Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kinaz aktivitesi, hücre proliferasyonu, farklılaşma, göç ve apoptoz dahil olmak üzere bir dizi hücresel işlev için çok önemlidir. Erken embriyonik gelişim sırasında, kinaz aktivitesi son derece dinamik ve embriyo boyunca yaygındır. Farmakolojik ve genetik yaklaşımlar, kinaz aktivitelerini saptamak için sıklıkla kullanılır. Ne yazık ki, bu stratejileri kullanarak üstün uzaysal ve zamansal çözünürlüğü elde etmek zor. Dahası, canlı hücreler ve çok hücreli organizmalarda kinaz aktivitesini tersine çevrilebilir bir tarzda kontrol etmek uygun değildir. Böyle bir sınırlama, gelişme ve farklılaşma sırasında kinaz aktivitesinin niceliksel bir şekilde anlaşılabilmesi için bir tıkanıklık olarak kalmaktadır. Bu çalışma, Fotactevatable protein Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) ve kriptokrom etkileşimli bazik-helis-loop-helezon (CIBN) 'nin N-terminal alanını içeren bir bisistronik sistemden yararlanan bir optogenetik strateji sunmaktadır. ReversiAktif protein kinaz (MAPK) sinyal yolağının etkinliği, canlı hücrelerdeki ışık aracılı protein translokasyonu yoluyla sağlanır. Bu yaklaşım, memeli hücre kültürlerine ve canlı omurgalı embriyolarına uygulanabilir. Bu bisistronik sistem benzer aktivasyon mekanizmaları ile diğer kinazların aktivitesini kontrol etmek üzere genelleştirilebilir ve diğer model sistemlerine uygulanabilir.
Giriş
Büyüme faktörleri, çoğalma, farklılaşma, göç ve apoptoz gibi geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesinde yer alır ve embriyonik gelişme, yaşlanma ve mental durumun düzenlenmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik olayda önemli roller oynamaktadır 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Birçok büyüme faktörü, karmaşık hücreiçi sinyalleme kaskadları aracılığıyla sinyal verir. Bu sinyal olayları sıklıkla, tersine çevrilebilir protein fosforilasyonu ile tam olarak düzenlenmiş bir şekilde çalıştırılır ( 6
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan araştırmaları, Illinois Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Illinois Üniversitesi Hayvan Kaynakları Departmanı (DAR) tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yürütülmüştür.
1. BHK21 Memeli Hücre Kültüründe Protein Lokalizasyonunun Optogenetik İndüksiyonu
NOT: Adım 1.1-1.3, tipik olarak kısa çalışma mesafelerine sahip yüksek büyütme hedeflerine ( örneğin, 63X veya 100X) sahip görüntüleme için bir hücre kültürü haznesi oluşturmak için bir yöntem sağlar. Bu hedefler, görüntüleme altlığı olarak ince bir cam lamelini ( örn., # 1.5, 170 μm kalınlık) gerektirir. Alternati....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Fotoaktive edilebilir protein çiftlerinin rasimetrik ekspresyonu: Şekil 1A , domuz teshovirum-protein çiftlerine dayanan bir bisistronik optogenetik yapı CRY2-mCherry-Rafl-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (CRY2-2A-2CIBN olarak anılacaktır) 1 2A (P2A) peptidi, memeli hücre hatları 42 arasında en yüksek ribozom atlama verimliliğini gösterir. Daha önceki çalışmalarda, CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 için optimal oranın 2: 1 35
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Işık kutusunu oluştururken, tek tek LED'lerin gücü ölçülmelidir. Daha önceki tecrübelere dayanarak, güç çıkışı, üretim varyansına bağlı olarak tek tek LED'ler arasında değişiklik gösterebilir. Birbirinden% 10'luk bir güç çıkışı olan bir dizi LED seçin. LED'lerin sayısı, akım sınırlayıcı direnç ve güç girişi, farklı hücre kültürü kapları tipleri ( örn., 6 kuyucuklu veya 24 kuyulu bir plaka) için değiştirilebilir. 0,2 mW / cm2'lik bir güce 24 saat boyunca ışık uygulanması, tespit edilebilir fo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi (UIUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIGMS R01GM111816) tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cam lamel & nbsp; | VWR | 48393 230 | Canlı hücre görüntüleme için yüzey |
| Lamel tutucu | Yeni Gelen Tedarik | 6817B | Lameller için |
| tutucu Deterjan | ThermoFisher | 16 000 104 | |
| Borik asit | Sigma-Aldrich | B6768-500G | PLL tamponu yapmak için |
| Disodyum tetraborat | Sigma-Aldrich | 71996-250G | yapmak için PLL tampon |
| Plastik beher | Nalgene | 1201-1000 | Lamelleri temizlemek için |
| Sodyum hidroksit | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | pH'ı ayarlamak için |
| Poli-L-lizin hidrobromür | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | lamel kaplaması için |
| Dietilpirokarbonat (DEPC) ile Arıtılmış Su | ThermoFisher Scientific | 750024 | DNA hazırlığı için |
| Kapak Cam Forseps | Ted Pella | 5645 | Kapak camı işleme |
| Doku cutlure tabağı | Thermofisher | 12565321 | Hücre kültürü kabı |
| Steril santrifüj tüpleri | ThermoFisher | 12-565-271 | Tampon depolama |
| Transfeksiyon Reaktifi | ThermoFisher | R0534 | Transfeksiyon |
| CO2 bağımsız ortam | hücre görüntüleme için | ThermoFisher | 18045088 |
| Polidimetilsiloksan (PDMS) | Ellsworth Yapıştırıcılar | 184 SIL ELAST KİTİ 0.5KG | Form hücre odası yapmak |
| Plazmid Maxiprep kiti | Qiagen | 12965 | Plazmid hazırlama |
| DMEM ortamı | ThermoFisher | 11965-084 | Hücre kültürleme ortamı bileşeni |
| F12K ortamı | ThermoFisher | 21127022 | Hücre kültürü ortamı bileşeni |
| At serumu | ThermoFisher | 16050122 | Hücre kültürü ortamı bileşeni |
| Fetal Sığır Serumu | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Hücre kültür ortamı bileşeni |
| Penisilin-Streptomisin-Glutamin | ThermoFisher | 10378016 | Hücre kültür ortamı bileşeni |
| Tripsin (%0,25), fenol kırmızısı | ThermoFisher Scientific | 15050065 | Memeli hücre ayrışması için |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | DNA hazırlığı için |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | Embriyo tamponu için |
| L-Sistein hidroklorür monohidrat | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oosit hazırlama |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | Plazmitlerin doğrusallaştırılması için |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | in vitro transkripsiyon testinde DNA şablonunu çıkarmak için |
| İndeks eşleştirme malzemeleri (daldırma yağı) | Thorlabs | MOIL-20LN | Numune substratı ile objektif arasındaki indeksi eşleştirmek için |
| Mavi LED | Adafruit | 301 | Optogenetik stimülasyon için ışık kaynağı |
| Direnç kiti | Amazon | EPC-103 | akım sınırlayıcı direnç |
| Alüminyum kutular | BUD Industries | AC-401 | ışık kutusu |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | LED dizisi yapmak için |
| Tel Bağlayın | Electronix Express | 27WK22SLD25 | LED dizisi yapmak için |
| Röle Modülü | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | Aralıklı ışık kontrolü için |
| DC Güç Kaynağı | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | LED Silikon için güç kaynağı |
| Güç Head | Thorlabs | S121C | Işık yoğunluğu ölçümü için |
| Güç ölçer | Thorlabs | PM100D ve nbsp; | Işık yoğunluğu ölçümü için |
| Canlı hücre görüntüleme için | Mikroskop | Leica Biosystems | DMI8 |
| Biyogüvenlik Kabini | ThermoFisher | 1300 Serisi A2 | Memeli hücre işleme |
| için CO2 inkübatörü | ThermoFisher | Isotemp | Memeli hücre kültürü için |
| Stereo mikroskop | Leica | M60 | Embriyo mikro manipülasyonu için |
| Mikroenjektör | Narishige | IM300 | Embriyo mikroenjeksiyon için |
| Mikropipet çektirme | Sutter Aletleri | P87 | İğne çektirme |
| in vitro< / em> transkripsiyon kiti | ThermoFisher | AM1340 | in vitro< / em> transkripsiyon için. Kit, nükleaz içermeyen su, SP6 RNA Polimeraz, ribonükleotid karışımı, kapak analogu, lityum klorür çökeltme çözeltisi ve spin kolonu |
| RNA saflaştırma kiti | Qiagen | 74104 | Sentezlenmiş RNA'nın saflaştırılması için silika membran spin kolonu |
| Konveksiyonlu fırın | MTI şirketi | EQ-DHG-9015 | PDMS kürleme |
| Santrifüj karıştırıcı ve teflon kap | THINKY | AR310 | PDMS |
| Silikon gofret | ÜniversitesiGofret | 452 | PDMS ve nbsp cihazları yapmak için taban |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | PDMS |
| Kılcal cam | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Enjeksiyon iğnelerinin imalatı için. nbsp; |
Kaynaklar
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 39....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
