Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Summary

Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır.

Abstract

Hücresel süreçler karmaşıktır ve çoklu hücre tipleri ve çevreleri arasındaki etkileşim sonucunda ortaya çıkmaktadır. Mevcut hücre biyolojisi teknikleri çoğu zaman bu etkileşimin doğru yorumlanmasına izin vermez. Kantitatif görüntüleme tabanlı bir yaklaşım kullanarak, heterojen hücre popülasyonlarının dinamik fenotipik tepkilerini ( yani morfoloji değişiklikleri, çoğalması, apoptozisi) çevre uyaranlarındaki değişikliklere karakterize etmek için yüksek içerikli bir protokol sunuyoruz. Uygulamaya bağlı olarak, flüoresan yoğunluğuna veya doğal morfoloji özelliklerine dayalı hücre tiplerini ayırt etme yeteneğimizi vurguluyoruz. Bu platform, geleneksel hücre biyolojisi tahlillerine kıyasla daha kısa süreler, daha az reaktif miktarı ve hata olasılığı düşük iken pertürbasyona alt popülasyon yanıtının daha kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, bazı vakalarda, hücre popülasyonlarının belirlenmesi zor olabilir ve karmaşık cellu bazında nicelendirilebilirDaha fazla sorun giderme gerektirecektir; Protokolde bu koşulların bazılarını vurguluyoruz. Bu uygulamayı bir kanser modelinde uyuşturucuya tepki kullanarak göstermek; Bununla birlikte, diğer fizyolojik süreçlere daha kolay uygulanabilir. Bu protokol, bir ortak kültür sistemi içinde alt popülasyonları tanımlamaya ve her ikisinin de dış uyaranlara verilen tepkileri karakterize etmesine izin verir.

Introduction

Hücre bazlı tahliller, temel araştırma ve ilaç geliştirme ayarlarında önemli bir yere sahiptir. Bununla birlikte, bu standart tayinlerin sınırlamaları, in vitro ve klinik veriler arasındaki uyumsuzluk ve çoğu ilaçların FDA onayını almaması nedeniyle giderek daha belirgin hale gelmiştir. Burada, eşzamanlı olarak ortaya çıkan çevre uyarılarına yanıt olarak heterosellüler fenotipleri eş zamanlı olarak analiz etmek için kantitatif görüntülemenin kullanılması için yeni bir yöntem sunuyoruz.

Hücrenin yaşayabilirliğini ölçmek için kullanılan geleneksel hücre bazlı tahliller şunları içerir: tripan mavisi dışlama testleri, MTT / MTS ve Annexin V-FITC akış sitometrisi boyaması. Tripan mavisi dışlama testleri, basit ve ucuz olsa da, çok sayıda hücre gerektirir, zaman alıcıdır ve genellikle kullanıcı tarafından önyargılanmadan etkilenir ¹ . MTT ve MTS tahlilleri, mitokondriyal metabolik hız ölçümleri yoluyla dolaylı olarak hücre yaşayabilirliğini ölçer. Bununla birlikte, metabolik aktiviteHücrelerin türleri, yanlış sonuçlara yol açan ve hücre tipleri ve koşulları ^{2 , 3'te} standartlaşmayı önleyen farklı kültür koşullarından (örneğin, ortam veya oksijen konsantrasyonu) etkilenebilir. Bu tekniklerin bir başka büyük dezavantajı, çoklu hücre tiplerini ayırt edememeleridir - çoğu biyolojik sistem heterosellülerdir. Akış sitometrisi yöntemleri çoklu hücre popülasyonları arasında ayırt etme yeteneğine sahipken, hücre etiketleri gereklidir, dinamik örnekleme zorludur ve yapışkan hücreler kullanıldığında bu uygulama zaman alıcı ve hata eğilimli hale gelir.

Morfolojik değişiklikler de dahil olmak üzere diğer önemli hücresel fenotipler, çevresel uyaranlara yanıt olarak ortaya çıkar ancak geleneksel hücre bazlı tahliller tarafından yakalanmaz. Hücre durumlarını morfolojik karakterizasyon yoluyla profilleme ve benzerliklerini örnekler arasında haritalama,Temel hücre biyolojisi ve ilaç keşfi de dahil olmak üzere temel ve translasyonel araştırmaların birçok yönüne yeni anlayışlar kazandırmak. Ayrıca, tümör hücresi morfolojisinin tümör alt tipi ⁵ ve saldırganlık ⁶ ile korele olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla, bu hücresel özellikleri ve bunların belirli çevresel rahatsızlıklarla nasıl ilişkili olduklarını incelemek çok önemlidir. Ek olarak, ortak kültür sistemlerinde alt popülasyonlar arasında ayrım yapmak için morfolojik özelliklerin farklılıklarını kullanabilir. Floresan olarak etiketlenen hücrelerin düşüşleri vardır ( yani doğal hücre özelliklerini değiştirerek zaman alıcıdır) ve bu nedenle hücre tiplerini sınıflandırmak için ilave yöntemler avantajlıdır.

Mikroskopi tabanlı görüntüleme, hücresel fenotipe çok katlı, kantitatif ve sağlam bir şekilde profil oluşturmada alternatif bir yöntemdir. Bu el yazmasında, nicel görüntüleme hattını, evriminBir tümör içindeki heterojen hücre popülasyonlarının nary dinamikleri. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) hücreleri ile tümörlerde bulunan en yaygın stromal hücre türü Kanserle İlişkili Fibroblastlar (CAF) arasındaki etkileşime odaklanırız. CAF'ler tümörün başlatılması, ilerlemesi ve terapötik tepki ile ilişkilendirilmiştir; Bu nedenle CAFs yokluğunda tümör hücreleri üzerinde fenotipik analizler yapmak ^{7 , 8 , 9} yanıltıcı olabilir. Özellikle, KKH'lerin klinik tedavisinde sıklıkla kullanılan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörünü (EGFR) hedefleyen küçük bir molekül olan erlotinib'e yanıt olarak CAF'lerin tümör hücreleri üzerindeki etkilerini değerlendirdik. Değerlendirme için yüksek içerikli bir tarama platformu ve eşlik eden görüntü analiz yazılımını kullandık; Bununla birlikte, bu metodolojiyi diğer araştırmacılar tarafından erişilebilir kılmaya yönelik bir girişimde, açık kaynaklı yazılımları kullanarak karşılaştırılabilir bir aşağı akış protokolü geliştirdik:CellProfiler ¹⁰ ve CellProfiler Analisti ¹¹ . Çoğu görüntü tabanlı yüksek içerikli tarama testleri, belirli bir enstrüman modeline özgü ticarileştirilmiş yazılımlarla analiz edilir. Altta yatan algoritmalar genellikle tescilli olduğundan sonuçları farklı yazılımlarla diğer laboratuvarlarda çoğaltmak zordur. Bu görüntü temelli boru hattını kullanarak, her iki floresans ve morfoloji bazlı sınıflandırmayı kullanarak, ilaç tedavisine yanıt olarak bir heterosellüler kültüre ait her bir alt popülasyonun hücre çoğalması, ölümü ve morfolojisi ölçülmüştür. Aşağıdaki protokol karmaşık hücresel proseslerin problanması için sağlam bir metodoloji sağlar.

Protocol

1. Hücre Kültürü

NOT: Akciğer fibroblastları (CCD-19Lu GFP) ile birlikte kültürlendiğinde, burada NSCLC hücrelerinin (H3255) fenotipik yanıtları EGFR hedefleyici ajan erlotinib'e araştırılmıştır. Aynı veri seti için, iki hücreli popülasyonun (H3255 ve CCD-19Lu GFP) florasan esaslı ve morfolojiye dayalı sınıflamaları, uyumlarını örneklemek için gerçekleştirildi. Bununla birlikte, yalnızca bir sınıflandırma metodunun kullanılması gerekmekte ve uygulama temel alınarak seçilmesi gerekmektedir.

1. % 10 ısı ile inaktif FBS ve% 1 penisilin / streptomis ile desteklenmiş 500 mL RPMI-1640 hazırlayın.
   NOT: Büyüme ortamı ve takviyeleri diğer hücre tipleri için gerektiği gibi değiştirilebilir.
2. 37 ° C'de% 5 C02'de saf popülasyonlar olarak 10 cm3 plakalarda kültür hücreleri ve 3-4 günde bir uygun oranda geçirin.

2. Hücrelerin Hazırlanması

1. Bir hücre süspansiyonu hazırlamak için, cOrtamları çalkalayın ve hücreleri 5 mL 1X Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) ile yıkayın.
2. PBS'yi aspire edin, 37 ° C'ye kadar ısıtılan 1 mL% 0.05'lik tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin (veya hücreler artık plakaya yapışana kadar).
3. Tripsin nötralize etmek için H3255 ve CCD-19Lu GFP plakalarına 4 mL RPMI ekleyin ve hücre solüsyonlarını 15 mL konik tüplere pipetleyin.
4. RT'de 5 dakika boyunca 150 xg'de hücreleri santrifüjleyin.
5. Süpernatantı aspire edin ve topak hazırlamak için konik tüpler içinde RPMI medya 10 ml hücre peletleri tekrar süspansiyon haline getirin.

3. Hücre Kaplama

1. Tohumu standartlaştıracak hücreleri sayın.
   1. Çözeltilerdeki hücreleri karıştırmak için tüpleri tersine çevirin. Bir mikrosantrifüj tüpü içine her bir hücre süspansiyonu 10 mcL Pipet ve 10 mcL trypan mavi ekleyin.
   2. Bir hücre sayma slaydına bu çözeltiden 10 μL pipetleyin ve otomatik hücre sayacına yerleştirin.
      NOT: Diğer hücre sayımı yöntemleri ( örn.. Hemositometre) kullanılabilir.
   3. Hücre sayısını en az üç kez tekrarlayın veya elde edilen sayılar tutarlı olacak şekilde yapın.
2. Çok iyi plaka üzerine tohum hücreleri
   NOT: Çekilecek tabaklar sayısı görüntülenecek olan zaman noktalarının sayısına bağlıdır. Alternatif olarak, hücreler, histone-2B-GFP (veya yeterli nükleer bölünme sağlayan diğer kararlı lentiviral nükleer lekeler) ile transforme edilirse, bir plaka zamanla yeniden görüntü haline getirilebilir.
   1. 100 mcL RPMI'de toplam 1.500 hücre / kuyu tohumlandı. Üç hücre popülasyonunu plakaya üç hücre süspansiyonu hazırlayın: H3255, CCD-19Lu GFP ve% 50 H3255 +% 50 CCD-19Lu GFP. Her bir zaman noktası için her birini aynı plakalarla üçlü olarak yapın.
      NOT: İlk ekim yoğunluğu, her hücre hattı ve plaka boyutu için optimize edilmelidir.
   2. Çok kanallı bir pipet kullanarak 3 x 96 oyuklu plakalarda tohum hücreleri. Hücreleri O / N 37 ° C,% 5 CO _2'de inkübe edin.

4. İlaç Dozajlama

1. 10 mM konsantrasyonda nihai bir erlotinib stok solüsyonu yapmak için erlotinib tozuna DMSO ekleyin.
   NOT: İlaç istenildiği şekilde ikame edilebilir.
2. İlacı hücre kültürü ortamı ile, 10 uM'de en yüksek nihai konsantrasyona sahip olan nihai konsantrasyonun 2 katı olacak şekilde seyreltin ve toplam beş ilaç konsantrasyonu ve ilaç kontrolü olmaksızın, 1: 10 oranında dört defa seyreltin.
   NOT: DMSO konsantrasyonu, en yüksek ilaç dozunda% 0.1 v / v'ye eşitse veya bunu aşarsa, gözlemlenen etkilerin DMSO toksisitesinden kaynaklanmadığından emin olmak için hiçbir ilaç kontrolü eşdeğer miktarda DMSO içermemelidir.
3. Ortamda seyreltilmiş 1x'lik nihai bir ilaç konsantrasyonu için uygun çözeltiye 100 μL'lik ilaç solüsyonu pipetleyin.

5. Görüntü Edinimi

NOT: Görüntüler 0, 2 ve 3. günlerde elde edildi. Çalışılan hücre tiplerine ve hücresel proseslere bağlı olarakArzu edilen zaman noktaları çalışılabilir.

1. Leke hücreleri görüntülemeye hazırlanın.
   1. Boya çözeltisini, aşağıdaki son konsantrasyonlarda hazırlayın.
      1. Floresan bazlı sınıflandırma için PBS içinde 5 μg / mL nükleer leke ve 5 uM ölü hücre lekesi hazırlayın (Malzeme Listesine bakın).
      2. Morfoloji bazlı sınıflandırma için 5 μg / mL nükleer leke, 5 uM ölü hücre lekesi ve PBS'de 5 μM hücre lekesi hazırlayın (Bkz . Malzeme Tablosu ).
   2. Her göze 20 μL boya çözeltisi ekleyin. Işıktan korunarak 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
2. Optimize edin ve görüntü elde edin.
   1. Kuluçka makinesinden çanağı çıkarın, plakanın tabanını% 70 EtOH ile silin ve plakayı görüntüleme odasına yerleştirin.
   2. 'Kurulum' sekmesinde, kanal seçimi bölümüne uygun kanallar eklemek için 'Kanal Seçimi'nin altındaki' + 'düğmesini tıklayın.Görüntü ( yani parlak alan, nükleer leke, ölü hücre lekesi, GFP ve RFP sinyalleri).
   3. 'Düzen Seçimi'ni tıklayın ve odak düzlemini tanımlamak için 0 μm'den başlayan ve 20 μm'de biten her 2 μm'de z istifli test görüntüleri alın. Bu mesafeyi her kanal için 'Yükseklik' altına girin.
   4. Ağırlıkları değerlendirmek ve pozlama sürelerini optimize etmek için her kanalın altındaki 'Anlık Görüntü'yü tıklayın. Gerektiğinde 'Zaman' başlığının altına daha yüksek veya daha düşük değerler girin.
   5. Ekranın sağ tarafında, plaka şemasında uygun oyukları (görüntülenecek) vurgulayın. Aşağıdaki kuyu şasesinde, benzer şekilde görüntülenecek yirmi beş alanı vurgulayın.
   6. Yukarıdaki kanallarda gri ölçekli TIFF görüntüleri oluşturmak için 'Deneme Çalıştır' altında, sol sekmede 'Plaka Adı' içindeki plakayı belirleyin ve resim edinme protokolünü 10X'lik bir hedefle çalıştırmak için 'Başlat' düğmesine (altındaki) tıklayın.
      NOT: Adım adım yöntemGörüntüleme protokolü için rölötikler aletler arasında farklılık gösterebilir ancak parametre değerleri yine de optimize edilmelidir.
   7. İkinci ve üçüncü günlerde görüntülemeyi tekrarlayın.

6. Görüntü Analizi

NOT: Tüm görüntü analizi, tescilli yazılım kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu genel olarak mevcut olmadığı için, CellProfiler 2.2 ve CellProfiler Analyst 2.0'da aşağıda listelenen kısa bir protokol ve ek materyal olarak sunulan ayrıntılı protokol ile karşılaştırılabilir analizler de tasarlanmıştır (test görüntüleri iş akışını test etmek için boru hatlarına önceden yüklenmiştir). Bu deneydeki görüntüler, her kuyunun ayrı ayrı yüklenebilmesi için kuyu başına de gruplanmıştır. Aşağıdaki CellProfiler boru hatları, her resim dosyasından meta veri bilgilerini ayrıştıran ve görüntülerin kanal tarafından daha da gruplandırılmasını sağlayan bir normal ifade içermektedir.

1. Açık kaynak yazılımını indirin ve yükleyin: 'CellProfiler9; Ve 'CellProfiler Analisti'. Yükleme sırasında tüm varsayılan seçenekleri ve eklentileri kabul edin.
2. Heteroselüler kültürleri alt popülasyonlara sınıflandırın.
   1. 'CellProfiler' yazılımını açın, 'Dosya' | 'İthalat Boru Hattı' | 'Dosyadan' ve uygun dosyayı seçin (floresans tabanlı sınıflandırma için "Fluorescence_Classification.cppipe" veya morfoloji tabanlı sınıflandırma için "Morphology_Classification.cppipe").
      NOT: Bu dosyalar temel görüntü işleme ve çekirdek / hücre bölütlemesi için protokoller içerir. Bu hücreler arasında bulunan düzensiz Hoechst lekesi nedeniyle, çekirdekler bölünmüş ve büyütülmüş ve daha sonra çekirdeklerin daha düşük yoğunluklarla bölümlenmesine olanak tanımak için görüntüyü maskelemek için kullanılmıştır.
      1. Hücreleri, eGFP yoğunluğuna dayalı olarak H3255 veya CCD-19Lu olarak sınıflandırmak ve morfoloji özelliklerini hesaplamak için flüorüre dayalı sınıflandırma boru hattını seçin.
         NOT: CCD-19Lu hücreler GFP ile transforme edildi.
      2. Çekirdekleri ve hücreleri segmentlere ayırmak ve morfoloji özelliklerini hesaplamak için morfolojiye dayalı sınıflandırma boru hattını seçin.
         NOT: Sınıflandırma için 'CellProfiler Analyst' de daha aşağı doğru analiz gereklidir. Ölü hücreler, flüorüre dayalı sınıflandırma yoluyla sınıflandırılır.
   2. Ekranın sol alt köşesindeki 'Çıktı Ayarlarını Görüntüle'yi tıklayın. Analiz amaçlı görüntü dosyalarının konumunu ('Varsayılan Giriş Klasörü') ve çıkarılan verilerin hedefini ('Varsayılan Çıktı Klasörü') seçin.
   3. Analiz işlemine başlamak için 'Analiz Et görüntüleri' seçeneğini tıklayın. Analiz tamamlandığında, hesaplanan verileri görüntülemek için 'Tamam'ı tıklayın ve' Varsayılan Çıktı Klasörüne 'gidin.
      NOT: Örnek parametre değerleri ve resimleri Ek Dosya 1-CellProfilerProtocol.pdf'de mevcuttur .
   4. Morfolojiye dayalı sınıflandırma için (yalnızca) aşağıdakileri yapın.
      1. 'CellProfiler Analyst' yazılımını açın, CellProfiler'de oluşturulan veritabanı özellikleri dosyasını seçin ve 'Aç' seçeneğini tıklayın.
      2. Ekranın sol üst kısmındaki 'Sınıflandırıcı' sekmesini tıklayın. Denemeden rastgele hücre görüntüleri çağırmak için 'Getir'i tıklayın; Resimler sınıflandırılmamış pencerede görünecektir.
   5. Hücreleri uygun kutuya seçip sürükleyerek elle hücreleri pozitif (H3255) veya negatif (CCD-19Lu) olarak sınıflandırın (bkz. Ek Dosya 2-Boru Hattı.pdf: Şekil B ). Alt popülasyon başına en az 50 hücre sınıflandırdıktan sonra, 'Sınıflandırıcıyı Eğitin'i tıklayın ve ardından' Progress'i izle'yi tıklayın.
      NOT: Hücreler, kullanıcı denetimli random orman makinesi öğrenme algoritması ¹² üzerinden sınıflandırılır. Doğruluk onaylanmış eşiğin (>% 90) üzerinde değilse, geri dönüp 'CellProfiler' üzerindeki hücre segmentasyonunu optimize etmek gerekebilir veya hücreler sınıf için ideal olmayabilirMorfoloji ile yenerek.
   6. Her alt popülasyon için hücre sayıları içeren bir tablo oluşturmak için 'Tümüne Puan Ver'i tıklayın.

Results

Toplam 4050 bireysel görüntü için üç tablaya karşı 25 alan / oyuk, 54 oyuk / plaka (3 hücre popülasyonu x 6 ilaç konsantrasyonu x 3 kopya) içeren bir görüntü seti ürettik. Deney boyunca üretilen görüntü setleri, hücrelerin alt popülasyonlarının sınıflandırılmasında kullanılan çeşitli kantitatif özellikteki hücrelerin ( örn., Morfoloji, flüoresan) özümlenmesi için tescilli yazılım kullanılarak analiz edildi (materyal tablosuna bakınız). Bununla birlikte, kullanılan ticari yazılımın erişimi sınırlı olduğundan, CellProfiler ve CellProfiler Analyst'de karşılaştırılabilir downstream boru hatları oluşturuldu.

Alt popülasyonlara Heteroselüler Sınıflandırma

Çekirdekler, DNA lekesi (burada Hoechst) temel alınarak tanımlandı ve parçalara bölündü ve hücre popülasyonları floresans veya mo'yaRfoloji ( Şekil 1 ). Floresan bazlı sınıflandırma için, fibroblastlar (CCD-19Lu) daha önce GFP-lentivirüs ile dönüştürülmüştür. GFP yoğunluk seviyeleri her çekirdek için ölçüldü ve kabul edilen eşiğin üstünde hesaplanan (arka plandaki sinyal temelli) CCD-19Lu olarak sınıflandırılırken, aşağıda belirtilenler tümör hücreleri olarak tanımlandı (H3255). Morfolojiye dayalı sınıflandırma için, hücreler daha önce toksik olmayan bir hücresel leke ile boyandılar (materyal tablosuna bakınız) ve bu sitoplazmayı tanımlamak ve parçalamak için kullanılmıştır. Her bir popülasyondan ~ 50-100 hücre ile bir makine öğrenme algoritması eğitildi. Popülasyonlar arasında önemli derecede farklı olan, daha sonra CCD-19Lu ve H3255 hücrelerini ayırmak için doğrusal bir sınıflandırıcı tasarlamak için kullanılan morfolojik özellikler belirlendi. Floresan ve morfoloji sınıflandırma protokolleri, iki hücre popülasyonunu ayırt ederken uyumlu% 97.4 (n = 1403) idiVe ilaçla tedavi edilen koşullarda (1 μM erlotinib)% 92.5 (n = 916) uyumlu bulunmuştur ( Şekil 2 ).

Alt popülasyonların fenotipik analizleri

Hücre tipleri arasında ayrım yapmanın yanı sıra, her alt popülasyonun fenotipik özelliklerini karakterize etmeyi amaçladık. Çoklama analizleri, zamandan ve reaktiflerden tasarruf sağlar, tutarlılık katar ve incelenen sistemle ilgili ek bilgi sağlar. Birçok potansiyel fenotipik çıktı vardır ve bunları ilginç sorulara dayanarak seçmelidir. Burada erlotinib tedavisine yanıt olarak hücre morfolojisi ve canlılık durumundaki değişiklikler araştırılmıştır. İlaç tedavisinden üç gün sonra, H3255 hücrelerinin nükleer alanındaki azalma ve hücresel alanın artışı gözlendi ( Şekil 3A ). Nükleer alan arasındaki ortalama farkIki taraflı tip-2 (eşit varyans) t- testi ( p = 7.92 x 10 ^-16 ) yoluyla "ilaçsız" ve "ilaç" uygulanan popülasyonların istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulundu. Bu gözlemin uyuşturucu tedavisi tarafından strese verilen hücresel bir yanıt olduğunu varsayarız.

Ayrıca, bir ilacın, hücreler üzerinde sitotoksik ( yani , ölü hücrelerin sayısının zaman içinde artması) veya sitostatik ( yani , hücre doğumlarının zaman içinde azalması) etkisi olup olmadığının derin klinik etkiye sahip olup olmadığının incelenmesi ilgi çekicidir. Örneğin, bir sitostatik ilaç etkisi, büyümeyi durdurmaya neden olur, ancak hücreleri tümörden ortadan kaldırmaz, böylece kanser hücreleri ilaç uzaklaştırıldıktan sonra hücre proliferasyonunu yeniden başlatma potansiyeline sahiptir. İlaç etkileri genellikle bağlam, konsantrasyon ve hücre türüne bağlı olabilir. Bir hücre tipinde erlotinib'in sitotoksik bir yanıt ortaya çıkardığını daha önce gözlemledik, buna karşın acBaşka bir dilde ytostatik yanıt ¹³ .

Geleneksel canlılık testleri nispi hücre sayısını verir ve bu nedenle büyüme tutuklamaları ile hücre ölümü arasında ayrım yapmaz. Burada, ölen hücreler, propidyum iyodür lekesine dayanılarak tanımlandı ( Şekil 3B ). Erlotinibin H3255 hücrelerine karşı hem sitotoksik hem de sitostatik etkileri gözlendi, ölümlerin sayısında bir artış ve ilaç tedavisi sonrasında doğum sayısı azaldı ( Şekil 3C ). Hücrenin temizlenmesi yüzünden muhtemelen 1. günden sonra ölen hücrelerin sayısının düştüğü belirtilmelidir. CCD-19Lu hücreleri ilacından etkilenmedi. Bu platformun ek bir avantajı, nicel veri üretmektir. Örneğin, eş-kültür deneyimizde, 1178 (% 75.8) H3255 hücresinin ilk alt popülasyonunun erlotinsiz veya erlotinsiz üç gün sonra 2.817 (% 87.9) veya 396 (% 57.2) olduğu tespit edildiIb tedavisi (sırasıyla Şekil 4 ). Göreli yüzde yerine fiili hücre sayıları üretebildiğimiz için (akış sitometrisi yöntemlerinde olduğu gibi), ilaç tedavisi esnasındaki kompozisyon değişikliğinin CCD-19Lu'da bir artış değil, H3255 hücrelerinde bir azalmaya bağlı olduğu sonucuna vardık. Deneysel olarak değerlendirilmesi zor ve muhtemelen hücre tipleri arasında farklılık gösteren hücre boşluğu nedeniyle ölüm oranlarının hafife alınabileceği hiçbir şeyin değeri yoktur.

Şekil 1: Görüntü Analizi Protokolüne Genel Bakış. Hem morfolojiye dayalı sınıflandırma hem de flüoresans temelli sınıflandırma kullanarak heterosellüler popülasyonları sınıflandırmak için iki potansiyel downstream görüntü analizi boru hatları. Ölçek çubukları = 100 μm. Lütfen onu tıklayınBu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için e tuşuna basın.

Şekil 2: Morfoloji ve Floresan Temelli Sınıflandırma Arasındaki Uyumluluk. ( A ) İki sınıflandırma protokolünün örtüşmesini gösteren eşzamanlılık arsası. Aynı hücreler, hem morfoloji hem de flüoresan bazlı sınıflandırma kullanılarak H3255 olarak sınıflandırıldı. İki protokol, tedavi edilmemiş hücrelerin% 97.4'ü (n = 1403) ve erlotinib ile tedavi edilen hücrelerin% 92.5'i (n = 916) sınıflandırılmıştı (Not: beyaz alan görselleştirilemeyecek kadar küçüktür). ( B ) flüoresan esaslı ve morfolojik tabanlı sınıflandırma arasındaki iyi ve kötü eşzamanlılık örneklerini gösteren 10X görüntü. Beyaz oklar, platformlar arasında tutarsız olarak sınıflandırılan hücrelere işaret ediyor. Giriş görüntüsü: mavi çekirdekler (Hoechst); Yeşil - CCD19Lu (GFP). SınıflandırmaFication görüntüleri: Kırmızı - H3255; Yeşil - CCD-19Lu. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Tek Deneysel Kurulumdan Multiplexed Fenotipik Ölçümler. ( A ) Çekirdek ve hücre alanı gibi morfolojik özellikler, ilaç varlığında ve yokluğunda tek hücre seviyesinde hesaplandı. Not: 100 μm2'den küçük ölçülen hücre alanları enkaz olarak kabul edildi ve analizlerden hariç tutuldu. Kutu çizimi, birinci ve üçüncü çeyrek aralıklarla ve% 95 güven aralığı hata çubuklarıyla medyanı göstermektedir. ( B ) H3255 (mavi) ve CCD-19Lu (yeşil) hücreler birlikte kültürlenmiş ve propidin yoğunluğuna göre ölü hücreler tespit edilmiştirIyodür boyası (kırmızı) ve 10X objektif kullanılarak görüntülendi. Ölçek çubuğu = 1 mm (üst panel); 100 μm (alttaki görüntüler). ( C ) Yaşayan ve ölen hücrelerin toplam sayısı, erlotinib ilavesi ile canlı hücrelerin sayısının belirgin bir şekilde azalması ve ölü hücrelerin artması ile, ilaç tedavisi olsun veya olmasın üç gün boyunca hesaplandı. Hata çubukları, üç kopyaya dayanan ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: Zaman Üzerindeki Alt Popülasyon Dinamikleri. 0 veya 3. günde uyuşturucu ve ilaçsız H3255 (mavi) ve CCD-19Lu (yeşil) içeren kuyulardan temsilcilerin 10X görüntüsü. Her alt popülasyona ait hücreler sayılmış ve orantılı pasta grafikleri aNumuneler arasındaki nüfus kompozisyonunda ctual değişim. Ölçek çubukları = 1 mm (orta paneller, en soldaki panelde), 1 mm (üst resim), 100 μm (alttaki görüntüler). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Yukarıda açıklanan protokol, azaltılmış reaktifler ve zaman kullanırken çevresel bozulmalara yanıt olarak çoklu hücre tiplerinin fenotipik dinamikleri hakkında daha kapsamlı bilgiler sağlayarak mevcut hücre biyolojisi tahlillerini geliştirir. Bu deneysel tasarımın önemli bir avantajı, tek bir kurulumla birden fazla fenotipi analiz etme ve bu fenotipleri tek bir hücre düzeyinde karakterize eden nicel veriler üretme yeteneğidir. Bu platformun teknik avantajlarından biri, diğer tahlillere kıyasla ilk sorun gidermenin kolay olmasıdır. Bu yöntem görüntü tabanlı olduğundan, belirgin fazla/eksik tohumlama için kuyucuklar görselleştirilebilir. Deney süresince hücrelerin üstel büyüme aşamasında olması ve besin veya mekansal kısıtlamalarla sınırlandırılmaması veya kıt tohumlama nedeniyle yaşlanma nedeniyle karıştırılmaması tavsiye edilir. Aksi takdirde, doğum ve ölüm oranları deneyler arasında tekrarlanamayabilir. Referans olarak, CellPD, doğum ve ölüm oranlarının hesaplanması için halka açık bir programdır¹⁴. Ek olarak, her bir kuyucuğa yeterli konsantrasyonda boya eklenip eklenmediği görselleştirilebilir. Tek bir kuyudaki pipetleme sorunları, yanlış segmentasyona ve çarpık verilere neden olabilir, ancak yukarıda belirtilen protokolle kolayca tespit edilebilir.

Ne yazık ki, tüm hücre tipleri bu uygulamaya uygun olmayabilir. Çekirdekleri ve hücreleri doğru bir şekilde segmentlere ayırabilmek önemlidir, bu nedenle daha küre benzeri veya kümelenmiş yapılarda organize olan hücrelerin analizi uygun olmayabilir. Bazı hücreler için, tek hücrelerin ilk tohumlanmasını sağlamak için tohumlamadan önce bir hücre süzgeci kullanmak da avantajlı olabilir. Ek olarak, doğrusal sınıflandırıcı tekniği yalnızca morfoloji özelliklerine göre kolayca ayırt edilebilen hücre tiplerine uygulanabilir.

Protokolün başarısı için, aşağı akış analizlerinin geçerliliği görüntülerin kalitesine bağlı olduğundan, öncelikle görüntüleme koşullarını optimize etmek önemlidir. Burada yüksek içerikli bir tarama platformu kullanarak deneyler gerçekleştirirken, görüntü elde etme herhangi bir floresan mikroskop kullanılarak da gerçekleştirilebilir (otomatik bir görüntüleme platformu yüksek verimli yaklaşımlar için ideal olsa da). Mikroskop veya protokolle ilgili herhangi bir sorun olmadığından emin olmak için her görüntüleme zaman noktasından önce test görüntüleri alınmalıdır. Özellikle segmentasyon için kullanılacak kanallar (yani çekirdekler, hücre lekeleri) için sinyal/gürültü oranı yüksek olmalıdır. Ek olarak, optimum odak düzleminde görüntü almak önemlidir. Görüntüler odak dışındaysa, segmentasyon çok daha zor hale gelir ve hesaplanan morfolojik özellikler muhtemelen yanlış olacaktır. Alanlar arasındaki aydınlatma farklılıkları, görüntü segmentasyonunda da sorunlara neden olabilir. Parlaklıktaki büyük farklılıklar, eşik değerlerinin otomatik seçimini zorlaştırır. Ek olarak, hücreler arasında heterojen floresan yoğunlukları varsa, tek bir eşik değeri bir görüntüdeki tüm hücreleri yeterince segmentlere ayırmayabilir. Bu analizde, daha parlak ve daha sönük hücre popülasyonları etrafında maskeler oluşturularak ve her popülasyon ayrı ayrı bölümlere ayrılarak bu sorunların üstesinden gelindi.

Bu protokolde araştırılan fenotipler canlı, ölü ve morfolojik karakterizasyon ile sınırlı olsa da, diğer özellikleri araştırmak için kolayca genişletilebilirler. Örneğin, fonksiyonel genetik çalışmalar, RNAi, aşırı ekspresyon veya diğer kimyasal bozulmalarla eklenebilir.

Bu yazıda, protokolün küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücrelerinin CAF'lerin varlığında ve yokluğunda erlotinib'e yanıtını ölçme yetenekleri gösterilmiştir. Ancak bu, test edilebilecek birçok hücre tipi ve mikroçevresel parametrenin yalnızca bir örneğidir. Bu protokolü, hasta tümörlerinden izole edilen birincil hücreler de dahil olmak üzere diğer hücre tipleri ve ilaç çalışmaları ile kullanılmak üzere genişlettik^13,15.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Corning	10-040-CV	hücre kültürü ortamı
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Gemini	100-106	orta takviyesi
Penisilin/streptomisin	Gibco	15-140-122	orta takviyesi
TC20	Biorad	1450102	hücresi sayacı
TC20 tripan mavisi	Biorad	1450003	hücreli slaytlar sayaç slaytları
96 oyuklu plakalar	Corning	3904	şeffaf alt siyah plakalar
Erlotinib	LC Laboratories	E-4007
DMSO	VWR	317275-100ML	ilacı yeniden askıya almak için çözelti
Hoechst	Invitrogen	H21491	nükleer boya
Promidyum İyodür (PI)	İnvitrojen	P1304MP	ölü hücre boyası
Hücre İzleyici Turuncu CMRA	Yaşam Teknolojileri	C34551	tam hücre lekesi
Operetta yüksek içerikli görüntüleme sistemi	Perkin Elmer
CellProfiler	Broad Institue	sürüm 2.2.0 (rev 9969f42)	http://cellprofiler.org/releases/
Hücre kültürü inkübatörü			Herhangi bir hücre kültürü inkübatörü uygun olacaktır - hücreler 37 >m altında kültürlendi; %5 CO2.
15 mL'de C Falcon konik tüpler	Falcon	14-959-53A
10 cm2 hücre kültürü plakaları	TPP	93040