullanılabilir veya sıvı nitrojende derhal dondurulur ve ileride kullanılmak üzere -80 ° C'de tutulur.
   Not: Embriyoların çözülmesi sırasında proteazlar aktive edilebilir ve protein bozulmasına neden olabilir, çünkü embriyolar yerine özleri dondurmak daha iyidir.

Sonuçlar

Bir protein kompleksi saflaştırma deneyinde bu protokolün kullanılmasını göstermek için, kontrol altında EGFP etiketli Drosophila hücre dışı sinyal regüle kinazı (ERK, haddelenmiş gen tarafından kodlanmış) ifade eden homozigot canlı bir sinek çizgisi arm-EGFP-ERK ürettik. Her yerde eksprese edilen armadillo ( kol ) promotörü ^{18 , 19'dur} . Kol promotörü , Droso...

Tartışma

Burada sunulan protokol Drosophila popülasyon kafeslerini orta ölçekte kurmak ve embriyolardan tam hücreli protein ekstraktı yapmak için basit ve genel bir prosedürdür. Elde edilen ekstraktlar, afinite reçineleri üzerindeki protein komplekslerinin saflaştırılması gibi çeşitli aşağı akım uygulamaları içinde kullanılabilir. Buz üzerinde ekstraksiyon aşamalarını gerçekleştirmek ve protein bozunumunu en aza indirmek için güçlü proteaz inhibisyonu kullanmak kritik önem taşır. Tarif edildiği gibi, protokol ç...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Leaktite 5-Qt. Doğal Çoklu Karışım Kabı (3'lü Paket)	Home Depot	209330	5 litrelik kafesler yapmak için.
Leaktite 5-Qt. Doğal Çoklu Karışım Kapağı (3'lü Paket)	Home Depot	209320	Çap 8.37 inç. 5 litrelik kafesler için kapaklar.
Fisherbrand şeffaf kapaklı petri kapları, 100 x 15 mm	Fisher Scientific FB0875712		Malzeme: Polistiren. 1-L kafesler ile birlikte kullanılır.
Fisherbrand Şeffaf kapaklı Petri kapları, 150 x 15 mm	Fisher Scientific FB0875714		Malzeme: Polistiren. 5 litrelik kafeslerle birlikte kullanılır.
Fisherbrand şeffaf kapaklı petri kapları, 60 x 15 mm	Fisher Scientific FB0875713A		Malzeme: Polistiren. Embriyo dekoriyonasyonu sırasında kullanılır.
Sefar NITEX naylon örgü	Sefar	03-180/44	180 mikron, %44 açık alan, sinek kafesleri için kullanılır.
Milwaukee 3 inç Delik Dozer Arbor	Home Depot	49-56-9670	1-L kafesler yapmak için 3 inç kesme aleti.
Nalgene Beyaz Polipropilen Vidalı Kapaklı Geniş Ağızlı Düz Kenarlı PMP Kavanozları	Fisher Scientific	11-823-33	1 L'lik kafesler yapmak için. Termo Bilimsel kedi # 21171000. Alternatif 1 litrelik kaplar kullanılabilir.
Kızıl Yıldız Aktif Kuru Maya, 2 kiloluk kese	Kızıl Yıldız		Amazon.com veya diğer tedarikçilerden satın alınabilir.
Dondurulmuş %100 Elma Suyu Konsantresi			bir marketten satın alınabilir. Kutunun üzerinde "%100 elma suyu" yazması gerekiyor.
Metil 4-hidroksibenzoat	Acros Organics	AC126965000	metilparaben veya Tegosept olarak da bilinir. AJ plakalarında koruyucu olarak kullanılır.
Moleküler biyoloji için IGEPAL CA-630, lizis tamponu hazırlamak için 100 ml	Sigma	I8896	kullanılır.
Nalgene Hızlı Akışlı CN Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri	Fisher Bilimsel	09-740-2A	0.2 μ m gözenek boyutu. 5x lizis tamponunu filtrelemek için kullanılır. Termo Bilimsel kedi # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Proteaz İnhibitörü Kokteyl	Sigma	11697498001	20 tabletlik flakon. Lizis tamponunda proteaz inhibisyonu için kullanılır.
Corning SFCA şırınga filtreleri	Fisher Scientific	09-754-21	SFCA membran, çap 26 mm, gözenek boyutu 0,45 &m. Nihai ekstrakt numunelerini filtrelemek için kullanılır.
BD  Luer-Lok İğnesiz Tek Kullanımlık Şırıngalar	Fisher Scientific	14-823-2A	, nihai ekstrakt örneklerini filtrelemek için. BD kedisi # 309604.
Suda	Clorox		, herhangi bir süpermarkette satın alınabilir. Clorox markasını kullanmak önemlidir, çünkü diğer markalar eksik dekoryonasyona neden olabilir veya embriyolar için toksik olabilir.
Corning Costar Netwell Plakaları	Fisher Scientific	07-200-213	embriyo koleksiyonları için örgü kaplar. 74 ve mu; m ağ boyutu, 6 oyuklu.
Wheaton Dounce Doku Öğütücüler, kapasite 15 ml	Fisher Scientific	06-435B	embriyolar için homojenizatör, gevşek ve sıkı tokmaklı. Wheaton kedisi # 357544.