Bu protokol, farklı olarak farklı Vibrio parahaemolyticus yüzücü ve swarmer hücrelerinin tek hücreli mikroskobu sağlar. Yöntem, tek hücreli analiz için kolayca bulunabilen bir swarmer hücreleri popülasyonu üretir ve hücre kültürlerinin hazırlanmasını, swarmer farklılaşmasının indüksiyonunu, numunenin hazırlanmasını ve görüntü analizini kapsar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Proteinlerin hücre içi lokalizasyonunu inceleme kabiliyeti birçok hücresel sürecin anlaşılması için gereklidir. Buna karşılık, bu, bakteri toplulukları içinde varolan hücreleri görüntülerken özellikle zorlayıcı olabilen floresan mikroskopisi için tekli hücreler elde etme yeteneğini gerektirir. Örneğin, insan patojeni Vibrio parahaemolyticus sıvı koşullar altında kısa çubuk şeklindeki yüzücü hücreler olarak bulunur ve yüzey teması üzerine katı yüzeyler üzerinde büyümek için uzmanlaşmış oldukça genişlemiş swarmer hücrelerin bir alt popülasyonuna ayrılır. Bu yazıda V. parahaemolyticus'un iki farklı durumundaki tek hücreli floresans mikroskobu analizini gerçekleştirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, V. parahaemolyticus'un daha canlı bir hücre yaşam döngüsüne çok reproducibly farklılaşmasına neden olur ve katı yüzeyler üzerindeki proliferasyonunu kolaylaştırır. Metod, t lekelerinden uzanan farklı swarmer hücrelerinin fişeklerini üretir.O sürü koloni kenarında. Özellikle, sürü alevlerinin ucunda, daha sürükleyici hücreler, tek bir hücrenin katmanında bulunur; bu da, bir mikroskop lamına kolay aktarılmalarına ve daha sonra tek hücrelerin izlenmesi için flüoresans mikroskobu görüntülemelerine olanak tanır. Ek olarak, bakteri toplumlarının demografik temsili için görüntü analizinin iş akışı sunulmaktadır. Prensip olarak, V. parahaemolyticus'un yüzücü ve swarmer hücrelerindeki kemotaksis sinyal dizilerinin hücre içi lokalizasyonunun analizi açıklanmaktadır.
Giriş
Bakteriler sürekli olarak dış ortamlarında değişiklikler yaşarlar ve davranışlarını buna göre değiştirmek ve uyarlamak için çeşitli teknikler geliştirdiler. Böyle bir mekanizma, değişen çevreyi daha iyi tamamlayan farklı hücre türlerine farklılaşmayı içerir. Farklılaşma çoğunlukla hücre döngüsünün düzenlenmesinde, hücre morfolojisindeki ve hücrelerin zamansal organizasyonunda büyük değişiklikler içerir. Farklılaşabilen bir organizma Vibrio parahaemolyticus'tur . V. parahaemolyticus genellikle taze veya tuzlu suda yaşayan bir proteobakteriler ailesi olan Vibrionaceae'ye aittir. Vibrionaceae , çevrede yaygın olarak bulunur ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Elektro-yetkili V. parahaemolyticus Hücrelerinin Hazırlanması ve Plasmid DNA'nın Yüzücü Hücrelere Elektroporasyonu
NOT: Protokolün aşağıdaki bölümü, elektro-yetkili hücrelerin hazırlanmasına ve ardından plazmid DNA'nın yüzücüler hücrelerine elektroporasyonuna olanak tanır. Floresan proteinler bir plasmidden ektopik olarak eksprese ediliyorsa, bu adım önemlidir.
- V. parahaemolyticus hücrelerini -80 ° C gliserol stoğundan, 100 μg / mL ampisilin ihtiva eden taze bir LB agar plakasına çekin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, tek bir V. parahaemolyticus koloni ile 20....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Farklılaşma ve toplayıcı koloni üretiminin teşvik edilmesi
Şekil 1 , V. parahaemolyticus'un toplayıcı kolonilerinin üretilmesiyle ilgili önemli adımların bir şemasını sunmaktadır ( Şekil 1A-C ). Sürücüler kültürü sürü-agar üzerinde gözlendi ve 24 o C'de inkübe edildi, katı agar yüzeyi üzerinde swarmer farklılaşması ve çoğalması sağladı. Bir sürü koloninin tems.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, V. parahaemolyticus swarmer hücrelerinin mikroskopik görüntülemesi için bir yöntem ve bunun ardından, çalışılan floresanla işaretlenmiş proteinlerin subselüler lokalizasyonunu ve diğer özelliklerini çözmek ve nicelleştirmek üzere akış aşağı analizler sunulmaktadır. Mikroskopi görüntü işleme ve analizi için 14 , 15 , 16 , 17 , 18 için çeşit.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan edilmedi.
Teşekkürler
Bu çalışma Max Planck Topluluğu tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ortam bileşenleri< / güçlü > | |||
| LB orta | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granül | BD | 214510 | LB besiyeri ile LB agar hazırlanması için |
| Difco Kalp İnfüzyonu Agar | BD | 244400 | HI agar sürü plakalarının hazırlanması için |
| Agarose NEEO, ultra kalite | Roth | 2267.3 | Mikroskopi agaroz pedlerinin hazırlanması için |
| Adı< / güçlü > | < güçlü > Şirket< / güçlü > | < güçlü > Katalog Numarası< / güçlü > | < güçlü > Yorumlar< / güçlü |
| > < güçlü > Katkı Maddeleri< / güçlü > | |||
| L-arabinoz | Roth | 5118.3 | pBAD türevlerini |
| 2,2'-Bipiridil | indüklemek için kullanılırSigma Aldrich | D216305-25G | HI agar sürüleme plakalarının hazırlanması için |
| Kalsiyum klorür dihidrat | Roth | 5239.1 | HI agar kaynatma plakalarının hazırlanması için |
| Ampisilin sodyum tuzu | Roth | K029.3 | |
| Kloramfenikol | Roth | 3886.3 | |
| PBS tamponu | - | Fosfat tamponlu tuzlu su için | |
| D (+) Sükroz | Roth | 4621.1 | Elektroyetkin hücrelerin hazırlanması için |
| Gliserol | Roth | 3783.5 | Elektroyetkin hücrelerin hazırlanması için |
| Ad< / güçlü>< | güçlü>Şirket< > | Katalog Numarası< / strong> | Yorumlar< / strong> |
| Donanım< / strong> | |||
| Petri kabı 150 mm x 20 mm kamlı | Sarstedt | 82.1184.500 | HI agar sürü plakalarının hazırlanması için |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus-HI | agar sürü plakalarını kurutmak için kullanılır | |
| Gen Pulser Xcell Mikrobiyal Sistem | BioRad | 1652662 | Plazmid DNA'nın elktroporasyonu için kullanılır< |
| strong>Name< | strong>Company | Katalog Numarası | Yorumlar< |
| strong>Software | |||
| MetaMorph Offline (sürüm 7.7.5.0) | Moleküler | Cihazlar-Mikroskopi görüntü analizi için kullanılır | |
| Excel | Microsoft-Mikroskopi | veri analizi için kullanılır |
Kaynaklar
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
