Method Article

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

DOI:

10.3791/55840

⸱

June 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, ultrafast mikroakışkan akışta tek hücreli görüntüleme için asimetrik tespit zamanlı streç optik mikroskopi sisteminin uygulanmasını ve görüntüleme akış sitometrisi uygulamalarını anlatmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok boyutlu veri analizine ve dolayısıyla daha yüksek güvenlikte istatistiksel sonuçlara izin veren ölçülebilir parametrelerin sayısının ölçeklendirilmesi, akış sitometrisinin gelişmiş gelişiminde ana eğilim olmuştur. Özellikle, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yetenekleri eklenmesi, hücresel / alt hücreli yapıların karmaşık morfolojik analizine olanak tanır. Standart akış sitometrelerinde bu mümkün değildir. Bununla birlikte, hücresel işlevler hakkındaki bilgilerimizi geliştirmek için değerlidir ve yaşam bilimi araştırması, klinik teşhis ve çevresel izlemeden yararlanabilir. Görüntüleme özelliklerini akış sitometrisine dahil etmek, öncelikle kamera teknolojilerinde hız ve hassaslık sınırlamaları nedeniyle tahlil çıktısını tehlikeye atmaktadır. Görüntü kalitesini korurken, görüntüleme akış sitometrisi ile karşılaşan bu hız veya verim sorunu üstesinden gelmek için, asimetrik tespit zaman streç optik mikroskopi (ATOM), yüksek kontrastlı, tek hücreli imgeleri etkinleştirmek için gösterilmiştir100.000 hücre / s'ye kadar yüksek bir görüntüleme kapasitesinde, alt hücresel çözünürlük ile görüntüler. ATOM, çok-hızlı genişbant lazer atımlarının kullanımı ile tüm optik görüntü kodlama ve alımına dayanan geleneksel zaman-gerilme görüntüleme konsepti temelinde, etiketlenmemiş / lekelenmemiş hücrelerin görüntü kontrastını arttırarak görüntü performansını artırıyor. Bu, spektral olarak tek atış genişbant darbelerine kodlanmış hücrelerin faz-gradyan bilgisine erişerek sağlanır. Bu nedenle, ATOM, hücre tipleri, durumları ve hatta işlevleri gösteren tek hücreli morfolojinin ve doku bilgilerinin yüksek verimli ölçümlerinde özellikle avantajlıdır. Sonuç olarak, bu, hücrelerin biyofiziksel fenotiplendirme için güçlü bir görüntüleme akış sitometri platformu haline gelebilir ve mevcut en son biyokimyasal işaretleyici tabanlı hücresel testi tamamlayabilir. Bu çalışma bir ATOM sisteminin temel modüllerini oluşturmak için bir protokolü tanımlamaktadır (optik ön uçtan veri p'yeIşleme ve görselleştirme arka plandaki) yanı sıra örnek olarak insan hücreleri ve mikro algler kullanılarak ATOM'a dayalı görüntüleme akış sitometrisinin iş akışı.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optik görüntüleme, birçok hücresel / subselüler bileşenin detaylı mekansal dağılımını (neredeyse) non-invaziv olarak görselleştirmek için güçlü bir araç ve hücre tabanlı tahlil sunar ve böylece hücrelerin morfolojik, biyofiziksel ve biyomoleküler imzalarını açığa çıkartır. Bununla birlikte, tek hücrelerden yüksek içerikli bilgi çıkarabilme kabiliyeti, muazzam ve heterojen bir hücre popülasyonunun araştırılması gerektiği zaman genellikle tehlikeye atılmıştır. Bu durum, ölçüm çıktısı ve içerik arasındaki hücre tabanlı tahlillerde ortak bir dengeyi işaret eder. Dikkat çekici bir örnek, akış sitometrisine görüntüleme kapasitesinin eklenmesinin, klasik olmayan görüntüleme....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Örnek Hazırlama

  1. Numune hazırlama (yapışkan hücreler; MCF-7 hücreleri)
    1. İnkübatörden hücre kültürü çanağını çıkarın ve kültür ortamını boşaltın.
    2. Aşırı kültür ortamı uzaklaştırmak için hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir çanakta yıkayın.
    3. Kültür çanak (100 mm çapında)% 0.25 tripsin bir çözüm 3 ml ekleyin ve 4 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör koydu.
      NOT: Tripsin, hücrelerin yapışkan proteinini çözerek kültür çanağından ayrışır.
    4. Tüm hücrelerin hafif bir mikroskop (10X objektif) kullanarak kültür çanağından ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin. Değilse, yavaşça hücre kültürü çanağın....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ATOM tarafından memeli hücreleriyle (insan periferik kan mononükleer hücre s (PBMC) ve meme kanseri hücreleri (MCF-7)) ve fitoplankton (Scenedesmus ve Chlamydomonas) olan iki tek hücreli görüntüleme gösterimini göstermektedir. İlk deney, kandaki dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) tespiti, sayımı ve karakterizasyonu için sıvı biyopside artan ilgiden dolayı motive oldu. Primer tümör bölgelerinden kan dolaşımına yayılmış CTC'leri ölçme özelliği, metastati.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATOM sistem kurulumu sırasında özel dikkat gerektiren çeşitli teknik ayrıntılar vardır. Birincisi, asimetrik / eğik spektrumla kodlanmış aydınlatmanın emilim kontrastında kalıcı faz-gradyan bileşenleri ( örn., Gölgeleme efekti) oluşturabileceğini ve ATOM'daki faz-gradyan kontrast maddenin arttırılmasını etkileyebileceğini unutmamak gerekir. Dolayısıyla oblik aydınlatmanın bu etkisi en aza indirilmelidir. İkincisi, iki çoğaltmanın içerdiği zaman çoğullama veya zaman ara yerleştirme şemasının, görüntüleme hız.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bay P. Yeung'e MCF-7'yi bizim için hazırladığınız için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Hong Kong Özel İdare Bölgesi, Çin (Proje No: 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 ve HKU 720112E), Yenilik ve Teknoloji Destekleme Programı (ITS / 090/14) Araştırma Hibe Konseyi'nden hibeler tarafından desteklenmiştir. ) Ve HKU Üniversite Geliştirme Fonu'dur.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nikon Plan Florit Fizyoloji Objektifleri 40XNikonMRF07420Objektif objektif (Obj2)
Olympus Plan Florit Objektif, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40XOlympusRMS40X-PFObjektif lensi (Obj1)
N-BK7 Plano-Dışbükey Lensler ThorlabsLA1145-CSpektral duş
FC / APC Fiber Kolimasyon PaketiThorlabsF220APC-1064Lazer darbelerinin çıktısını almak ve toplamak için
Pelikül ışın ayırıcıThorlabsBP145B3Işın kopyası yapmak için
Korumalı gümüş aynaThorlabsPF10-03-P01Işığı yansıtmak için
800-1650nm 12GHz tek modlu DC bağlantılı NIR Fotoğraf alıcısıNewport1544-BIşığı elektrik sinyaline dönüştürmek için
Infiniium Yüksek Performanslı OsiloskopAgilentDSOX91604AIşığa dönüştürülmüş elektrik sinyallerini kaydetmek için
HI1060 fiber optikCorningHI1060Zaman uzatma için optik
fiber YTTERBIYUM KATKILI FIBER AMPLIFIKATÖRKeopsysKPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FAOptik hat içi amplifikatör
Holografik ızgaraWasatch Photonics020305-6Izgara
İnfüzyon / Çekme Şırıngası PompalarHarvard ApparatusPHD 2000Mikro akışkan kanallarda numune yükleme için şırınga pompası

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic ph....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Asymmetric detection Time stretch Optical MicroscopyMicrofluidic Imaging Flow CytometryLabel free High contrast ImagingSingle cell ImagingUltra fast Image CaptureSubcellular Resolution AnalysisTime stretch ImagingOptical Frontend SetupData Processing VisualizationBiophysical Phenotyping Cells

Related Articles