Yöntem makalesi

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

DOI:

10.3791/55840

⸱

28 Haziran 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, ultrafast mikroakışkan akışta tek hücreli görüntüleme için asimetrik tespit zamanlı streç optik mikroskopi sisteminin uygulanmasını ve görüntüleme akış sitometrisi uygulamalarını anlatmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok boyutlu veri analizine ve dolayısıyla daha yüksek güvenlikte istatistiksel sonuçlara izin veren ölçülebilir parametrelerin sayısının ölçeklendirilmesi, akış sitometrisinin gelişmiş gelişiminde ana eğilim olmuştur. Özellikle, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yetenekleri eklenmesi, hücresel / alt hücreli yapıların karmaşık morfolojik analizine olanak tanır. Standart akış sitometrelerinde bu mümkün değildir. Bununla birlikte, hücresel işlevler hakkındaki bilgilerimizi geliştirmek için değerlidir ve yaşam bilimi araştırması, klinik teşhis ve çevresel izlemeden yararlanabilir. Görüntüleme özelliklerini akış sitometrisine dahil etmek, öncelikle kamera teknolojilerinde hız ve hassaslık sınırlamaları nedeniyle tahlil çıktısını tehlikeye atmaktadır. Görüntü kalitesini korurken, görüntüleme akış sitometrisi ile karşılaşan bu hız veya verim sorunu üstesinden gelmek için, asimetrik tespit zaman streç optik mikroskopi (ATOM), yüksek kontrastlı, tek hücreli imgeleri etkinleştirmek için gösterilmiştir100.000 hücre / s'ye kadar yüksek bir görüntüleme kapasitesinde, alt hücresel çözünürlük ile görüntüler. ATOM, çok-hızlı genişbant lazer atımlarının kullanımı ile tüm optik görüntü kodlama ve alımına dayanan geleneksel zaman-gerilme görüntüleme konsepti temelinde, etiketlenmemiş / lekelenmemiş hücrelerin görüntü kontrastını arttırarak görüntü performansını artırıyor. Bu, spektral olarak tek atış genişbant darbelerine kodlanmış hücrelerin faz-gradyan bilgisine erişerek sağlanır. Bu nedenle, ATOM, hücre tipleri, durumları ve hatta işlevleri gösteren tek hücreli morfolojinin ve doku bilgilerinin yüksek verimli ölçümlerinde özellikle avantajlıdır. Sonuç olarak, bu, hücrelerin biyofiziksel fenotiplendirme için güçlü bir görüntüleme akış sitometri platformu haline gelebilir ve mevcut en son biyokimyasal işaretleyici tabanlı hücresel testi tamamlayabilir. Bu çalışma bir ATOM sisteminin temel modüllerini oluşturmak için bir protokolü tanımlamaktadır (optik ön uçtan veri p'yeIşleme ve görselleştirme arka plandaki) yanı sıra örnek olarak insan hücreleri ve mikro algler kullanılarak ATOM'a dayalı görüntüleme akış sitometrisinin iş akışı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optik görüntüleme, birçok hücresel / subselüler bileşenin detaylı mekansal dağılımını (neredeyse) non-invaziv olarak görselleştirmek için güçlü bir araç ve hücre tabanlı tahlil sunar ve böylece hücrelerin morfolojik, biyofiziksel ve biyomoleküler imzalarını açığa çıkartır. Bununla birlikte, tek hücrelerden yüksek içerikli bilgi çıkarabilme kabiliyeti, muazzam ve heterojen bir hücre popülasyonunun araştırılması gerektiği zaman genellikle tehlikeye atılmıştır. Bu durum, ölçüm çıktısı ve içerik arasındaki hücre tabanlı tahlillerde ortak bir dengeyi işaret eder. Dikkat çekici bir örnek, akış sitometrisine görüntüleme kapasitesinin eklenmesinin, klasik olmayan görüntüleme akış sitometrelerine kıyasla en az 1-2 sıra büyüklüğünde bir işlemin aşağı ölçeklendirilmesine neden olmasıdır. Standart akış sitometreleri 1 ile mümkün olmayan karmaşık morfolojik tek hücreli analiz sunabileceği halde, görüntüleme akış sitometrisi genellikle id için yeterli verimlilikten yoksundurYüksek istatistiksel güvenle hücresel heterojenliği sağlayın. Bu, biyolojide yeni buluşlar için ve hastalıkların patogenezini anlamak için gereklidir. Temel teknik zorluk, yaygın optik görüntüleme stratejileri tarafından verilen doğal hız sınırında yatmaktadır: lazer ışını taraması, ( örneğin, galvanometrik aynalar ile) ve / veya görüntü sensörleri ( örneğin, yük bağlı cihaz (CCD) ve tamamlayıcı metal- Oksit yarı iletken (CMOS)). Lazer tarama hızı esas olarak tarama aynalarının mekanik ataletiyle sınırlanırken, CCD veya CMOS çerçeve hızı, görüntüleme hızı ve hassaslık arasındaki temel dengelenme ile sınırlandırılır ( yani, kare hızı arttıkça azaltılmış sinyal algılama hassasiyeti Ve tam tersi).

Tümüyle optik, ultra hızlı görüntü kodlama mekanizmasına dayanan optik zaman-gerilme görüntüleme, yüksek verimli görüntüleme akış siteleri için çekici bir platform olarak gösterilmiştirOmetreler, geleneksel görüntü sensörlerine veya mekanik lazer taramasına gerek kalmadan 2 , 3 . Zaman-gerilme görüntüleme çalışma prensibinin ayrıntılı açıklamaları referans 4 , 5 , 6 , 7'de bulunabilir . Kısaca, iki değiştirilebilir haritalama adımından oluşur: (i) görüntü numunesinin uzamsal koordinatlarının, ışık saçan kirişin 8 , 9 , ve 10'un spektrumu boyunca farklı dalga boylarına eşlendiği spektrum kodlaması (dalga boyu-alan haritalaması) Ve (ii) tekli lazer darbelerinin dalga boyu bileşenleri, grup hız dağılımı (GVD) vasıtasıyla zamansal (dalga boyu taramalı) dalga biçimlerine dönüştürülen (gerdirilmiş) bir dispersif Fourier dönüşümü (dalga boyu zaman eşlemesi) 9 ( Şekil 1 ). Önemli birZaman-germe görüntüleme özelliği, ultra-hızlı fotodeteksiyon ve GVD kaybına bağlı olarak duyarlılık kaybıyla mücadelede kritik bir rol oynayan ve böylece foto-detektör gürültüsü 9 tarafından kontamine olmadan görüntü sinyal-gürültü oranını (SNR) arttıran optik amplifikasyon . Her bir lazer palsı, hücrelerin tek yönlü akışına dik olan görüntülenen örneğin bir çizgi taramasını kodladığından, etkili bir çizgi tarama hızı, tipik olarak 10 MHz'in ötesinde olan lazer tekrar hızı ile belirlenir. Bu çok hızlı işlem, 10.000.000 hücre / s'lik bir işleme ( ör . Geleneksel görüntüleme akış sitometrisinden 10-100 kat daha yüksek) ile bulanık olmayan, tek hücreli görüntü yakalama imkanı sağlar. Sonuç olarak, zaman-gerilimli görüntüleme, yüksek hacimli, tek hücreli, görüntü tabanlı taramada, özellikle bilinmeyen bir heterojenite veya nadir bulunan / sapmış hücreleri önemli bir nüfusta (binlerce ila milyonlarca cel Ls), nadir kanser hücresi taraması 10 veya mikro yosun sınıflaması 11 gibi .

Süre uzatmalı görüntüleme çoğunlukla, 2 , 3 , 9 , 10 , 11 hücrelerinden gelen ışık saçılması ve emilimi ile görüntü kontrastının üretildiği parlak alan (BF) görüntü yakalama özelliğini kullanır. Bu gibi etiketsiz, tek hücreli görüntüleme yetenekleri, sitotoksisite ve photobleaching gibi floresan etiketlerle bağlantılı zararlı etkileri atlayabilir ve yine de hücresel ve alt hücresel doku ve morfolojiye dayanan tekli hücre analizi için değerli bilgiler sağlayabilir. Bu etiketsiz parametrelerin, özellikle muazzam bir hücre popülasyonu olduğunda, hücrelerin derin görüntü sınıflandırması için etkili olduğu kanıtlanmıştır 11 ,"Xref"> 12. Bununla birlikte, birçok durumda, BF görüntüleme, etiketsiz şeffaf hücrelerin ayrıntılı morfolojisini ortaya çıkarmak için yeterli kontrast sağlamaz. 13 , 14 ve 15 numaralı çok hızlı kare hızlarında görüntü kontrastını arttırmak için farklı etiketsiz, faz kontrastlı, zaman gergin görüntüleme yöntemleri geliştirildi. Bu teknikler arasında, Schlieren fotoğrafçılığına benzer bir konsepte dayalı faz-gradyan (diferansiyel-parazit-kontrast- (DIC) benzeri) kontrastı ortaya çıkarmak için asimetrik tespit zaman-streç optik mikroskopi (ATOM) geliştirildi ve etiket- (10 m / s'ye kadar) çok hücreli, yüksek kontrastlı görüntüleme 16 . Bu etki, görüntü kodlamalı kiriş yolunu kısmen bloke ederek veya fotodeteksiyon öncesi kirişi eğmek suretiyle eğik tespit veya aydınlatma yoluyla kolayca üretilebilir. ATOM'un diğer bir avantajı daZıt yöndeki iki faz-gradyan kontrastını eşzamanlı olarak elde etmek için çok yönlülüğü sağlar. İki zıt kontrastlı görüntünün yoğunluk çıkarma ve toplamı, aynı çizgi taramasından sırasıyla diferansiyel faz-gradyan kontrastını ve absorpsiyon kontrastını verir. Bu çalışma ATOM'un optik kurulum, örnek hazırlama ve veri toplama ve görüntüleme dahil olmak üzere uygulanmasını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Özellikle, bu çalışma insan kan hücrelerinin, kanser hücrelerinin ve fitoplanktonun (mikroalgler) tek hücre görüntülemesi ile ATOM işlemini gösterir. Bu, ATOM'un yalnızca biyomedikal alanda değil aynı zamanda deniz ve biyoyakıt araştırmasında 17 , 18 görüntüleme akış sitometrisine uygulanabilirliğini vurgular.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Örnek Hazırlama

  1. Numune hazırlama (yapışkan hücreler; MCF-7 hücreleri)
    1. İnkübatörden hücre kültürü çanağını çıkarın ve kültür ortamını boşaltın.
    2. Aşırı kültür ortamı uzaklaştırmak için hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir çanakta yıkayın.
    3. Kültür çanak (100 mm çapında)% 0.25 tripsin bir çözüm 3 ml ekleyin ve 4 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör koydu.
      NOT: Tripsin, hücrelerin yapışkan proteinini çözerek kültür çanağından ayrışır.
    4. Tüm hücrelerin hafif bir mikroskop (10X objektif) kullanarak kültür çanağından ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin. Değilse, yavaşça hücre kültürü çanağını sallayın.
    5. Tripsin hareketini durdurmak için standart kültür ortamının (% 89 Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 sığır fetüsü serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin (PS) ile formüle edilmiş) 4 mL'yi ekleyin.
    6. TTüm karışımı (tripsin çözeltisi ve kültür ortamındaki hücreleri) bir santrifüj tüpüne atın ve 200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    7. Tüm sıvıyı çıkarın ve 1 mL 1x PBS'de (pH değeri: 7,4, 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılan) hücreleri tekrar askıya alın.
  2. Numune hazırlama (kültürlenmiş mikro algler)
    1. Kültür mikro alglerini ve kültür ortamını ( örn., Deniz suyu, agar veya tatlı su) 1: 5 hacim oranında (mikro algler ila kültür ortamı) yeni cam kültür tüplerine (~ 15 mL) aktarın Yeni bir alt kültür ortamı.
    2. Deneyden önce 72-120 saat boyunca açık / koyu (LD) döngüsüne (genelde LD 16: 8) göre flüoresan ampullerden yapay ışıkla sabit aydınlatma altında cam kültür tüplerini toz geçirmez bir odaya yerleştirin.
    3. Alt kültürlü örnekleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve iyice karıştırın.

2. ATOM Sistem Kurulumu


Şekil 1: Bir ATOM Sisteminin Şeması. (A) bir zaman-gerilme modülüne ve ( b ) bir in-line optik yükselteç modülüne çok hızlı darbeler vermek için bir genişbant darbeli lazer kullanılır. Zaman streç modülü, her biri lazer kaynağının dalga boyu spektrumunun kopyası olan bir geçici dalga formu trenini üretir ( yani, dalga boyundan zaman eşleme). Amplifikatör modülü, darbe gerdirme (dağınık) kayıp telafisi için kullanılır. Gerilmiş darbe, ( c ) bir kırınım ızgarasıyla mekansal olarak dağılır ve tek bir dalga boyu bileşenleri bir röle merceği çifti tarafından iletilir ve objektif mercek tarafından akan hücredeki farklı konumlara ( d ) Mikroakışkan yonga. Bu, spektral kodlamanın işlemi.Spektral olarak kodlanmış ışık hücrenin başka bir objektif lensi ve bir aynadan geçerek, kırınım ızgarasına geri döndürülmesi ve uzamsal olarak dağınık olmayan bir atımlı ışın olarak rekombinasyonuna yol açacaktır. Bu resim kodlanmış darbeli ışın daha sonra ( E ) her iki kirişin elyafa bağlanmadan önce ( f ) bıçak kenarı ile zıt yönden kısmen bloke edildiği şekilde iki yola bölünürler. Bu iki kiriş, nihai görüntünün iki (ters) kodlanmış faz-gradyan kontrastını temsil eder. Her iki sinyal kontrastının aynı anda algılanması için, sinyallerden biri, ( g ) iki sinyalin zaman içinde çoğaltılması (araya sokulması) için bir zaman geciktirme hattından geçirilir. Veri toplama için yüksek hızda bir fotodetektör ve gerçek zamanlı osiloskop kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
  1. Zaman zaman Tekrar test modülü
    1. 800-1,500 nm yakın kızıl ötesi (NIR) aralıkta tavsiye edilen bir merkez dalga boyuyla geniş bant femtosaniye (fs) veya piks (ps) darbeli lazer kaynağı kullanın.
      NOT: Tipik gerekli darbe genişliği, 100 fs'den birkaç ps'e kadar değişebilir. Darbeli lazer kaynaklarının ayrıntılı gereksinimleri Referans 4 ve 5'de görülebilir. Önemli ölçümler Tablo 1'de vurgulanır.
      1. Lazer kaynağının, ATOM'da çok hızlı görüntülemeyi sağlamak için, megahertz rejiminde ( örn. Onlarca MHz) olması gereken yüksek bir tekrarlama oranına sahip olduğundan emin olun. Ayrıca, tepe çıkış lazer gücünü, fiber boşluğunun hasar gücü eşiğinin (yaklaşık 1 kW) çok altında ayarlayın.
      2. Darbeli lazer kaynağının iyi çekim-zamanlı ve spektral kararlılığını sağlayın.
        NOT: Spektral genlik dalgalanmalarındaki tipik tolerans% 1.2 içinde tutulmalıdır 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, bu kurulumda elyaf mod kilitli lazer ile sağlanır.
        NOT: Lazer kaynağının optik bant genişliğinin 10-100 nm olması beklenir ve bu da tek hücreli görüntülemede yeterli görüş alanını (FOV) garanti etmek için önemlidir 21 .
    2. Bir fiber kolimatör vasıtasıyla, lazer darbeli demeti tekli mod dağınık optik elyaf ile birleştirir; buradaki darbeler, grup hız dağılımı (GVD) yoluyla gerilir ( Şekil 1a ).
      NOT: Bu, her darbenin spektrumunun sonra dalga boyu tarama dalga biçimi olarak ( yani, dalga boyu-zaman eşlemesi) eşleştirildiği süreçtir.
      NOT: Toplam gerekli GVD, ATOM görüntüsünün genel çözünürlüğünün dalga boyundan harcanma sürecinden etkilenmediğinden emin olmaya yeterli olmalıdır (Bkz. Tartışma). Tipik olarak, NIR aralığında GVD, 0.1 ns / nm'nin çok ötesinde olmalıdır. Örneğin, bir tek-modlu elyaf,1,060 nm dalga boyu (toplam fiber uzunluğu 10 km) civarında 0,38 ns / nm toplam GVD sağlar.
  2. Spektral kodlama modülü
    1. Şekil 1'de gösterildiği gibi mikroakışkan kanal boyunca akan hücrelerin spektrumu kodlanmış görüntülemesini gerçekleştirmek için bir optik mikroskop sistemi oluşturun.
      NOT: Bu optik mikroskopun ana bileşenleri şunlardır: (1) bir kırınım ızgarası, bir teleskopik röle mercek modülü ( Şekil 1'deki RL1 ve RL2) ve iki objektif lens ( Şekil 1'deki Obj1 ve Obj2).
      1. İlk olarak, zaman-uzatılmış ve paralelleştirilmiş ışını, bir spektral duş oluşturmak için bir kırınım ızgarasına (bu düzenekte transmisyon tipi ızgaralı kullanılır) aydınlatın ( Şekil 1c ).
        NOT: Kırınımlı kirişin gücü ( yani, kırınım etkinliği), tLittrow konfigürasyonuna kapalı ızgaralı yönlendirme.
      2. 4-f görüntüleme sisteminde iki röle mercekini (RL1 ve RL2) yapılandırın ( yani, kırınım ızgarasını RL1'in odak düzlemine yerleştirin ve RL1 ve RL2'yi odak uzaklıklarının toplamına eşit bir mesafeye ayırın.) Spektral duş Obj1 objektif objektifinin arka odak düzlemi üzerine görüntülenecektir).
      3. Obj1'in arka diyaframını doldurmak için spektral duşu dikkatli bir şekilde hizalayın, böylece spektral duş tahmin edilebilir ve mikroskopun görüntü düzlemine odaklanabilir.
        NOT: Burada, objektif lensin NA'sı ( Şekil 1'deki Obj1) 0.75'tir.
      4. Bu objektif lensin arka objektifinin (Obj2) benzer bir NA ve bir düzlem ayna ile başka objektif bir objektifi ( Şekil 1'deki Obj2) yerleştirin, böylece spektral duş demeti görüntü düzlemini iki katına çıkaracak ve Kırınım ızgarası.
      5. ayarlamak(Obj1 ve Obj2), odak düzlemleri birbirleriyle örtüşecek şekilde ayarlayın. Spektral duşun aynı konumda görüntü düzlemini iki kat fazla geçip geçmediğini ve aynı yolu izleyen ızgaraya dönüp dönmediğini kontrol edin. Değilse, optik sistemin daha fazla hizalamasını ve ayarını yapın.
        NOT: İade edilen ışık, ışığın bir asimetrik tespit modülüne iletilebileceği şekilde ek bir kiriş splitterinden geçmelidir.
      6. Optik yükseltici kazancını uygun bir seviyede ayarlayın, böylece elde edilen sinyal, tipik olarak> 10 dB olan iyi bir SNR'ye sahip fotodedektör tarafından algılanabilir.
      7. Mikroakışkan yonganın konumunu numune platformuna yerleştirin ve ayarlayın ve spektral duşun ve dolayısıyla görüntüleme alanının mikroakışkan kanal üzerine yerleştirildiğinden emin olun ( Şekil 1d ).
        NOT: Spektral duş, m içindeki akışkanların akış yönüne dik olarak aydınlatılırAkışkan hareketin otomatik olarak iki boyutlu (2D) taramaları gerçekleştirecek şekilde mikro-akışkan yonga.
  3. Asimetrik tespit modülü
    1. Görüntülenmiş kodlanmış ışını ikiye ayırmak için ek bir ışın demetleyicisi yerleştirin ( Şekil 1e ).
      NOT: Her kiriş kopyası kısmen bir bıçak kenarı tarafından engellenir.
    2. Kiriş bloğundan önce kirişin optik gücünü ölçün ve kaydedin. Ardından, bıçak kenarlarını elle (doğrusal bir çevirme aşamasına monte edilmiş) konumlandırın ve kirişin yarısını kabaca engelleyecek şekilde (görsel denetimle) konumlandırın. Bundan sonra, ışın gücünü izlemek için bıçak kenarlarının konumunu ışın boyunca tercüme ederek ince ayar yaparken optik güç ölçüm cihazını kullanın.
      NOT: Optimum konumun, gücün orijinal değerin ~% 50 oranında düştüğü yer olduğu önerilir ( örn . Engellenmiş durumda). Bu, görüntü sinyalinin en iyi kombinasyonunu sağlayan koşuldur.Güç ve görüntü kontrast geliştirme.
    3. Başka bir kiriş yinelemesi için adım 2.3.2'yi tekrarlayın. Bir kiriş için kısmi kiriş bloğunun yönünün diğer kirişe göre zıt olduğuna dikkat edin ( Şekil 1f ).
    4. İki kısmen bloke edilmiş ışınları, iki fiberli kolimatörlerle iki ayrı, tek modlu elyaf koluna bağlayın.
      NOT: Kollardan birinde, diğer replika (gecikme çizgisi olmadan) için bir zaman geciktirmesi sağlamak için, fiber bazlı bir gecikme çizgisi görevi gören ekstra bir fiber uzunluğu vardır ( Şekil 1g ). Her ikisi de, foto-algılama öncesinde bir fiber birleştirici ile tek bir fibere yönlendirilir. Zaman gecikmesi, iki kopyayı geçici olarak ayırmak için yeterince uzun ve bir sonraki dalga biçimi ile zamansal örtüşmeyi önlemek için yeterince kısa olmalıdır (diğer bir deyişle, iki kopya, algılama öncesinde tek bir elyafta zamana bağlı ve zamanla çoğaltılmıştır ( Şekil 2a )).
    5. kapakAlgılanan optik sinyalleri gerçek zamanlı osiloskop ile inceleyin ve sayısallaştırın. Osiloskopun bant genişliğinin ve dolayısıyla örnekleme oranının, nihai görüntü çözünürlüğünü etkilemediğinden emin olmak için yeterince yüksek olduğuna dikkat edin (Bkz. Tartışma).
      NOT: Burada, 0.38 ns / nm'lik GVD'de sırasıyla> 20 GHz ve> 40 GSa / s'lik bir arka uç edinim bant genişliği ve örnekleme oranı gereklidir.

3. Deneysel İşlemler

  1. Numune yükleme
    1. Standart bir hemositometre içinde klasik bir faz kontrast mikroskop altında hücre sayımı yapın.
    2. Hücre yoğunluğunu 1x PBS (mikro algler için kaynak suyu ile) ile seyrelterek ayarlayın ve bir pipetle iyice karıştırın.
      NOT: Önerilen konsantrasyon 10 5 ila 10 6 hücre / mL arasındadır.
    3. Mikroakışkan yongayı optik görüntüleme sisteminin numune platformuna takın.
      NOT: MikroakışkanÇip öncelikle polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılır ve standart kopya kalıplama yöntemi kullanılarak imal edilir. Mikroakışkan kanal, hücrelerin görüntüleme bölümünde tek bir dosyada (80 μm x 80 μm (yükseklik x genişlik) bir boyutla) yüksek hızda akabileceği şekilde atalet akışı odaklama etkisini yaratmak için asimetrik kavisli bir kanal ile tasarlanmıştır .
    4. Yoğunluğa göre ayarlanmış hücre çözeltisini 10 mL şırıngaya aktarın.
    5. Şırıngayı, mikroakışkan yonganın girişine ve bir santrifüj tüpünü, mikroakışkan yonganın çıkışına, atık toplama işlemi için bağlayın.
    6. Şırıngayı bir şırınga pompasına monte edin ve arzu edilen çıktı vermek için ve hücreler ile kanal arasında aşırı kesme kuvvetinden kaçınmak için uygun bir akış hızı ayarlayın.
      NOT: Numunelerin doğrusal hızı, 0,5 ile 10 m / s arasında olmalıdır. Gerçek görüntü kaydından önce, sistemin daha da ince ayarlanması gerektiği konusunda unutmayın;Görüntü sinyali gücünü ve 2.2.1.4-2.2.1.6 adımlarını yineleyerek görüntü odaklamasını optimize etmek.

4. Veri Toplama

  1. Her deney için kaydedilecek uygun veri noktası sayısını belirleyin. Kaydedilecek veri noktalarının sayısı, numunelerin boyutuna ve akış oranına bağlıdır.
    NOT: Genellikle, 80 GSa / s örnekleme oranı altında 8-16 milyon örnek noktaya ayarlanır.
  2. Osiloskop kullanarak veriyi toplu modelden edinin ve kaydedin.

5. Arka Plan İşlemleri

figure-protocol-1
Şekil 2: Atom Görüntülerinin Hat Tarama Zamanı İzinden Yeniden Yapılanması. Emilim kontrastı ve diferansiyel (yükseltilmiş) faz-gradyan kontrastı ile ATOM görüntülerini yeniden oluşturmak için, iki takım zaman-gerilmiş puls (bkz. Mor ve yeşil pulslar),( A ) Zamanla çoğaltılmış geçici dalga formu izi ve daha sonra dijital olarak parçalanmış ve iki ters faz-gradyan kontrastını gösteren iki 2D görüntüsü oluşturmak için istiflenmiştir. Lazer tekrarlama oranı tahmininde yuvarlama hatasından dolayı alt dizin kaymasını telafi ederek bozulma içermeyen görüntüleri oluşturmak için ( c ) bir kesme işlemine ihtiyaç duyulduğunu unutmayın. ( D ) ham çizgi taramasını lazer kaynağının spektral yoğunluk zarfından çıkararak, görüntülerin arka planı çıkarılabilir. ( G ) Bir absorpsiyon kontrast görüntüsü, görüntülerin ( e ) ve ( f ) bir piksel piksel yoğunluğu toplamı ile elde edilebilirken, ( h ) diferansiyel bir faz-gradyan kontrast görüntüsü, görüntülerin çıkarılmasından elde edilebilir (e ) Ve (f). Daha büyük bir versiyonu görmek için lütfen tıklayınız.Bu rakamın%

  1. Çevrimdışı görüntü yeniden yapılandırması için verileri osiloskoptan bilgisayara aktarın.
    NOT: Burada veriler taşınabilir bir sabit diskte saklanır ve osiloskop ile işlemci bilgisayarları arasında manuel olarak aktarılır. Her bir deney için sabit diskin kapasitesi 500 GB'dan fazla olmalıdır.
    1. Çizgi taramalarını 2D görüntü oluşturmak için dijital olarak istiflemek için anahtar görüntü yeniden oluşturma yordamını kullanın ( Şekil 2 ).
      NOT: Özel program (MATLAB'da), iki zaman çoklu veri kümesini ( Şekil 2'deki mor ve yeşil dalga şekilleri) ayırarak iki asimetrik tespit görüntüsü üretir.
      1. İki asimetrik algılama görüntüsünün yoğunluklarını çıkararak diferansiyel bir faz-gradyan kontrast görüntüsü elde edin; Iki asimetrik tespit görüntüsünü ekleyerek bir emilim kontrast görüntü elde edilebilir. MCF-7 ve mikro yosunların seçilmiş görüntüleriniŞekil 3 . Tek tek görüntülerin arka plan profillerinin öncelikle ortadan kaldırılması ve bunların görüntü yoğunlaştırma ve çıkarma işlemlerinden önce yoğunluklarının normalleştirilmesi gerektiğini unutmayın.
    2. İleriki analizler için, görüntülerden türetilen, hücre hacmi, dairesellik ve emilim yoğunluğu, vb . Gibi parametrelerin bir kütüphanesi oluşturun.
  2. Veri kütüphanesini veri görselleştirme platformuna girin ( Şekil 4 ).
    1. Parametre kütüphanesini ve ilgili yeniden yapılandırılmış görüntüleri görselleştirme arabirim platformuna yükleyin.
    2. Eksenleri, ilgilenilen parametreler olacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Parametreler probleme özgüdür ve kullanıcı tarafından tanımlanır. MATLAB programı tarafından ATOM görüntülerinden türetilirler. Burada, hücrenin optik absorpsiyon yoğunluğu, hücre alanı, hücre hacmi ve hücre dairesiti seçime açıktır.
      3. Görüntülenecek veri kümesini seçin, böylece her hücre görüntüsü dağılım grafiğinde farklı bir veri noktası olarak görüntülenebilir.
  3. Fare işaretçisini her noktaya taşıyın, böylece karşılık gelen görüntü ve diğer parametreler kayan bir alt pencerede gösterilir.
    NOT: Eksenler doğrusal ve logaritmik ölçekler arasında interaktif bir şekilde değiştirilebilir.
  4. Veri setinin herhangi bir alt kümesinin dağılım grafiğini manuel olarak kontrol ederek daha fazla analiz edin.
    NOT: Kapatılan alt kümenin her parametresindeki histogram, kütüphanenin tamamına göre hizalanabilir. Ayrı histogramlar başka bir kayan alt pencerede görüntülenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ATOM tarafından memeli hücreleriyle (insan periferik kan mononükleer hücre s (PBMC) ve meme kanseri hücreleri (MCF-7)) ve fitoplankton (Scenedesmus ve Chlamydomonas) olan iki tek hücreli görüntüleme gösterimini göstermektedir. İlk deney, kandaki dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) tespiti, sayımı ve karakterizasyonu için sıvı biyopside artan ilgiden dolayı motive oldu. Primer tümör bölgelerinden kan dolaşımına yayılmış CTC'leri ölçme özelliği, metastati...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATOM sistem kurulumu sırasında özel dikkat gerektiren çeşitli teknik ayrıntılar vardır. Birincisi, asimetrik / eğik spektrumla kodlanmış aydınlatmanın emilim kontrastında kalıcı faz-gradyan bileşenleri ( örn., Gölgeleme efekti) oluşturabileceğini ve ATOM'daki faz-gradyan kontrast maddenin arttırılmasını etkileyebileceğini unutmamak gerekir. Dolayısıyla oblik aydınlatmanın bu etkisi en aza indirilmelidir. İkincisi, iki çoğaltmanın içerdiği zaman çoğullama veya zaman ara yerleştirme şemasının, görüntüleme hız...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bay P. Yeung'e MCF-7'yi bizim için hazırladığınız için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Hong Kong Özel İdare Bölgesi, Çin (Proje No: 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 ve HKU 720112E), Yenilik ve Teknoloji Destekleme Programı (ITS / 090/14) Araştırma Hibe Konseyi'nden hibeler tarafından desteklenmiştir. ) Ve HKU Üniversite Geliştirme Fonu'dur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nikon Plan Florit Fizyoloji Objektifleri 40XNikonMRF07420Objektif objektif (Obj2)
Olympus Plan Florit Objektif, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40XOlympusRMS40X-PFObjektif lensi (Obj1)
N-BK7 Plano-Dışbükey Lensler ThorlabsLA1145-CSpektral duş
FC / APC Fiber Kolimasyon PaketiThorlabsF220APC-1064Lazer darbelerinin çıktısını almak ve toplamak için
Pelikül ışın ayırıcıThorlabsBP145B3Işın kopyası yapmak için
Korumalı gümüş aynaThorlabsPF10-03-P01Işığı yansıtmak için
800-1650nm 12GHz tek modlu DC bağlantılı NIR Fotoğraf alıcısıNewport1544-BIşığı elektrik sinyaline dönüştürmek için
Infiniium Yüksek Performanslı OsiloskopAgilentDSOX91604AIşığa dönüştürülmüş elektrik sinyallerini kaydetmek için
HI1060 fiber optikCorningHI1060Zaman uzatma için optik
fiber YTTERBIYUM KATKILI FIBER AMPLIFIKATÖRKeopsysKPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FAOptik hat içi amplifikatör
Holografik ızgaraWasatch Photonics020305-6Izgara
İnfüzyon / Çekme Şırıngası PompalarHarvard ApparatusPHD 2000Mikro akışkan kanallarda numune yükleme için şırınga pompası

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
  3. Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
  4. Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
  5. Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
  6. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102(2016).
  7. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
  8. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  9. Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821(2009).
  10. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  11. Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
  12. Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471(2016).
  13. Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
  14. Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001(2014).
  15. Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
  16. Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656(2014).
  17. Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
  18. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  19. Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
  20. Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
  21. Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937(2016).
  22. Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
  23. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  24. Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
  25. Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
  26. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
  27. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259(2013).
  28. Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
  29. Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
  30. Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Asymmetric detection Time stretch Optical MicroscopyMicrofluidic Imaging Flow CytometryLabel free High contrast ImagingSingle cell ImagingUltra fast Image CaptureSubcellular Resolution AnalysisTime stretch ImagingOptical Frontend SetupData Processing VisualizationBiophysical Phenotyping Cells

İlgili makaleler