Yöntem makalesi

İnsan böbrek Perivasküler Stromal hücreler için bir roman klinik sınıf izolasyon yöntemi

8.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55841

⸱

7 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

Bu makalede

Özet

Burada böbrek Perivasküler Stromal bütün organ perfüzyon sindirim enzimleri ve NG2 hücreli zenginleştirme dayalı hücreleri (kPSCs) için bir roman klinik sınıf izolasyon ve kültür yöntem mevcut. Bu yöntemle, hücresel tedavi için yeterli hücre sayıları elde etmek mümkündür.

Özet

Mezenkimal Stromal hücreler (MSCs) yararlı etkileri böbrek hastalıkları ve nakli göstermiştir doku homeostatik ve bağışıklık düzenleyici hücrelerdir. Perivasküler Stromal hücreler (PSC) kemik iliği MSCs (bmMSCs) ile ortak özelliklere sahiptir. Ancak, onlar da, büyük olasılıkla yerel sürecinden, doku özgü özellikleri ve yerel doku homeostazı bir rol oynar nedeniyle sahip. Bu doku özgüllük doku belirli tamir, insan böbreğe içinde de neden olabilir. Biz daha önce insan böbrek PSC'ler (kPSCs) bmMSCs bu potansiyelin yoktu Oysa şifa böbrek epitel yara gelişmiş gösterdi. Ayrıca, kPSCs böbrek yaralanma içinde vivoiyileştirmek. Bu nedenle, kPSCs hücre tedavisi, özellikle böbrek hastalıkları ve böbrek nakli için ilginç bir kaynak oluşturmaktadır. İşte bütün organ perfüzyon renal arter ve zenginleştirme Perivasküler işaretçi NG2 için üzerinden sindirim enzimleri, temel insan böbrek nakli-sınıftan kPSCs için detaylı yalıtım ve kültür yöntemi göstermektedir. Bu şekilde, büyük hücreli miktarları hücresel tedavi için uygun elde edilebilir.

Giriş

Mezenkimal Stromal hücre (MSCs) kemik iliği aslında izole edildi immün düzenleyici hücrelerdir. Onlar onların iğ şeklinde Morfoloji, yağ, kemik ve kıkırdak ve plastik bağlılık ayırt etmek için yeteneği ile karakterizedir. MSCs stromal işaretleri CD73, CD90, işaretçileri CD31 ve CD451,2,3için negatif olurken CD105 hızlı. MSCs doku homeostatik ve immunomodulatory kapasiteleri nedeniyle hücre tedavisi için umut verici bir aday olduğunu. bmMSCs şu anda böbrek hastalıkları ve başka bir yerde4gözden olarak böbrek nakli dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için klinik çalışmalarda incelendiği.

Daha önce bu Perivasküler yağ dokusu da dahil olmak üzere birkaç farklı solid organ, hücreleri, plasenta ve iskelet kası özellikleri MSCs9ile paylaşan gösterilmiştir. Ancak, bu hücreler aynı zamanda organotypic onarım10neden olabilir doku özgü işlevleri sergi. İnsan miyokardiyal Perivasküler hücreleri, örneğin, hipoksi sonra anjiogenik yanıt teşvik ve diğer dokulardan izole Perivasküler hücreleri bu potansiyeller11belli etmedi ise cardiomyocytes farklı.

Perivasküler stromal hücreler de fare12,13,14 ve insan böbrek15,16ayrılmış olabilir. Yaygın olarak kPSCs ile karakterize olan ve bunları bmMSCs karşılaştırıldığında. KPSCs, bmMSCs için benzer immünsüpresif kapasitesine sahip ve vasküler pleksus oluşumu destekleyebilir bulduk. Ancak, doku hücre tipleri, HoxD10 ve HoxD11 nephrogenic transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere bir organotypic transkripsiyon ifadesi imzasını gösterdin kPSCs olarak arasında belirli farklar vardır. kPSCs, bmMSCs, aksine myofibroblast stimülasyon ile TGF-β sonra dönüşüme değil ve adiposit ayırt koyamadık. Ayrıca, kPSCs epitel bütünlük içinde bir böbrek borulu epitel yara karalama yöntemi, bmMSCs ile gözlenen değil bir fenomen hız. Bu gelişmiş yara onarım hepatosit büyüme faktörü yayın aracılı. Ayrıca, kPSCs böbrek yaralanma Akut böbrek yaralanma15, bir fare modeli iyileştirmiştir. Bu nedenle, kPSCs üstün böbrek onarım kapasitesine sahip görünmektedir ve böbrek hastalıklarında hücre tedavisi için ilginç bir yeni kaynak vardır.

Hücre tedavisi amacıyla kPSCs kullanabilmek için kPSCs klinik sınıf enzimler ve protokolleri ile klinik sınıf şekilde izole. Ayrıca, birkaç kPSCs 1 donör tedavisinde edebilmek için yeterli hücre sayıları alınmalıdır. İşte ayrıntılı, kPSCs gelen tüm organ nakli sınıf böbrekler, klinik sınıf izolasyon prosedürü yeterli sayıda klinik hücresel tedavi için kullanılmak üzere hücre verimli göstermektedir.

Protokol

Avrupa konsorsiyumunun (STELLAR) yerel tıbbi etik komitesi ve etik danışma kurulu, esas olarak cerrahi nedenlerle atılan insan nakli dereceli böbreklerin araştırılmasını ve toplanmasını onayladı. Tüm böbrekler için araştırma onayı verildi.

1. Hücre Kültürü için Hazırlıklar

  1. Bir trombosit lizat havuzu hazırlayın.
    1. Son kullanma tarihi 2 günden az olan trombositleri -80 °C'de kullanana kadar (en fazla 1 yıl) saklayın.
      NOT: Trombositler orijinal olarak ticari bir satıcıdan temin edilmiştir. Yerel kan bankası tarafından dağıtılan hastane ihtiyaç fazlası malzemeler elde edildi.
    2. En az 5 donörün (tercihen 10) O / N'sinin trombositlerini 4 ° C'de çözün
      3. .
    3. Trombositleri büyük bir steril şişede toplayın, konik santrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 1.960 x g'da 10 dakika döndürün.
      NOT: Trombositlerin hacmi, donör sayısına ve donör başına hastanedeki fazla materyal miktarına bağlıdır.
    4. Süpernatanı 50 mL'lik bir şırınganın namlusundan kan torbalarına (50 mL / torba) pipetleyin. -80 °C'de saklayın.
  2. Hücre kültürü ortamının hazırlanması.
    1. Bir torba trombosit lizatını 37 ° C'de bir su banyosunda çözdürün.
    2. Torbaya 1 L (yani 2 şişe) Minimum Esansiyel Orta - alfa modifikasyonu (alfaMEM), 5 mL 200 mM glutamin ve 20 mL penisilin (5.000 U/mL)/streptomisin (5.000 μg/mL) (kalem/strep) ekleyin.
    3. 37 °C'de 3 saat inkübe edin.
    4. Torba düz bir yüzeyde dururken torbaya hafifçe vurarak torbayı dejelasyon için sallayın.
    5. Steril 50 mL'lik bir şırınga ile lizatları transfüzyon sisteminin filtresinden çekerek% 5 trombosit lizat ortamını süzün.
    6. Ortamı 50 mL'lik tüplerde alikot edin ve kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Her yeni trombosit lizat partisi, hücre kültüründe test edilir ve her iki partide birleşene kadar ilgilenen hücrelerin (bmMSC'ler veya kPSC'ler) büyütülmesiyle önceki partiyle karşılaştırılır. Hücre sayıları ve canlılığında, yeni partide büyütülen kPSC'ler veya bmMC'ler% 10'dan fazla farklılık göstermemelidir ve akış sitometrisi ile analiz edildiği gibi CD73, CD90, CD105 ve CD31, CD34 ve CD45'in belirteç ekspresyonu farklı olmamalıdır. Hücre kültürü yöntemleri, protokolün 6. bölümünde (kPSC Kültürü) açıklanmıştır.

2. Hücre Hasadı için Hazırlıklar

  1. Çözeltilerin hazırlanması.
    1. 500 mL (1 şişe) Dulbecco'nun Minimum Esansiyel Ortamı (DMEM)-F12'ye 10 mL kalem / strep ekleyerek sade ortamı hazırlayın.
    2. 1 şişe DMEM-F12'ye 50 mL Normal İnsan Serumu (NHS) ve 10 mL kalem/strep ekleyerek yıkama ortamını hazırlayın.
    3. 2.9 mL 1 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 1.2 mL NaHCO3% 2.5 [a / h] ve 160 μL CaCl2 (1 M) ekleyerek enzim stok tamponunu hazırlayın 160 mL Wisconsin Üniversitesi çözeltisine.
    4. >2.000 U / şişe kollajenaz içeren GMP dereceli kollajenaz şişesine yavaşça 20 mL enzim stok tamponu ekleyerek kollajenaz çözeltisini hazırlayın. 4 °C'de yaklaşık 40 dakika çözün. Çözünme süresi boyunca birkaç kez hafifçe çalkalayın.
    5. 5 mL NHS'ye 45 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek dondurma ortamını hazırlayın.
  2. Perfüzyon tepsisinin hazırlanması (Şekil 1A).
    1. Akış kabinini temizleyin ve cerrahi örtülerle örtün. Perfüzyon tepsisini 37 °C'ye ısıtmak için bir su banyosunu yaklaşık 40 - 45 °C'ye ısıtın. Cerrahi önlük ve cerrahi eldiven giyin.
    2. Perfüzyon tepsisini ılık suyla önceden ısıtmak için sterilize edilmiş bir perfüzyon tepsisini su banyosuna bağlayın. Perfüzyon tepsisi dikey konumda olacak şekilde başlayarak perfüzyon tepsisinde hava olmadığından emin olunuz. Gerekirse, perfüzyon tepsisine hava infüzyonunu önlemek için su banyosuna daha fazla su ekleyin.
    3. LS25 tüpünü pompaya yerleştirin. Tüpün her iki steril ucunu da akış kabininde bırakın. Tüpün bir ucuna bir Kocher forsepsini yerleştirin ve perfüzyon tepsisinin dibinde dinlenmeye bırakın. Tıkanmayı önlemek için tüpün üzerine steril bir gazlı bez yerleştirin. Diğer boru ucuna bir Luer konektörü takın.
    4. Perfüzyon tepsisine yaklaşık 100 mL sade ortam ekleyin ve tüpü 100 mL/dk'lık bir pompa hızında yıkamaya başlayın.

3. Böbrek Hücresi İzolasyonu

  1. Böbreğin hazırlanması.
    1. Böbreği çift steril torbalardan çıkarın ve steril perfüzyon tepsisine yerleştirin (Şekil 1B). Perirenal yağ dokusunu ve böbrek kapsülünü makasla ve hafifçe yırtarak çıkarın (Şekil 1C) ve aort yaması üzerindeki renal arteri Şekil 1 D'de gösterildiği gibi tanımlayın.
    2. Renal arteri aksesuar sivri ucu ile kanüle edin, sterilize edilmiş bir bağ yırtığı ile sabitleyin ve pompa açıkken Luer konektörü ile pompa borusu ucuna takın. Tüpler tamamen doldurulmamışsa, önce tepsiye daha fazla orta ekleyin ve pompayı çalıştırarak tüpleri yıkayın (Şekil 1E - F). Böbreği 100 mL / dak'lık bir akışla pompa aracılığıyla düz ortamla yıkayın.
  2. Kollajenaz tedavisi ve böbrek hücresi izolasyonu.
    1. Perfüzyon tepsisine kollajenaz (20 mL, >2.000 U) ve DNaz (2.5 mL, 1 mg / mL) ekleyin (Şekil 1G). Böbreği zaman zaman elinizle nazikçe çevirin. Böbrek yumuşayana ve perfüzyon sıvısı daha az şeffaf hale gelene kadar bekleyin (yaklaşık 30 - 40 dakika).
    2. Bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar böbreğe nazikçe masaj yapın (Şekil 1H) (Şekil 1I). Sindirilmemiş materyali ve renal arterdeki sivri ucu çıkarın.
  3. Böbrek hücrelerinin yıkanması ve toplanması.
    1. Hücre süspansiyonuna 50 mL NHS ekleyin. Pompayı düşük akışa getirerek ve böbreğe ilk bağlı olan tüpü 50 mL'lik tüplerin üzerine yerleştirerek hücre süspansiyonunu perfüzyon tepsisinden boşaltın (Şekil 1J).
    2. 300 ° C'de 7 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peletleri %10 NHS içeren yıkama ortamı ile yıkayın ve tekrar 300 x g'da 7 dakika santrifüjleyin. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Hücre peletlerinin hacmini ölçün ve eşit hacimde hücre kültürü ortamı ekleyin.
    3. Ya hücre süspansiyonuna 1:1 oranında dondurma ortamı ekleyerek hücreleri buradan kriyoprezervasyon yapın ve standart protokollere göre kriyojenik şişelerde saklayın ya da hücreleri kültürlemeye devam edin (bölüm 4).
      NOT: Hücre süspansiyonu, hücre kümeleri içerir ve tek hücreler elde etmek için ekstra adımlar gerektirir, bu da hücre ölümünde bir artışa neden olur. Bu nedenle, hücreler süspansiyon halinde tutulur ve bu aşamada sayılmaz.

4. Ham Böbrek Hücrelerinin Hücre Kültürü

  1. Bir T175 hücre kültürü şişesinde (Şekil 1 K) 24 mL alfaMEM %5 trombosit lizatına (hücre kültürü ortamı) yaklaşık 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 37 °C'de kültür, %5 CO2. Yapışık hücrelerden 2 gün sonra ortamı ve hücre kalıntılarını çıkarın ve ortamı 25 mL hücre kültürü ortamı ile yenileyin.
  2. Aseptik teknikler kullanarak ortamın yarısını (12.5 mL) çıkararak ve taze ortam (12.5 mL) ekleyerek kültür ortamını haftada iki kez yenileyin.
  3. Birleşene kadar kültür (genellikle 5 - 7 gün) (Şekil 1L). Ortamı çıkarın, PBS ile iki kez yıkayın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca her bir T175 şişesine 5 mL tripsin ekleyerek hücreleri tripsinize edin. Kültür ortamında yıkayın ve 490 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.

5. Manyetik Hücre Ayırma ile NG2 için Hücre Zenginleştirme (Şekil 1M)

  1. Hücre ayırma tamponunu üreticinin protokolüne göre hazırlayın.
  2. Tripsinizlenmiş kPSC'leri 10 mL hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. 5 dakika boyunca 490 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri 300 μL hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin.
  3. 100 μL FcR bloke edici reajen/5 x 107 hücre ekleyin, 5 x 10 7 hücre başına 100 μL anti-melanom (NG2) boncuk ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. NG2-pozitif fraksiyonu üreticinin protokolüne göre ayırın. 10 mL ortam ekleyin ve 490 x g'da 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri ekleyin.
  4. Hücreleri, üreticinin protokolüne göre bir Bürker sayma odası kullanarak sayın. Hücreleri bir kültür şişesinde (yaklaşık 4 x 103 hücre /cm2) tohumlayın ve inkübe edin.
    NOT: Hücreleri aşağıdaki konsantrasyonlarda tohumlayın: < 250,000 şişesinde 250,000 - 25,000 T75 şişesinde ve 700,000 - 800,000 T175 şişesinde. Manyetik hücre zenginleştirmesinden sonra, yaklaşık% 1 - 2'lik pozitif bir fraksiyon izole edilir. Bununla birlikte, bu adım hücre sınıflandırma değil hücre zenginleştirme olduğundan, kültürde başka hücre türleri de bulunacaktır (Şekil 1N). Birkaç geçişten sonra (genellikle 4 - 5 civarında), sadece homojen bir kPSC popülasyonu mevcuttur (Şekil 1P).

6. kPSC kültürü

  1. Ortamın yarısını çıkararak ortamı haftada iki kez yenileyin ve yeni çözülmüş kültür ortamıyla değiştirin (Şekil 1N).
    NOT: kPSC'ler, ortamın yalnızca yarısı yenilendiğinde daha canlı ve çoğalabilir olma eğilimindedir.
  2. kPSCs.
    geçirilmesi NOT: kPSC'leri %90 - 100 birleşimde veya 3B yapılar ortaya çıktığında (bkz. Şekil 1O) veya bir haftadan uzun süredir hücre büyümesi olmadığında geçirin. Son ikisi, özellikle hücre zenginleşmesinden sonraki erken geçişlerde ortaya çıkabilir. Bu durumda, geçişten sonra, hücreler genellikle tek katmanlı kültürde tekrar büyümeye başlar (Şekil 1P).
    1. Ortamı %90 - 100 birleşen hücrelerden çıkarın (ortamı daha sonra kullanmak üzere saklayın). Şişeyi PBS ile iki kez yıkayın (T25'te 1 mL, T75'te 5 mL, T175'te 10 mL). Tripsin ekleyin (T25'te 0.5 mL, T75'te 2 mL, T175'te 5 mL) ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Eski ortamı şişeye ekleyin ve yavaşça yeniden askıya alın.
    2. 15 veya 50 mL'lik bir tüpe aktarın (hacme bağlı olarak) ve 5 dakika boyunca 490 x g'da santrifüjleyin. Canlı hücreleri ve plakayı < 250.000 T25'te, 250.000 - 500.000 T75'te veya 700.000 - 800.000 T175'te (yaklaşık 4 x 103 hücre /cm2) sayın.
  3. kPSC'leri pasaj 5 veya 6'da test edin (örneğin, çizik testi, bölüm 7).
    NOT: Yayılan hücreleri standart protokolleri kullanarak akış sitometrisi ile karakterize edin. NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC'nin tümü pozitif, CD31, CD34, CD45 ve HLA-DR'nin belirteç ekspresyonu negatif olmalıdır. Klinik mikrobiyoloji laboratuvarının standart protokollerine göre kültür ortamındaki mikoplazma, bakteri ve mantarları test edin. kPSC'leri bir böbrek epitelyal yara çizik testinde fonksiyonel olarak test edin. Deneyler genellikle pasaj 6-8 arasında yara iyileşme kapasitesine sahip steril, akış sitometrisi ile doğrulanmış homojen kPSC popülasyonları ile gerçekleştirilir.
  4. Standart protokolleri kullanarak 0,5 mL hücre süspansiyonuna (mL kültür ortamı başına 2 milyon hücre) 0,5 mL kriyoprezervasyon ortamı ekleyerek kPSC'leri kriyoprezervasyon yapın.
    NOT: Çözüldükten sonra, kPSC'leri daha yüksek bir yoğunlukta tohumlayın (bir T175'te 106 hücre).

7. kPSC'lerin Fonksiyonel Testi: Böbrek Epitelyal Yara Çizik Testi

  1. kPSC'leri 2 mL kültür ortamında 200.000 hücre / kuyu yoğunluğunda 6 oyuklu bir plakada kültürleyin. 37 ° C'de 48 saat kültürden,% 5 CO2 sonra, süpernatanı toplayın. Bu şartlandırılmış ortamdır.
  2. İnsülin (5 mg/mL), transferrin (5 mg/mL), selenyum (5 ng/mL), hidrokortizon (36 ng/mL), triiyodotironinin (40 pg/mL), epidermal büyüme faktörü (10 ng/mL) ve pen/strep ile desteklenmiş 1:1 oranında DMEM-F12'den oluşan 2 mL Proksimal Tubular Epitel Hücresi (PTEC) ortamında HK-2 (proksimal tübüler epitel hücreleri)17'yi tohumlayın, 6 oyuklu bir hücre kültürü plakasında kuyu başına 500.000 hücre yoğunluğunda.
  3. 37 ° C'de 48 saat kültür,% 5 CO2. HK-2'lerin hücre kültürü ortamını çıkarın ve kuyunun üstünden altına doğru sarı bir pipet noktasının ucuyla bir çizik yaparak HK-2'lerin tek tabakasında bir çizik yarası oluşturun. HK-2'leri PBS ile yıkayın ve kPSC'lerin şartlandırılmış ortamını veya kontrol ortamını ekleyin. Plakanın alt kısmında görüntülenecek alanı işaretleyin.
    NOT: HK-2'ler birleşmiş olmalıdır. Kuyucuk başına iki alan görüntüleyin.
  4. Çiziği 4, 8, 12 ve 24 saatte, ters çevrilmiş parlak alan mikroskobu ile aynı işaretli konumda görüntüleyin.
  5. Kapanma yüzdesini belirlemek için çokgen seçim aracını kullanarak Resim J'deki çizik alanını ölçün.

Sonuçlar

Klinik sınıf kPSCs yalıtım yöntemini şekil 1' de özetlenmiştir. Ham böbrek hücreleri insan nakli sınıf böbrekler collagenase perfüzyon tarafından izole edilmiştir. Elde edilen hücre süspansiyon %5 trombosit lysates birleşmesi kadar kültürlü. O zaman Perivasküler stromal hücre kesir NG2 ifadeye dayalı izole edilmiştir.

kPSCs plastik yapisan seklinde hücreler (Şekil 2A) ve negatif CD31, CD34, CD45 ve HLA-DR (Şekil 2B) için ise CD73, CD90, CD105 ve Perivasküler stromal işaretleri işaretleri NG2, PDGFR-B ve CD146, olumludur. Genellikle, kPSCs homojen bir nüfusa geçiş 4 ulaşılabilir ve kPSCs yaşlanma etrafında geçit 9-10 (Şekil 2C) ulaşır. Bu yüzden deneyler geçit 5-8 arasında gerçekleştirmek için tavsiye ederiz.

Biz daha önce kPSCs şartına orta bu karalama tahlil15dakika içinde epitel yara iyileşmesi hızlandırabilir gösterdiğim gibi izole kPSCs fonksiyonel kapasitesini değerlendirmek için bir vitro böbrek epitel yara karalama tahlil kPSCs, her yeni toplu gerçekleştiriyoruz. KPSC şartına orta kPSCs alphaMEM % 5 trombosit lysates 48 h için kültür ve süpernatant toplama yapılır. Ardından, ölümsüzleştirdi insan böbrek proksimal tübül epitel hücreleri (HK-2)17 birleşmesi kadar kültürlü ve sıfırdan bir yara daha sonra yapılır. O zaman ya kPSCs veya denetim orta şartına orta wells için eklenir ve yara iyileşme hızı ölçülür. KPSCs klimalı ortam eklendiğinde, yara önemli ölçüde daha hızlı (Şekil 2D) kapatır.

figure-results-1
Resim 1 : Klinik sınıf izolasyon yöntemi, insan kPSCs. Organ nakli sınıf böbrek cannulated ve collagenase yolu ile renal arter (A - G) ile derin ve elde edilen hücre süspansiyon yıkanmış ve ya cryopreserved ya da kültür (H - K) koymak. Hücreleri confluency (L) ulaştıktan sonra hücre zenginleştirme olduğunu NG2 (M) gerçekleştirilen. Hücrelerin trypsinized ne zaman onlar are ikisinden biri Konfluent, Proliferasyona veya 3D yapılar (N - P) görüntülenirken durduruldu. KPSCs sürüm ölçütlerini kısırlık, işaretleyici ifade ve (Q) borulu epitel yara iyileşmesi geliştirmek için yeteneği vardır. Oku: renal arter. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Resim 2: karakterizasyonu insan kPSCs. Bir) kPSCs seklinde, plastik yapışık hücreleri vardır. B) kPSCs Mezenkimal işaretleri CD73, CD90, CD105, Perivasküler işaretleri NG2, PDGFR-β ve CD146, negatif CD31, CD34 ve CD45 için süre için olumludur. kPSCs express MHC sınıf ı (HLA-ABC) ama değil sınıf II (HLA-DR). C) Akış Sitometresi üç farklı kPSC bağışçılardan büyüme özellikleri (Bölüm 4), homojen NG2 olumlu nüfus doğruladı. kPSCs yaşlanma etrafında geçit 9-10 ulaşmak. D) kPSCs böbrek epitel onarım bir yara karalama tahlil geliştirmek edebiliyoruz. Temsilcisi görüntüleri kontrol orta ve şartına kPSC orta t = 0, 4, 8 ve 12 h gösterilir. A ölçek çubuğu) = d 200 µm) 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Perivasküler hücreleri pankreas, yağ, kıkırdak ve böbrek9,15,16da dahil olmak üzere birçok farklı insan solid organ, izole edilmiştir. Pek çok yöntem, ancak, küçük parçalara ve daha sonra sindirim enzimleri ile tedavi doku örnekleri temel alır. Ayrıca, bu genellikle klinik sınıf ürünleri ile gerçekleştirilir. Bu bu stratejileri daha az doğrudan klinik çeviri için uygun klinik-grade hücrelerinin büyük miktarlarda gerekli nerede yapar.

İşte insan kPSCs bir roman yalıtım yöntemini perfüzyon klinik sınıf enzimler ve malzemelerle dayalı tüm organlar için göstermektedir. Bizim Merkezi18klinik uygulamada için kullanılmakta olan klinik adacıkları of Langerhans yalıtım protokolden adapte iletişim kuralıdır.

Bu ilk klinik sınıf yöntem nereye kPSCs büyük miktarlarda elde edilebilir. Değişkenlik hücre verim büyük ölçüde bağımlı verici. Ancak, ne zaman biz şu anda üç farklı bağış ham hücre süspansiyon bir kısmını elde hücre verim yaygınlaştırılması, teorik olarak, 2.7 x 1012 kPSCs donör başına ortalama bir verim elde edilebilir. MSC tedavisi genellikle 1-2 x 106 hücreler/kg vücut ağırlığı42 hücre infüzyon oluşur, bu hücre sayıları birden fazla hastada allojenik tedavisi için yeterli şunlardır.

Yalıtım yordamdaki bir kritik adım collagenase sindirim süresi kadardır. Sindirim süresi çok kısa olduğu durumlarda hangi kültür için daha zor olacak büyük kümeleri doku kalır. Perfüzyon dönem çok uzun olduğunda, artan hücre ölümü gözlenen. Bu nedenle, böbrek yumuşak ve sıvı daha az şeffaf olmaya başladığı anda böbrek hafifçe masaj ve collagenase tedavi kesilmelidir.

Başka bir önemli adım NG2 hücre zenginleştirme sonra hücrelerin kültürdür. NG2 hücre zenginleştirme bazen sonra Perivasküler hücreleri çoğalırlar veya 3D yapılar büyümeye başlar başlamaz. Bu durumda, hücreleri trypsinized ve reseeded olduğunda, hücreleri genellikle monolayer kültüründe büyümeye başlayacak.

Malzeme başlangıç olarak, esas olarak cerrahi nedenlerle atılan insan nakli sınıf böbrekler kullanılmıştır. Bu büyük fibroz olmadan fonksiyonel organları vardır. Bu nispeten nadir olduğu gibi bu bir sınırlama olabilir kabul ve organ kaynak elde etmek zor. Explanted böbrekler başka bir kaynağı olabilir; Ancak, bağlı olarak böbrek explantation nedeni, bu böbrekler daha fazla fibrozis ve böylece myofibroblasts içerebilir ve myofibroblasts izole ve Perivasküler hücreler yerine kültürlü olabilir bu yana bu nedenle özen gösterilmelidir.

KPSCs izole olarak bu protokolü göstermek ile organo-typic özellikleri böbrek epitel ile şifa kapasiteleri15, kPSCs böbrek hastalıklarında hücre tedavisi yara ve nakli ilginç bir gelecek uygulama olurdu. Bu amaçla, hücre/ürün teslimat birkaç stratejileri vardır. İlk strateji kPSCs, IV infüzyon şu anda bmMSC klinik çalışmalarda kullanılan gibidir. Başka bir ilginç uygulama kPSCs veya makine perfüzyon nakli önce kPSC atılır faktörler kullanımıdır. Bu şekilde, hangi sonra nakli için geliştirilmiş Böbrek fonksiyonlarının neden olabilir explanted böbrek kalitesini artırmak. Hem stratejileri için kPSCs daha fazla klinik amaçlar için keşfetmek için ilginç bir yeni hücre kaynağı vardır.

Açıklamalar

D.G.L., M.A.E., ve T.J.R. bir patent başvurusu ile ilgili bu araştırma ile ilişkilidir. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu araştırma Avrupa toplumun yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) fon hibe sözleşme numarası 305436 altında aldı STELLAR.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Baxter çantalarıFenwalR4R-7004
İnsan trombositleriSanquinhastanesi fazla malzemesi 2 günden daha az bir süre için sona ermiş kullanılır
trombosit lizatözel yapım
Tek kullanımlık steril şişelerCorning09-761-11
500 mL PP santrifüj tüpleriCorning431123
a-MEM ortaLonzaBE12-169F
glutamaxtermo balıkçı35050038
kalem/strep İnvitrojen15070063
transfüzyon sistemiCodan455609
DMEM-F12yaşam teknolojileri11320-074
Normal İnsan Serumu (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3 7.5% LonzaBE17-613E
CaCl< alt>2 1 MSigma-Aldrich10043-52-4
UWHayata köprü32911
HeparinLeo Pharma
kollajenaz NB1 GMP sınıfıSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100ml
cerrahi örtüler3M NederlandDH999969404
perfüzyon pompasımetrohmx007528300
pompa kafasımetrohmx077202600
perfüzyon tepsisiözel yapım
LS25 masterflex tüplerMasterflexHV-96410-25
aksesuar başakGambro DASCO6038020
pulmozymeRoche
kültür şişeleri 25 cm2< / sup>greiner690175
kültür şişesi 75 cm2< / sup>greiner658170
kültür şişesi 175 cm2< / sup>greiner661160
Tripsinsigmat4174
Sığır Serum Albümini (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
FcR bloke edici reaktifmiltenyi130-059-901
anti melanom boncukları (NG2)miltenyi130-090-452
hücre süzgeci 70 ve mikro; mCorning352350
LS sütunlarıMiltenyi130-042-401
MACS mıknatısmiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD 
CD45 APCBD 
555485 CD146 PEBD 
NG2 APCAr-Ge DFAB2585A
CD90 PEBD 
HLA ABC APCBD 
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD 
CD56 PEBD 
CD73 PEBD 
CD31 FITCBD 
CD133 PEmiltenyi130-090-853
PDGF-r Ar-Ge Dmab 1263
fare IgG1 FITCBD 
fare IgG1 PEBD 
fare IgG1 APCBD 
IgG2b PEBD 
keçi anti fare PEDakoR0480
sodyum azidMerck822335
DMEM Jambon ' s F12Gibco31331-028
ITS (insülin, transferrin, selenyum)SigmaI1884
hidrokortizonSigmaH0135
triiyodotironininSigmaT5516
Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)sigmaE9644
Ölümsüzleştirilmiş insan renal PTEC (HK2)M. Ryan'ın izniyle, Dublin üniversite koleji
555821550315555596555555559866555516550257555445345815345816345818555743

Kaynaklar

  1. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
  2. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  3. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  4. Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
  5. Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
  6. Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
  7. Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
  8. Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
  9. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  10. Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
  11. Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
  12. Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
  13. Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
  14. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
  15. Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  16. Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
  17. Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
  18. Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Perivask ler Marker NG2T m Organ Perf zyonuEnzimatik SindirimManyetik H cre Ayr mYara izme DeneyiH cre K lt r ProtokolRenal Arter Kan lasyonuKollagenaz Sindirimi

İlgili makaleler