Yöntem makalesi

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve Xenopus Embriyonik Gelişim

DOI:

10.3791/55823

⸱

15 Haziran 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinaz aktivitesi, hücre proliferasyonu, farklılaşma, göç ve apoptoz dahil olmak üzere bir dizi hücresel işlev için çok önemlidir. Erken embriyonik gelişim sırasında, kinaz aktivitesi son derece dinamik ve embriyo boyunca yaygındır. Farmakolojik ve genetik yaklaşımlar, kinaz aktivitelerini saptamak için sıklıkla kullanılır. Ne yazık ki, bu stratejileri kullanarak üstün uzaysal ve zamansal çözünürlüğü elde etmek zor. Dahası, canlı hücreler ve çok hücreli organizmalarda kinaz aktivitesini tersine çevrilebilir bir tarzda kontrol etmek uygun değildir. Böyle bir sınırlama, gelişme ve farklılaşma sırasında kinaz aktivitesinin niceliksel bir şekilde anlaşılabilmesi için bir tıkanıklık olarak kalmaktadır. Bu çalışma, Fotactevatable protein Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) ve kriptokrom etkileşimli bazik-helis-loop-helezon (CIBN) 'nin N-terminal alanını içeren bir bisistronik sistemden yararlanan bir optogenetik strateji sunmaktadır. ReversiAktif protein kinaz (MAPK) sinyal yolağının etkinliği, canlı hücrelerdeki ışık aracılı protein translokasyonu yoluyla sağlanır. Bu yaklaşım, memeli hücre kültürlerine ve canlı omurgalı embriyolarına uygulanabilir. Bu bisistronik sistem benzer aktivasyon mekanizmaları ile diğer kinazların aktivitesini kontrol etmek üzere genelleştirilebilir ve diğer model sistemlerine uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyüme faktörleri, çoğalma, farklılaşma, göç ve apoptoz gibi geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesinde yer alır ve embriyonik gelişme, yaşlanma ve mental durumun düzenlenmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik olayda önemli roller oynamaktadır 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Birçok büyüme faktörü, karmaşık hücreiçi sinyalleme kaskadları aracılığıyla sinyal verir. Bu sinyal olayları sıklıkla, tersine çevrilebilir protein fosforilasyonu ile tam olarak düzenlenmiş bir şekilde çalıştırılır ( 6 , 7) . Bu nedenle, protein fosforilasyonundan sorumlu olan protein kinazların sinyal verme sonuçlarının anlaşılması temel olarak önemlidir.

Farklı büyüme faktörleri, oldukça yaygın bir hücre içi sinyal ağı vasıtasıyla etkinken distInt hücresel tepkiler 8 , 9 . Reseptör tirozin kinazların yaygın intraselüler mediatörler arasında Ras, Raf, hücre dışı sinyalle düzenlenmiş kinaz (ERK), mitojen ile aktive olan protein kinaz (MAPK) / ERK kinaz (MEK), fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), Akt ve fosfolipaz C gama (PLCγ) 10 , 11 . Biriken kanıtlar, sinyal çeşitliliği ve özgünlüğün, sinyal faaliyetinin mekânsal ve zamansal düzenlenişine bağlı olduğunu gösterir 12 . Örneğin, fare feokromasitoma hücrelerinde (PC12), hücre proliferasyonuyla sonuçlanan epidermal büyüme faktörü (EGF) uyarımı, geçici olarak ERK yolunu 9 harekete geçirir. Öte yandan, hücre farklılaşmasına yol açan sinir büyüme faktörü (NGF) ile uyarılması, sürekli bir şekilde ERK yolunu aktive eder 9,13. Kültürlü rHipokampal nöronlarda, beyin türevi nörotrofik faktör (BDNF) ile geçici sinyalizasyon primer nevrit büyümesini arttırırken, sürekli sinyalizasyon da artmış nevrit dallanmasına yol açar 14 . Erken embriyonik gelişim sırasında fosforile ERK aktivitesi geçici olarak dinamiktir ve embriyo 6 boyunca yaygındır. Erken Xenopus embriyogenezisindeki yeni bir genetik ekran, iki alt başlıca büyüme faktörü yolağı olan ERK ve Akt sinyalleme kaskadlarının, aşamaya özgü aktivasyon profilleri 7'yi gösterdiğini ortaya koymuştur. Dolayısıyla, kinaz sinyalleme sonuçlarının anlaşılması, yeterli özünürlükle kinaz aktivitesinin mekansal ve zamansal özelliklerini inceleyebilen araçlar için çağrıda bulunur.

Gelişim sırasında sinyal iletiminin dinamik doğasını araştırmaya yönelik geleneksel deneysel yaklaşımlar arzu edilen uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip değildir. Örneğin, farmakolojik yaklaşımlar küçük kimyasal kullanırHücrelerdeki ve dokulardaki sinyal transdüksiyonunu uyarmak veya bastırmak için biyolojik veya moleküler moleküller. Bu küçük moleküllerin dağınık doğası, eylemlerini belirli bir ilgi alanı 15 ile sınırlandırmayı zorlaştırıyor. Genetik yaklaşımlar ( örn., Transgenez, Cre-Lox sistemi veya mutagenez) hedef gen ekspresyonunun veya protein aktivitesinin 16 , 17 , 18'in geri döndürülemez aktivasyonu veya baskılamasına neden olur. Tet-On / Tet-Off sistemi 19 , gen transkripsiyonunun zamana göre daha iyi kontrolünü sağlar, ancak tetrasiklinin difüzyonuna dayandığı için sıkı uzamsal kontrollerden yoksundur. Kimyasal olarak indüklenen protein dimerizasyonu 20 veya foto-kovaj 21 , 22 , 23 , 24'teki son gelişmeler ,Sinyalizasyon ağlarının zamansal kontrolü. Bununla birlikte, mekansal kontrol, kafesli kimyasalların dağılışı nedeniyle zorlayıcı olmaya devam etmektedir.

Protein-protein etkileşimlerini kontrol etmek için ışığın gücünden yararlanan son ortaya çıkan optogenetik yaklaşımlar, yüksek zaman-zamanlı hassaslığın yanısıra reversibilite ile sinyal yollarının modülasyonuna izin verir. Nöronal ateşlemeyi kontrol etme konusundaki ilk başarısının kısa bir süre sonra 25 , 26 , 27 , optogenetics gen transkripsiyonu, translasyon, hücre göçü, farklılaşma ve apoptoz gibi diğer hücresel işlemleri kontrol etmek için genişletildi. 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . P kullanan bir stratejiHitoaktivatüre protein çifti Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) proteini ve kriptokrom etkileşen bazik-helezon-döngüsel helezon (CIBN) 'nin N-terminal bölgesi, yakın zamanda memeli hücrelerinde ve Xenopus embriyolarında Raf1 kinaz aktivitesini kontrol etmek için geliştirildi. CRY2, mavi ışık uyarıldığında CIBN'ye bağlanır ve CRY2 / CIBN protein kompleksi, karanlıkta kendiliğinden ayrılır 34 . Mavi ışık, CRY2 kofaktörü, flavin adenin dinükleotidi (FAD) uyandırır ve CRY2'de konformasyonel değişikliğe ve ardından CIBN'ye bağlanmasına yol açar. CRY2'nin yapısal olarak aktif (W374A) ve flavin eksikliği olan (D387A) mutantları, FAD bağlayıcı cebindeki mutasyonlar yoluyla üretilebilir: CRY2 W374A mutantı ışıktan bağımsız olarak CIBN'ye bağlanırken CRY2 D387A mutantı, mavi altında CIBN'ye bağlanmaz Işık uyarımı 36 , 37 . I tanımlanan optogenetik sistemBu protokol canlı hücrelerde protein translokasyon aracılı Rafl aktivasyonunu başlatmak için vahşi tip CRY2 ve CIBN kullanır. Rafl'in zar alımının etkinliğini arttırdığı bilinmektedir 38 . Bu sistemde, tandem bir CIBN modülü plazma zarına bağlanır ve CRY2-mCherry, Rafl 35'in N-terminaline kaynaştırılır. Mavi ışığın yokluğunda, CRY2-mCherry-Raf1, sitoplazmada kalır ve Raf1 inaktiftir. Mavi ışık uyarımı, CRY2-CIBN bağlanmaya neden olur ve Raf1'in aktive edildiği plazma membranına Rafl'i işe alır. Raf aktivasyonu, bir Raf / MEK / ERK sinyalleme kaskadını uyarır. Hem CRY2 hem de CIBN füzyon proteinleri, bir bisistronik genetik sistemde kodlanır. Bu strateji, aktivasyon durumu aynı zamanda hücrelerdeki protein translokasyonu ile de etkinleştirilebilen Akt gibi diğer kinazları kontrol etmek üzere genelleştirilebilir 39 . Bu çalışma memeli hücre kültüründe bu optogenetik stratejinin uygulanması için ayrıntılı protokoller sunmaktadırRes ve çok hücreli organizmalar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan araştırmaları, Illinois Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Illinois Üniversitesi Hayvan Kaynakları Departmanı (DAR) tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yürütülmüştür.

1. BHK21 Memeli Hücre Kültüründe Protein Lokalizasyonunun Optogenetik İndüksiyonu

NOT: Adım 1.1-1.3, tipik olarak kısa çalışma mesafelerine sahip yüksek büyütme hedeflerine ( örneğin, 63X veya 100X) sahip görüntüleme için bir hücre kültürü haznesi oluşturmak için bir yöntem sağlar. Bu hedefler, görüntüleme altlığı olarak ince bir cam lamelini ( örn., # 1.5, 170 μm kalınlık) gerektirir. Alternatif olarak, cam altı bir hücre kültürü çanağı / slayt kullanılabilir. Böyle bir durumda adım 1.1-1.3 atlanabilir.

  1. Cam lamelleri temizleme
    1. Bir lamel tutucu 30 cam lamelleri yerleştirin.
    2. 600 mL'lik bir plastik beherde 20 gr deterjan ve 400 mL ılık musluk suyu ilave edin. PlacE bir manyetik karıştırıcıda behergre ve bütün deterjanlar çözünene kadar karıştırın. Doku kağıdı kullanarak köpüğü çıkarın.
    3. 100 mm x 15 mm'lik bir Petri tablasının tabanını karıştırma çubuğundan bir aralayıcı olarak kullanın ve lamel tutucu için bir yüzey olarak kullanın. Temizleme işlemi sırasında yeterli akış sağlamak için Petri kabında 3-4 boşaltma deliği yapın.
    4. Delikleri boşaltmak için lehim havasını ısıtın ve havalandırılmış bir kaputun içindeki plastikten tutun.
      DİKKAT: Isınan lehim demirine çıplak elle dokunmayın.
    5. Lamel tutacağı, beherdeki Petri kabına yerleştirin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca gece boyunca karıştırın.
    6. 1.000 mL'lik bir beher içinde üç kez 500 mL DI su ile yıkayın. Deterjan çözeltisi yeniden kullanılabilir.
    7. Forseps kullanarak bireysel lamelleri Pick up. Lamelleri 1 dakika boyunca 190 geçirgen (% 95) etanol içine daldırın.
    8. Lamelleri steril bir kaputun içinde kurutun. Kullanıma kadar lamelleri steril bir plastik kapta saklayın.
  2. Poli-L-lisin (PLL) kaplamalı lamelleri yapma
    1. 1.24 g borik asit ve 1.9 g disodyum tetraboratın 400 mL su içinde çözülmesi ile 0.1 M borat tamponu yapın. 10 M NaOH ile pH'ı 8.5'e ayarlayın.
    2. PLL'yi 1 mg / mL nihai konsantrasyona kadar borat tamponunda eritin. 50 mL steril santrifüj tüpleri içinde PLL solüsyonu alın.
    3. 10 cm'lik doku kültürü çanağına 50 mL PLL kaplama çözeltisi ekleyin. PLL solüsyonunu ısıtmak için çanağı 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
    4. Lamel kabını (adım 1.1.8) steril bir kaputun içinde açın.
    5. Temizlenmiş lamelleri doku kültürü çanağında önceden ısıtılmış PLL solüsyonuna birer birer sokun. Tüm yüzeyleri batırmak için kabarcık oluşumundan kaçının.
    6. 37 ° C CO 2 inkübatör gece boyunca lamel ile çanak koyun. Her lamelü alın ve steril bir lamel tutucu yerleştirin. Üç kere otoklavlanmış ultra saf su (18.2 MΩ & #183 cm direnç) steril bir davlumbaz içinde 1000 mL'lik bir beherglastır.
    7. Steril kaputun içindeki lamel dolabının içindeki lamelleri kurutun. Kullanıma kadar lamelleri steril bir plastik kapta saklayın.
  3. Polidimetilsiloksan (PDMS) hücre kültürü odalarını bir araya getirme
    1. Plastik bir kapta, 40 g PDMS tabanı tartılır ve 10: 1 w / w oranındaki PDMS ve sertleştirme ajanı elde etmek için 4 g sertleştirici madde ilave edilir. 2 dakika pipet ucu ile karıştırarak PDMS / kür ajanı karıştırın. Alternatif olarak, bir santrifüj karıştırıcı kullanın.
    2. Alüminyum folyo parçasıyla bir tutucu yapmak için şablon olarak 4 inç çaplı bir beher kullanın. Alüminyum folyo tutacağı 15 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Bu alüminyum folyo tutucuya 4 inçlik bir silikon gofret koyun.
    3. Karışık PDMS çözeltisini tutucuya boşaltın. Hafifçe gofret kenarına dokunmak için ince bir cam çubuk kullanın. Gofretin altına sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarın.
    4. 15 cm'lik Petri kabını bir vakum kabına yerleştirinR PDMS çözüm degasın. Kabarcık oluşmadan 20 dakika boyunca gazdan arındırmaya devam edin. Bu arada, konveksiyon fırını 65 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
    5. 15 cm'lik Petri kabını dikkatlice fırına yerleştirin. 2 saat inkübe edin.
    6. Plakayı fırından çıkarın. PDMS kenarına hafifçe dokunmak için cam çubuk kullanın ve çapraz bağlantının tam olduğundan emin olun. Aksi takdirde, PDMS katı ve yapışkan olmadan daha uzun süre inkübe edin.
    7. Alüminyum folyoyu plakadan çıkarın ve silikon gofretten soyun. Kenardan başlayarak, sertleştirilmiş PDMS'yi dikkatle silikon gofretin dışına alın.
      DİKKAT: Gofreti kırması için çok fazla kuvvet uygulamayın.
    8. Tıraş bıçağı ile 24 mm x 40 mm lamel sığdırmak için PDMS'yi 20 mm x 30 mm'lik dikdörtgen parçalara bölün.
    9. Her bir PDMS parçasının merkezinden 10 mm x 20 mm'lik dikdörtgen bir açıklığı kesmek için keski şeklinde bir bıçağı kullanın.
    10. Adım 1.1'de açıklanan deterjan protokolünü kullanarak PDMS haznelerini temizleyin.
    11. PDMS haznelerini temiz bir kaputta kurutun. Kuru hazneleri alüminyum folyo ile kaplanmış otoklavlanabilir bir kaba yerleştirin.
    12. Konteyner yerçekimini (121 ° C, 15 psi) 30 dakika boyunca otoklavda tutun ve kabı oda sıcaklığında saklayın.
  4. BHK21 hücre kültürü ve transfeksiyonu
    1. 445 mL DMEM 50 mL FBS ve 5 mL 100 x Penn-Strep-Glutamin (10,000 U / mL penisilin, 10 mg / mL streptomisin ve 29,2 mg / mL L ile karıştırılarak BHK21 hücre kültürü için 500 mL ortam hazırlayın -glutamin). FBS'nin nihai konsantrasyonunun% 10 olduğundan emin olun.
    2. HEPES olmayan CO 2 ile 10 mL canlı hücre görüntüleme için bağımsız ortam.
      NOT: CO2'den bağımsız ortam, CO2 inkübatörü olmaksızın hücre büyümesini destekler ve atmosferik koşullar altında hücrelerin görüntülenmesi için idealdir. Ayrıntılı bilgi için Malzeme Listesi'ne bakın. BHK21 hücre hattına ek olarak, diğer memeli hücreleri türleri de vermelidirBenzer sonuçlar.
    3. Steril bir başlıkta steril bir PLL kaplı lamel (adım 1.2) üzerine bir otoklavlanmış, steril PDMS odası (adım 1.3) yerleştirerek bir hücre kültürü cihazı monte edin.
    4. Her cihazı steril bir 60 mm'lik Petri kabına yerleştirin.
    5. 12-iyi doku kültürü plakasının bir kuyudan hücreleri ayırmak için 0.5 mL% 0.25 tripsin kullanın. Hemocytometer ile hücre yoğunluğunu sayın. 200 uL hücre kültürü ortamı ile bölmedeki 20.000 BHK21 hücresi (yaklaşık 10.000 hücre / cm2).
    6. DNA plazmiti bir plazmid hazırlama kiti ile hazırlayın (Malzeme Listesine bakın).
      NOT: CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX'ın tasarımı ve işlevselliği Şekil 1A - 1B'de gösterilmektedir.
    7. Hücre kaplamasından yirmi dört (24) saat sonra hücreleri üreticinin protokolüne göre 50-100 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plasmidle transfekte edin.
    8. Transfeksiyondan sonra üç (3) saat sonra m200 μL taze kültür ortamına (basamak 1.4.1) yerleştirin ve kültürlerin 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edilerek gece boyunca iyileşmesine izin verin.
  5. Flüoresan canlı hücre görüntüleme
    1. Bir bilgisayarı, ışık kaynağını, mikroskopu ve kamerayı açın. Protokolün geri kalanı için bir konfokal floresan mikroskopu (100X yağ ile daldırma objektifle donatılmış) kullanın.
      NOT: Ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskop da kullanılabilir.
    2. Hücre kültürü ortamını, 200 μL CO 2'ye bağlı olmayan ortam ile değiştirin.
    3. Hücreleri mikroskop üzerine yerleştirmeden önce veri toplama protokolünü kurun. Optogenetik uyarılma için 488-nm uyarılma FITC kanalı kullanın. Transfekte edilmiş hücreleri bulmak ve mCherry etiketli proteinin hücresel lokalizasyonunu izlemek için 561 nm uyarılma TRITC kanalı kullanın.
    4. Sırasıyla 120 ve 200 olarak FITC ve TRITC kanallarının kazançlarını ayarlayın. 2,2 piksel süren bir süre kullanın1; s ve boyutu 512 x 512 piksel.
    5. Nesne penceresine bir güç ölçer koyarak 488 nm ışığın gücünü ölçün. CIBN-CRY2PHR ilişkisini indüklemek için toplam 2 μW'lık bir güç (odağında yaklaşık 10,000 W / cm2) yeterlidir.
    6. 5 sn aralıkla ve toplam edinme süresi 2 dakikalık bir zaman damgası alımı oluşturun.
    7. Nesnel pencerede uygun indeks eşleştirme malzemesini (daldırma yağı) uygulayın. Fazla kontrast modunu lamel yüzeyi üzerindeki hücrelere odaklanmak için kullanın.
    8. Mikroskop sahne hareket ettirerek 561 nm ışık altında transfekte bir hücre bulun.
      DİKKAT: Bu aşamada mavi ışık kullanmayın; bu, fotoaktif hale getirilebilir proteinler arasındaki ilişkiyi etkinleştirir.
    9. Transfekte edilmiş bir hücre bulunca veri toplama işlemini başlatın.
      NOT: Başarıyla transfekte edilmiş hücreler, hem FITC (2CIBN-GFP-CaaX'den) hem de TRITC (CRY2-mCherry-Rafl'den) kanallarında floresan göstermelidir ( Şekil 1C-D
    10. FITC ve TRITC kanallarına zaman damgalı görüntü dizisi kaydedin ( Şekil 1D ).
    11. CRY2-CIBN protein kompleksinin spontan ayrışmasını saptamak için, 30 saniyelik bir aralıkla tek başına Txred kanalıyla 20 dakika süreyle başka bir zaman damgası kaydedin.
    12. Veri analizi için zaman damgalı görüntüyü kaydedin.
  6. Görüntü analizi
    1. Görüntüleri bir görüntüdeki yoğunluğu çıkarabilen bir görüntü analiz yazılımı ile açın 40 .
    2. İki temsilci enstantane seçin: biri mavi ışığa maruz kalmadan önce ve diğer mavi ışık sonrası maruz kalmadan önce.
    3. Arka planı, plazma zarını ve sitoplazmayı kapsayan bir hücre çizgisi çizin. Bu çizgi boyunca yoğunluğu projelendirin. Işık öncesi ve sonrası farkı karşılaştırmak için değerleri kaydedin ve çizin ( Şekil 1D ).
    4. Protein birleşmesinin kinetiğini analiz etmek için, selekPlazma membranında bir temsilci ilgi bölgesi (ROI), sitoplazmada bir ROI ve arka planda bir ROI.
    5. Görüntü yığını için plazma membranının (I PM ), sitoplazmanın (I CYT ) ve arka planın (I BKD ) ortalama yoğunluklarını elde edin.
    6. Aşağıdaki denklemi kullanarak her görüntü için membran / sitozolik yoğunluğun oranını hesaplayın:
      figure-protocol-1
    7. Oranı zamana göre çizin ve CRY2-CIBN'nin bağlanma veya ayrılma kinetiğini belirleyin ( Şekil 1E -F ).

2. Bir CO 2 İnkübatöründe Uzun Süreli Işık Uyarımı için bir LED Arrayinin Yapımı

NOT: Deneysel kurulumun genel şeması Şekil 2A'da gösterilmiştir.

  1. 12 mavi LED'i iki ekmek kabına yerleştirerek LED dizisini yapınDs ve bağlantılı akım sınırlayıcı dirençler.
    NOT: 30 V'luk bir güç kaynağı ile dört LED seri bağlanabilir ve parlaklıkları bir akım sınırlayıcı direnç ile kontrol edilebilir.
  2. Ekmek tahtalarını bir alüminyum kutuya yerleştirin.
    NOT: Alüminyum kutunun yüksekliği 2 inç olmalıdır. Bu yükseklik, 12 kuyucuklu bir doku kültürü plakasını aydınlatmak için idealdir, çünkü ışınlanan spotun boyutu tek bir kuyu ile aynıdır.
  3. Güç kaynağına bağlanmak için iki metal tel kullanın. Işık kutusu bir CO2 inkübatörüne yerleştirildiğinde telin uzunluğunun yeterli olduğundan emin olun.
  4. Işık kutusunun kapağı olarak şeffaf bir ışık difüzörü kullanın ( Şekil 2C ).
  5. Her bir LED'in güç çıkışını çeşitli voltaj girişlerinde kalibre edin. 24 saat PC12 hücre farklılaşma tahlili için 0,2 mW / cm2'lik bir güç kullanın. Canlı Xenopus embriyoları veya eksplantları için 5 mW / cm2'lik bir güç kullanıntahliller.

3. PC12 Hücre Farklılaşmasının Optogenetik İndüksiyonu

  1. Hücre kültürleme ve transfeksiyon
    1. 407.5 mL F12K'yı 75 mL at serumu + 12.5 mL FBS + 5 mL 100 x Penn-Strep-Glutamin (at serumu ve FBS'nin nihai konsantrasyonları) ile karıştırarak bir sıçanın feokromasitoma (PC12) hücre kültürü için 500 mL ortam oluşturun : Sırasıyla% 15 ve% 2.5). 99 hacim F12K ortamında 1 hacim dolu ortamı karıştırarak düşük serum medyumu yapın.
    2. Plaka PC12 hücrelerini, 12 delikli bir plakada 300,000 hücre / kuyu veya 75,000 hücre / cm2'lik bir yoğunluğa yerleştirin.
    3. Hücre kaplamasından 24 saat sonra hücreleri CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX ile transeke edin (adım 1.4.7'ye benzer şekilde). Her göz için 1.2 μg DNA kullanın. Hücrelerin,% 5 CO2 ile takviye edilmiş 37 ° C inkübatörde gece boyunca kültür ortamında iyileşmesine izin verin. Transfeksiyondan 16 saat sonra transfeksiyon verimliliğini kontrol edin.
      NOT:% 30-50 bir transfeksiyon efesiYeterli hücre sayısını sağlamak için yeterlilik sağlanmalıdır.
    4. Transfeksiyondan 24 saat sonra ortamı düşük serum ortamına değiştirin. 12 oyuklu bir plakanın her oyunda 1 mL ortam orta kullanın.
  2. Işık kaynaklı PC12 hücre farklılaşması
    1. LED dizisini CO 2 inkübatörüne yerleştirin. Bir çift kablo kullanarak güç kaynağına bağlayın. LED'in gücünü 0.2 mW / cm 2 olarak ayarlayın. Dedektörün penceresine transfekte edilmiş PC12 hücrelerini içeren 12 oyuklu plakayı yerleştirin (adım 3.1.3). % 5 CO2 ile takviye edilmiş 37 ° C inkübatörde 24 saat kesintisiz ışık aydınlatması uygulayın.
  3. Flüoresan canlı hücre görüntüleme
    1. Mikroskop ve numune hazırlama için 1.5.1-1.5.4 adımlarını izleyin.
    2. Tekli anlık veri toplama kurun. Hem GFP hem de Txred kanalı için 200 ms kullanın.
    3. Hem GFP hem de Txred kanallarında transfekte edilmiş hücrelerin görüntülerini yakalayın. Yaklaşık 200 cel kaydetHer durum için. Veri analizleri için dosyaları kaydedin.
  4. Görüntü analizi
    1. Transfekte edilmiş hücrelerin toplam sayısı üzerinden farklılaşmış hücrelerin yüzdesini sayın.
    2. Hücreleri saymak için görüntü analiz yazılımındaki herhangi bir hücre sayım modülünü kullanın.
    3. Farklılaşmış hücreleri manuel olarak sayın.
      NOT: Farklılaşmış hücreler, en az bir nevritin hücre gövdesinden daha belirgin şekilde uzandığı tanımlanır ( Şekil 3A -3B ).
    4. Kademesiz hücreler ile adım 3.4.3'ü tekrarlayın.
    5. Aşağıdaki denklemi kullanarak farklılaşma oranını hesaplayın:
      figure-protocol-2

4. Xenopus Embriyolarında Kinaz Aktivitesinin Optogenetik Kontrolü

  1. Tamponların hazırlanması
    1. 1 L 1x Marc Kullanıcı Modifiyeli Zil (MMR) hazırlayın: 100 mMNaCl, 2 mM KC1, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 ve 5 mM HEPES; PH 7.5.
  2. MRNA'nın hazırlanması
    1. 37 ° C'de 2 saat boyunca CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plazmid DNA'sını (2 μg) 1 μL ApaI (50 ünite) ile özümleyin.
    2. Doğrusallaştırılmış DNA'yı 60 μL% 100 etanol içerisinde çöktürün. DNA peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika 12,000 x g'de döndürün. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve pelet% 60 etanol ile tekrar 60 μL yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika daha 12,000 x g'de döndürün. Dikkatle süpernatantı alın ve DNA pelletini 6 uL RNaz içermeyen H 2 O içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
    3. Sağlanan SP6 RNA polimeraz, bir ribonükleotid karışımı (10 mM ATP, CTP ve UTP, 2 mM GTP ve 8 mM kap analogu) ile 2 μL doğrusallaştırılmış DNA'yı 1 μg inkübe ederek in vitro transkripsiyon gerçekleştirin ve 20 μL nükleaz- Oda sıcaklığında 1 saat serbest su.
    4. D'yi kaldırNA şablonu 37 ° C'de DNase I sindirimi ile en az 15 dakika soğutulur ve sentezlenen RNA'yı bir silis-membran spin kolonu kullanarak arındırır.
    5. Reaksiyonu durdurun ve 30 μL nükleaz içermeyen su ve 30 μL LiCl çöktürme çözeltisi ilave ederek RNA'yı çöktürün. Iyice karıştırın ve -20 ° C'de 30 dakika kadar soğutun.
    6. RNA peletlemek için 12.000 × g'de 15 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin.
    7. Yüzey maddeyi dikkatlice çıkarın. RNA'yı bir kez% 70 etanolün 1 mL'si ile yıkayın ve 40 μL'lik nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.
    8. Bir spin sütununa 40 μL RNA yükleyin. Birleştirilmemiş nükleotidleri ve kapakları çıkarmak için 4 ° C'de 1 dakika 12.000 x g'de santrifüjleyin.
  3. Xenopus embriyolarını hasat edin
    1. Sive ve ark. Tarafından açıklanan protokolü takip edin . 41 , Xenopus embriyolarını elde etmek için.
  4. MRNA mikroenjeksiyonu
    1. üretmekCam kılcalları bir kılcal çekici ile çekerek mikroenjeksiyon için iğneler. Çekme programını şu şekilde ayarlayın: ısı = 355, çekme kuvveti = 80, hız = 50 ve zaman = 100.
    2. % 3 sistein (0.2x MMR'de seyreltilmiş) ile muamele ederek embriyolardan jöle kaplamasını çıkarın.
    3. Embriyoları, mikroenjeksiyon için% 3 polisükroz ve 0.5x MMR çözeltisine aktarın. Her embriyoya 500 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA'yı enjekte edin.
      NOT: 1 ng'ın üstünde bir dozun enjeksiyonu, MAPK sinyalizasyonunun maviden bağımsız olarak aktivasyonuyla sonuçlanır.
  5. Kinaz aktivitesinin optogenetik uyarımı
    1. Kültür, mid-gastrula evresine ulaşana kadar embriyoları oda sıcaklığında% 3 polisükroz, 0.5x MMR çözeltisi içinde mikroenjeksiyon yaptı (evre 12). Ardından embriyoları 0.2x MMR çözeltisinde kültürleyin.
    2. Embriyoları veya eksplantları 12 oyuklu bir tablaya aktarın. Mavi ışık için ev yapımı LED dizisine 12-yuvalı plakayı yerleştirin (adım 2.5)T (475 nm) tedavisi.
    3. Embriyoların veya eksplantların tam mavi ışıklandırılmasını sağlamak için 12 bölmeli plakanın tepesine bir ayna yerleştirin.
    4. Mavi ışığın gücünü 5 mW / cm 2'ye ayarlayın.
      NOT: Mavi ışıklı işlem, herhangi bir zamanda,% 3 polisükroz, 0.5x MMR çözeltisi veya 0.2x MMR çözeltisi ile gerçekleştirilebilir.
    5. Embriyoları herhangi bir zamanda hasat edin. Bunları histolojik, batı leke veya gen ekspresyonu analizi için kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotoaktive edilebilir protein çiftlerinin rasimetrik ekspresyonu: Şekil 1A , domuz teshovirum-protein çiftlerine dayanan bir bisistronik optogenetik yapı CRY2-mCherry-Rafl-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (CRY2-2A-2CIBN olarak anılacaktır) 1 2A (P2A) peptidi, memeli hücre hatları 42 arasında en yüksek ribozom atlama verimliliğini gösterir. Daha önceki çalışmalarda, CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 için optimal oranın 2: 1 35

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Işık kutusunu oluştururken, tek tek LED'lerin gücü ölçülmelidir. Daha önceki tecrübelere dayanarak, güç çıkışı, üretim varyansına bağlı olarak tek tek LED'ler arasında değişiklik gösterebilir. Birbirinden% 10'luk bir güç çıkışı olan bir dizi LED seçin. LED'lerin sayısı, akım sınırlayıcı direnç ve güç girişi, farklı hücre kültürü kapları tipleri ( örn., 6 kuyucuklu veya 24 kuyulu bir plaka) için değiştirilebilir. 0,2 mW / cm2'lik bir güce 24 saat boyunca ışık uygulanması, tespit edilebilir fo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi (UIUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIGMS R01GM111816) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cam lamel & nbsp;VWR48393 230Canlı hücre görüntüleme için yüzey
Lamel tutucu Yeni Gelen Tedarik6817BLameller için
tutucu Deterjan ThermoFisher16 000 104
Borik asit Sigma-AldrichB6768-500GPLL tamponu yapmak için
Disodyum tetraboratSigma-Aldrich71996-250Gyapmak için  PLL tampon
Plastik beherNalgene1201-1000Lamelleri temizlemek için
Sodyum hidroksit Sigma-Aldrich221465-2.5KGpH'ı ayarlamak için
Poli-L-lizin hidrobromürSigma-AldrichP1274-500MGlamel kaplaması için
Dietilpirokarbonat (DEPC) ile Arıtılmış SuThermoFisher Scientific750024DNA hazırlığı için
Kapak Cam ForsepsTed Pella5645Kapak camı işleme
Doku cutlure tabağıThermofisher12565321Hücre kültürü kabı
Steril santrifüj tüpleriThermoFisher12-565-271Tampon depolama
Transfeksiyon ReaktifiThermoFisherR0534Transfeksiyon
CO2 bağımsız ortamhücre görüntüleme içinThermoFisher18045088
Polidimetilsiloksan (PDMS)Ellsworth Yapıştırıcılar184 SIL ELAST KİTİ 0.5KGForm hücre odası yapmak
Plazmid Maxiprep kitiQiagen12965Plazmid hazırlama
DMEM ortamıThermoFisher11965-084Hücre kültürleme ortamı bileşeni
F12K ortamıThermoFisher21127022Hücre kültürü ortamı bileşeni
At serumuThermoFisher16050122Hücre kültürü ortamı bileşeni
Fetal Sığır SerumuSigna-Aldrich12303C-500 mLHücre kültür ortamı bileşeni
Penisilin-Streptomisin-GlutaminThermoFisher10378016Hücre kültür ortamı bileşeni
Tripsin (%0,25), fenol kırmızısıThermoFisher Scientific15050065 Memeli hücre ayrışması için
AgaroseFisher ScientificBP1356-100DNA hazırlığı için
Ficoll PM400GE Heathcare Life Sciences17-5442-02Embriyo tamponu için
L-Sistein hidroklorür monohidratSigma-Aldrich1.02839.0025Oosit hazırlama
ApaIThermoFisherFD1414Plazmitlerin doğrusallaştırılması için
Dnase IThermoFisherAM2222in vitro transkripsiyon testinde DNA şablonunu çıkarmak için
İndeks eşleştirme malzemeleri (daldırma yağı)ThorlabsMOIL-20LNNumune substratı ile objektif arasındaki indeksi eşleştirmek için
Mavi LEDAdafruit301Optogenetik stimülasyon için ışık kaynağı
Direnç kitiAmazonEPC-103akım sınırlayıcı direnç
Alüminyum kutularBUD IndustriesAC-401ışık kutusu 
BreadBoardJekewin837654333686LED dizisi yapmak için
Tel BağlayınElectronix Express27WK22SLD25LED dizisi yapmak için
Röle ModülüJbtekSRD-05VDC-SL-CAralıklı ışık kontrolü için
DC Güç Kaynağı TMSDCPowerSupply-LW-(PS-305D)LED Silikon için güç kaynağı
  Güç  HeadThorlabsS121CIşık yoğunluğu ölçümü için
Güç ölçerThorlabsPM100D ve nbsp;Işık yoğunluğu ölçümü için
Canlı hücre görüntüleme içinMikroskopLeica BiosystemsDMI8
Biyogüvenlik KabiniThermoFisher1300 Serisi A2Memeli hücre işleme
için CO2 inkübatörüThermoFisherIsotempMemeli hücre kültürü için
Stereo mikroskopLeicaM60Embriyo mikro manipülasyonu için
MikroenjektörNarishigeIM300Embriyo mikroenjeksiyon için
Mikropipet çektirmeSutter AletleriP87İğne çektirme
in vitro< / em> transkripsiyon kitiThermoFisherAM1340 in vitro< / em> transkripsiyon için. Kit, nükleaz içermeyen su, SP6 RNA  Polimeraz, ribonükleotid karışımı, kapak analogu, lityum klorür çökeltme çözeltisi ve spin kolonu   
RNA saflaştırma kitiQiagen74104Sentezlenmiş RNA'nın saflaştırılması için silika membran spin kolonu 
Konveksiyonlu fırınMTI şirketi  EQ-DHG-9015PDMS kürleme
Santrifüj karıştırıcı ve teflon kapTHINKYAR310PDMS
Silikon gofretÜniversitesiGofret452PDMS ve nbsp cihazları yapmak için taban
BladeTechni Edge01-801PDMS
Kılcal camSutter InstrumentsBF100-58-10Enjeksiyon iğnelerinin imalatı için. nbsp;
Canlı kesmek için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975(2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469(2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556(2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917(2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256(2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057(2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738(2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Optogenetik StratejiCRY2 CIBN SistemiProtein TranslokasyonuFloresan MikroskobuLED DizisiGen Ekspresyon Analizi

İlgili makaleler