Yöntem makalesi

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

DOI:

10.3791/55848

⸱

10 Ocak 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 3School of Biomedical Engineering, Drexel University, 4Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 5Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurotrauma ve nörodejeneratif hastalık genellikle neden kayıp nöronlar değiştirmek ve aksonal yolları yeniden oluşturmak için merkezi sinir sistemi (MSS) sınırlı kapasitesi nedeniyle nörolojik açıkları kalıcı. Ancak, sinir sistemi gelişimi, nöronal göç ve aksonal uzantısı sırasında sık sık "yaşam iskele" anılacaktır diğer hücreleri tarafından kurulan yollar boyunca oluşur. Bu mekanizmalar taklit etmek ve MSS inhibitör ortamının circumvents bir strateji tasarlamak için arayan, bu el yazması mühendislik doku imal etmek bir protokol sunar astrocyte tabanlı "yaşam iskele". Bu yapıları oluşturmak için kendi kendine bipolar somata boyuna hizalanmış ve süreçlerin yoğun üç boyutlu demetleri monte astrocytes ikna etmek için bir roman biomaterial mantolama düzeni çalıştırmaya başladık. İlk, içi boş hidrojel mikro-sütunları toplandı ve iç Lümen kollajen hücre dışı-matriks ile kaplanmış. Disosiye serebral kortikal astrocytes sonra silindirik mikro-sütun ve kritik iç çapı, Lümen içine teslim < kendiliğinden kendini hizalanmış ve yoğun demetleri oluşan uzun elyaf benzeri kabloları üretmek için sözleşmeli 350 µm astrocyte süreçleri ve kollajen liflerinde ölçme < çapı henüz birkaç cm uzunluğunda uzanan 150 µm. Bunlar yaşam iskele sergilenen Mühendislik > % 97'si hücre canlılığı ve neredeyse sadece edildi bir arada ara filaman proteinler fibrillary gliyal asidik protein (GFAP'nin), vimentin, ifade ve testin astrocytes oluşur. Bunlar ağlar için nöronal ek izin veren bir substrat sağlamak bulundu ve neurite uzantısı uyumlu astrocyte uyumlu. Ayrıca, bu yapıları korumak bütünlüğü ve CNS implantasyon için uygundur hidrojel mantolama üzerinden ayıklandığında hizalama. Bu ön şekillendirilmesi yapıları, yapısal olarak doğal olarak meydana gelen anahtar cytoarchitectural öğeleri taklit "iskele yaşayan" içinde vivogliyal tabanlı. Bu nedenle, bu mühendislik yaşam iskele nörogelişimsel mekanizmaları vitro çalışma veya neuroregeneration nöronal göç ve/veya CNS dejenerasyon içinde vivo takiben aksonal kılavuz yönlendirerek kolaylaştırmak için test-yatak olarak hizmet verebilir .

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sistemi (MSS) kaybı ve/veya nöronlar ve travmatik beyin hasarı (TBY), gibi koşullar eşlik aksonal yolları disfonksiyon karşı koymak için sınırlı bir kapasiteye sahip inme, omurilik yaralanma (SCI) ve nörodejeneratif hastalık1 ,2,3,4,5. MSS neurogenesis beyin, kayıp nöronlar6,7restorasyonu engelleyici alanda sınırlı sayıda sınırlıdır. Ayrıca, MSS kayıp aksonal yollar rejenerasyon yönlendirilmiş rehberlik eksikliği, akıbet inhibitörleri ve reaktif astrogliosis sinir dokusu2,8' ehasar takip varlığı nedeniyle yetersiz olduğunu, 9,10. Astrocytes genellikle nöronlar iyon Homeostazı, nörotransmitter gümrükleme, sinaps oluşumu ve11kaplin nörovasküler yardımcı çeşitli işlevlere sahiptir. Yine de, onlar Hipertrofik devlet11' e geçiş olarak sinir dokusu hatta hafif hasar, moleküler, yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri astrocytes meydana gelebilir. Şiddetli neurotrauma yanıt olarak, bu bir yara oluşumuna geçirme reaktif astrocytes ve parçalanmış kan - beyin bariyerini (BBB), microglia sızan lökosit içerir bir lezyon çekirdek içeren bir penumbra ile değiştirilmesinden, oligodendrocytes ve fibroblastlar11,12,13. Bu reaktif astrocytes ipliksi, dağınık süreçlerin bir Morfoloji ulaşmak ve ara filaman proteinler ve nöral rejenerasyon12engel kondroitin sülfat Proteoglikanlar (CSPGs), artan ifadesi sergilemek. Gliyal yara başlangıçta BBB bütünlüğünün ve sağlıklı dokuyu çevreleyen inflamatuar yanıtın iletimini önlemek yardımcı olur olsa bile, bu axon rejenerasyon12,14 karşı fiziksel ve biyokimyasal bariyer olarak hizmet vermektedir ,15,16. Örneğin, gliyal yara karşılaşma aksonlar soğanlı distrofik büyüme koniler görüntülemek ve büyüme12bodur. Ayrıca, astrositik süreçleri dağınıklığı yaralanma sonra aksonlar17Yenileyici uzantısı engellemektedir. Bu inhibitör özellikleri sonucu hastaların Tby ve bilimler de dahil olmak üzere ağır neurotrauma sonra acı kez kalıcı fiziksel ve nörolojik bozukluklar içinde kendini gösteriyor

MSS fonksiyonel rejenerasyon karşı karşıya dışsal sorunları ne olursa olsun, akson yeniden oluşturmak için içsel bir yeteneğine sahip gösterilmiştir. Örneğin, gliyal yara ile temas distrofik büyüme koniler dinamik doğası bu sonlar12genişletmek için kapasitelerini korur düşündürmektedir. Sonuç olarak, bu aksonlar yeniden büyüme için bir ana engel sonrası yaralanma CNS ve gliyal skarlasma ve/veya yara izi arasında rejeneratif köprüler olurdu sağlayan azaltılması yoluyla fazla izin veren bir ortam sağlayan inhibitör bir ortamdır inanılıyor avantajlı. Gerçekten de, önceki çalışmalarda CNS nöronlar aksonlar periferik sinir grefti axon rejenerasyon12,18için daha uygun bir ortam mevcut köprüler olarak kullanarak bir lezyon üzerinden uzanan yetenekli olduğunu göstermiştir, 19. Çeşitli stratejiler tüylerinin bu rejeneratif kapasite yararlanma takip edilmiştir. Örneğin, hücre büyüme sinyal yolları çeşitli yaralanma modellerinde manipülasyon aksonal rejenerasyon ve gliyal yara izi azaltma10,20,21sonuçlandı. Ayrıca, çalışmalar chondroitinase şeker zincirleri çoğunluğu CSPGs içinde cleaves, ABC ile tedavi CSPGs reaktif astrocytes22tarafından salgılanan inhibitör etkisini azaltır göstermiştir. Rağmen cesaret verici sonuçlar, bu yaklaşımların potansiyel anormal rejenerasyon12' neden olabilir ve aynı zamanda nöronların kaybı için hesap yapmak büyüme koniler rehberliğinde yönetmen sağlamaz. Hücre tabanlı yaklaşımlar girişimleri gliyal yara etkilerini aşmak için ve kayıp hücreleri, özellikle sinir hücreleri doldurmak için kullanılmıştır. Diğerleri yaralanma alanı yeniden doldurmanız ve akson rejenerasyon23,24, teşvik CNS lezyonları nöral progenitör hücre nakli sırasında bazı gruplar reaktif astrocytes nöronlar dediferansiye 25. ancak, kök hücre transplantasyonu tek başına düşük sağkalım oranları, zavallı entegrasyon ve hasarlı doku5mütevazı saklama ile sınırlıdır. Ayrıca, hücre tabanlı strateji de uzun mesafe aksonal yolları, özellikle denetimli bir biçimde geri yüklemek başarısız. Bu nedenle, biyomalzemeler diğer yaklaşımlar ile birlikte teslim araçlar için çeşitli sinir incelenmiştir ve progenitor hücreler ve büyüme faktörleri26. Biomaterial tabanlı yaklaşımlar tasarım denetimi belirli fiziksel, haptotaxic taklit yapıları üretmek için yüksek derecede özelliği ve hedef ana bilgisayar doku27üç boyutlu (3D) microenvironment içinde chemotaxic ipuçları sunmak, 28,29,30,31,32,33,34. Bu çevre sinyalleri çoğaltılması yerli benzeri Morfoloji, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve, sinyal29arasında diğer nörobiyolojik özellikleri sunmak nakledilen hücreler için her şeyden önemlidir. Bu avantajlı özellikleri rağmen geleneksel hücre tohumlari biomaterial iskele ötesinde gelişme aynı anda yönettiği uzun mesafe aksonal rejenerasyon teşvik ve kayıp nöronlar değiştirmek için gereklidir.

Alternatif bir yaklaşım sinir dokusu üzerinde dayanır umut verici bir "yaşam sinir hücreleri ile yerel Nöroanatomi öykünür bir ön şekillendirilmesi cytoarchitecture varlığı nedeniyle diğer hücre tabanlı yaklaşımlar farklıdır yaşam iskele", mühendislik ve/veya hedeflenen değiştirme, yeniden yapılanma ve yeniden nöro çevrim4,35oluşturulmasını kolaylaştırmak için gelişimsel mekanizmaları. Yaşam iskele tasarımı için önemli noktalar fenotipleri ve sinir hücreleri gibi mekanik/fiziksel özellikleri kaynakları ve biyokimyasal sinyalleri herhangi bir eşlik eden Biyomalzeme35kompozisyon tarafından dikte. İmalat vitrosonra bu yaşam iskele implante vivo içinde mevcut hücre adezyon molekülleri ve kemotaktik olabilir ve Nörotrofik sinyalleri aktif sinir hücre göç ve akson akıbet durumuna bağlı olarak düzenleyen ve rejeneratif ilerlemesini35işler. Bu hücreler çeşitli gelişimsel mekanizmaları vivo içindearacılık beri gliyal hücreler yaşam iskele mühendislik cytoarchitecture için bir temel olarak hizmet verebilir. Beyin gelişimi sırasında Bazal süreçleri yaşayan iskele yönlendirilmiş geçiş36,37için olarak gelişmekte olan kortikal plaka doğru ventrikül bölgeden Radyal glia tarafından genişletilmiş yeni nöronlar güveniyor. Ayrıca, kendilerini çekici ve itici sinyalleri gliyal Işaret hücreleri tarafından elde edildi algılama tarafından yönlendirmek için gösterilen ve sözde "aksonlar öncü" koniler büyüme uzanan önerilir boyunca önceden desenli gliyal genişleterek doğru hedeflere ulaşmak için 35,38,39iskele. Böylece, gliyal hücreler daha sonra olarak axon tabanlı hizmet aksonlar öncülük etmek için sağlanan bilgilerde açıklanan gerekli olan "yaşam iskele" projeksiyon "takipçisi" akson ve yönlendirmek için. Ayrıca, büyüme glia aracılıklı mekanizmalar olarak rostral göçmen akışı (RMS) bölgesinden subventricular (SVZ), bir yetişkin beyninin neurogenesis birkaç diğer alanlarında gezinmek için neuroblasts takip postnatally, kalıcı olması için gösterilmiştir olfaktör ampul (OB)40. Bu neuroblasts RMS boyuna hizalanmış astrositik oluşum, doğrudan hücre-hücre yapışıklıklar yolu ile oluşan ve çözünür faktörler37, lokalize gliyal tüp içinde (şekil 1A-1), göç 41. memeliler nedenleri CNS hasar fiziksel olarak aksonal rejenerasyon17engellemektedir gliyal bir yara izi oluşturan astrositik işlem düzenleme kesintiye iken, son olarak, birçok memeli sistemi zararlı gliyal yara oluşumu eksikliği. Daha doğrusu, Sigara memeli türlerinin gliyal hücreler daha organize, yaralı bölge17,42,43kılavuzları olarak kullanılan desenler hizalı korumak. Örneğin, memeli SCI modellerinde, gliyal köprüler yüzeylerde aksonal rejenerasyon ve fonksiyonel iyileşme (kolaylaştırıcı olarak organize gliyal iskele için önemli bir rol düşündüren lezyon, geçiş ile yakın ilişki içinde büyümeye aksonlar gösterilir Şekil 1A -2) 42 , 44 , 45. tekrarlama nöroanatomik özellikleri ve yukarıda açıklanan gelişimsel/rejeneratif mekanizmaları aynı anda olgunlaşmamış nöronal göç sürebilirim mühendislik gliyal tabanlı yaşam iskele yeni bir sınıf verim ve aksonal Bunun aksi halde keyfi ortamlar, böylece potansiyel olarak nöronal etkilerini Azaltıcı aracılığıyla ve akson yolu dejenerasyonu CNS yaralanma ve hastalık ile ilgili.

Bizim araştırma grubu daha önce yaşayan iskele yeniden inşası için birden çok türde Dizayn ve rejenerasyon aksonal yollarini MSS ve mikro-doku ile periferik sinir sistemi (PNS) sinir ağları (mikro-TENNs) ve doku Mühendisliği sinir grefti (TENGs), sırasıyla27,46,47,48mühendislik. Hem stratejileri doğal olarak Biyomimikri üzerinde temel alır. Mikro-TENNs yapısal ve işlevsel olarak beynin farklı nöron popülasyonları bağlanma aksonal yolları değiştirmek için tasarlanmış anatomik olarak ilham yapılardır. TENGs gelişimsel mekanizması "takipçisi" axon büyüme hedeflenen ana bilgisayar aksonal rejenerasyon35,46,48elde etmek için "öncü" akson boyunca örneği axon kolaylaştırdı aksonal rejenerasyon yararlanmak. Biz son zamanlarda yaşayan iskele çok yönlülük büyük harfle tekniği benzer bir encasement şeması mikro-TENNs ve glia tabanlı mekanizmaları ilham arayan mevcut geliştirme. Burada, kolajen Lümen hidrojel mikro-sütun49kapsayan hizalanmış astrositik demetleri oluşan yapıları geliştirdik. Bu astrositik yaşam iskele çapları için karşılık gelen bir içi boş silindirik hidrojel bir dış çap (OD) ve iç çapı (ID) ile oluşturmak için bir kılcal tüp-akupunktur iğne derleme sıvı özel ile doldurarak geliştirilir tüp ve iğne, anılan sıraya göre. Özel jelleşme ve hidrojel mikro-sütun çıkarma kılcal tüp, içi boş iç kısmıdır kaplı türü ile ben astrocyte yapışma için izin veren bir ortam sağlamak için kollajen ve paket oluşumu (şekil 1B uyumlu -1). Daha sonra lumen postnatal fare pups (şekil 1B-2) izole serebral kortikal astrocytes ile seribaşı. Elektrik alanları, micropatterned oluklar ve hücre dışı matriks uygulanması (ECM) protein desenlendirme, itimat iki boyutlu (2D) hizalama teknikleri astrocyte uyum içinde yaşayan iskele aksine tekniği üzerinde kendinden montajlı dayanıyor substrat eğriliği (sütun Kımlığı), hücre yoğunluğu ve kollajen konsantrasyonu50,51,52gibi kontrol değişkenleri göre. Astrocytes sözleşme ve kollajen yeni model ve iki kutuplu, boyuna hizalı Morfoloji vivo içinde (şekil 1B-3) gözlenen doğal iskele benzer elde etmek. Nitekim, biz aktif olarak bu kablo benzeri yapıların kullanımını hedeflenen rehberlik olgunlaşmamış nöronlar geçiş hem de özellikle bozuk MSS olumsuz ortamı üzerinden aksonal rejenerasyon kolaylaştırmak için fiziksel yüzeyler olarak devam ediyor memeli gliyal yara (şekil 1 c). Bu makalede, astrositik mikro-sütunlar için detaylı imalat yöntemi mevcut beklenen cytoarchitecture ve mevcut kısıtlamaları üzerinde kapsamlı bir tartışma kontrast ve ayirt görüntülerini ve gelecekteki yönleri faz tekniği.

figure-introduction-1
Şekil 1: ilham, imalat Protokolü ve hizalanmış astrositik ağlar için Önerilen uygulamalar. (A)nörobiyolojik ilham: (1) Neuroblasts Nörojenik subventricular bölgesinden (SVZ) kaynaklı boyuna hizalanmış gliyal tüp rostral göçmen akışı (RMS) olfaktör ampul (OB); doğru yönlendirilmiş geçiş için kullanmak (2) sonra sinir dokusuna zarar kısmen-bir lezyon (örneğin kopuk spinal kord) ucuna bağlanan ve rehberlik için bir iskele olarak hizmet veren bir gliyal köprü oluşumu nedeniyle kurbağa ve balık gibi sigara-memeliler rejenerasyon ayakta olabilir akson yeniden oluşturuluyor. (B) imalat genel bakış: mikron büyüklüğünde, içi boş hidrojel mikro-sütun ECM ile kaplı Lümen ile inşaat (1) (2) postnatal fare pups (3) kendinden montajlı, boyuna yönelik izole birincil kortikal astrocytes, tohum Kültür ve paket (4) çekme--dan biomaterial mantolama gelecekteki implantasyon Etütler demetleri. (C) In vivo uygulamaları: (1) bu yaşam iskele mühendislik gliyal tüpler için yönlendirilmiş nöron göç--dan nöron eksikliği bölgeleri; yeniden oluşturulacaktır için Nörojenik merkezleri olarak hizmet verebilir (2) tekrarlama axon rehberlik öncülük etmek gelişimsel mekanizması ve sigara-memelilerde gliyal köprüler rejeneratif mekanizması ile axon rejenerasyon sigara-keyfi arasında yönlendirmek için kapasite astrositik bu iskele bağışlamak memeli gliyal yara ortamı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yordamlar kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler Pennsylvania Üniversitesi ve Michael J. Crescenz Gaziler işleri Tıp Merkezi tarafından onaylanmış ve NIH halk sağlığı hizmetleri ilkesine insana ilişkin olarak belirlenmiş kurallara uyulması Care and Use of Laboratory Animals (2015).

1. geliştirme özel hidrojel mikro-sütun

  1. Özel 3 g ağırlığında ve Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 100 mL içeren steril bir ölçek aktarma tarafından bir özel %3 ağırlık/hacim (w/v) çözüm olun. Steril bir manyetik çubuk ölçek kabı için eklemek ve bir sıcak plaka/karıştırıcı bir yüzeye yerleştirin. Kabı içeriği sonraki adımda buharlaşma önlemek için kapalı tutun.
  2. Özel ve DPBS 100 ° C ısıda ısı ve 60-120 rpm'de karıştırın. Bu ayarları gerektiği gibi ve çözüm başlangıçta opak özel tamamen çözülmüş ettiğinizi net bir görünüm için değişiklikleri gibi sürekli fesih işleminin ilerlemesini izlemek.
    Dikkat: Sıcak kabı ve çözüm sıcaktır!
  3. Özel çözüm ısıtmalı ve karıştırılır, dört boş 10 cm Petri yemekler almak ve DPBS 20 mL iki tane ekleyin. Akupunktur iğneleri yerleştirin (çapı: 300 µm, uzunluk: 40 mm), cam microliter kılcal tüpler (çap: 701.04 µm, uzunluk: 65 mm, kapasite: 25,0 µL) ve bir ampul pınarı Biyogüvenlik kabini içinde. Sıvı özel çözüm dağıldığında, sürekli yaklaşık 50 ° C'de Isıtma ve özel jelleşme önlemek için karıştırma korumak.
  4. Bir akupunktur iğnesi bir ampul pınarı alt açıklıklı içine tanıtmak. Dışarıya maruz iğne üzerinde bir kılcal tüp takın. Kılcal Boru parçası ampul dağıtıcı silindir kauçuk bölümüne girerek güvenli.
  5. 1 mL sıvı özel bir micropipette ile boş bir Petri kabına yüzeye aktarma ve ampul dağıtıcı lastik kapağı içe boğumlu iken kılcal tüp bir ucunu (eklenen dikey olarak iğne ile) özel ile temas yerleştirin. Yavaş yavaş özel kılcal tüpe çizmek için ampul dağıtıcı kap üzerinde baskı serbest bırakın.
    Not: Sıvı özel transfer kılcal tüpler içine hızla gerçekleştirilmesi gerekir. Sıvı özel bırakılırsa Petri kabına yüzeyinde yeterli zaman soğutmak için (yaklaşık 60 s), jel uygun emme, kılcal boru boyunca özel önleme başlar.
  6. Her ampul-tüp-iğne derleme bir ücretsiz Petri kabına ve izin özel jel kılcal tüpler içinde yer kuvvetlendirmek için ampul dağıtıcı silindir kılcal tüp senin elinde kauçuk tıpa ile 5 dk. dikkatlice çekin iğne bırakarak ve Özel jel tüp içinde bir yerde.
  7. El ile akupunktur iğneyi yavaşça kılcal tüp dışarı çekerek özü; Yeni katılaşmış özel silindir da tüp hala iğne çevreleyen bu yordamdaki dışarı slaytlar. Yavaşça mikro-sütun boyunca akupunktur iğne ucunu sonuna kadar taşımak için steril Forseps ile sürükler. İğne üzerinde açık, DPBS içeren bir Petri kabına yerleştirin ve mikro-sütun Forseps ile DPBS itin.
    Not: özel mikro-sütun akupunktur iğnesi kaldırılması üzerine cam kılcal tüp içinde kalırsa, yavaş yavaş özel mikro-sütun kılcal tüp dışında 25 mm Ölçüm iğneyle ve DPBS ile çanak içine itin.
  8. Microscalpels veya sıcak boncuk Sterilizatör kullanarak forseps sterilize. Özel 4 g ağırlığında ve DPBS için 100 mL transfer % 4 w/v özel olun. Isı ve net bir % 4 sıvı özel çözüm elde etmek için 1.2. adımda açıklandığı gibi ilave edin. Isıtma ve çözüm aşağıdaki adımları boyunca karıştırma korumak.
  9. Mikro-bir diseksiyon başlık sütunları içeren Petri yemekler aktarmak ve mikro-sütun boş bir Petri kabına ince Forseps ile taşıma. Görsel rehberlik için stereoscope ve mikro-sütunlar için istenilen uzunluğa kesmek için bir microscalpel kullanmaktadır. Her iki ucu ECM ve hücre toplama sırasında mikro-sütunları işleme kolaylaştırmak için yatay gelen formu eğimli uçlarına 45o açılarda kırpın.
  10. Önceki adım üç için daha fazla mikro-sütunlarda aynı Petri kabına ve dört yapıları bir ayrılması ile paralel olarak hizalamak tekrar < 3 mm her bir silindir. 50 µL % 4 özel çözüm bir micropipette ile yük ve bağlanmak ve yapıları dörtlü gruplar halinde paket için mikro-sütun dizi çizgi/satır sıvı dökün (bundan sonra "mikro-sütun tekneler" olarak adlandırılır). % 4 özel mikro-sütunlar, iç yapıları arasındaki mesafe en aza indirilmesi ve özel hızlı bir şekilde ince bir çizgi ekleyerek yapışmasına neden kenarına hareketi önlemek.
    Not: "botlara" dört mikro-sütun grupları düzenleme astrositik iskele imal etmek gerekli değildir. Yine de, teknelere hizmet üretim sürecini hızlandırmak ve hareket ve mikro-sonraki adımlarında sütunlarda işlemek için daha güvenli bir yol sunar.
  11. Jelleşme ekledi % 4 özel izin vermek 1-2 min için mikro-sütun tekne soğumaya bırakın. Mikro-sütun tekneyi iyi Forseps ile bağlantı % 4 özel tarafından almak ve diğer DPBS içeren Petri 1.1.3 adımda hazırlanan yemek için mikro-sütunları taşımak. İstediğiniz gibi kalan mikro sütunlarla daha fazla tekne imal.
  12. Mikro-sütunları ve/veya bir biyogüvenlik kabin tekneler içeren Petri yemekler taşımak ve maruz kalma 30 dk için ultraviyole (UV) ışık ile sterilize.
    Dikkat: UV etkilenmemek için uygun koruma giymek.
  13. ECM toplama ve hücre kaplama hemen gerçekleşmeyecek 4 ° C'de DPBS içinde mikro-sütun tekneler bulaşıkta saklamak daha sonra 1 hafta kadar. Yapıları bu süre kullanılmazsa mikro-sütun üretim adımları yineleyin.

2. birincil hücre kültürü ve yalıtım

  1. Fare pups kortikal astrocyte izolasyonu
    1. Aşağıdaki adımlar için hazırlık olarak, Hank'in 20 mL dengeli tuz solüsyonu (HBSS) disseke dokular için rezervuar görevi görecek dört 10 cm Petri yemekler için ekleyin. Tüm yemekler buz üzerinde tutun. Temiz Cerrahi makas, pens, mikro-spatula ve mikro-neşter sıcak boncuk Sterilizatör içinde sterilize.
    2. % 0.25 tripsin 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ve 0.15 mg/mL deoksiribonükleaz (Dnaz) ile prewarm ı 37 ° C'de HBSS Buna ek olarak, astrocyte kültür orta 37 ° c, hangi oluşmak-in Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) Ham'ın F-12 besin karışımı ve % 10 fetal sığır serum (FBS) ile prewarm.
    3. Doğum sonrası gün 0 veya 1 gün Sprague-Dawley rat pups hipotermik koşullarına açarak anestezi ve işten çıkarma tarafından ötenazi. PIN 19 mm kullanarak bir sahne içimizi iğne gözleri anterior burun yerleştirilen ölçer.
    4. Bir kesik bir neşter ile orta yere için ön, arka kadar boyun hemen arkasında gözleri tabanından olun. Başka bir kesi yanal üzerinden T şekli oluşturan doğrudan gözlerinin aşağıya doğru gidiş yerine getirir. İyi forseps tarafına kafatası cilt/kafatası yapmak için kullanın.
    5. Hayvan ve diğer dış yüzeyi ağız burun (forseps, bir sivri uç yerleştirerek yukarı bakacak şekilde) tarafından kafa tutun. Steril bir mikro spatula ile beyin çıkarın ve bir Petri yemekler ile soğutulmuş HBSS dolu yerleştirin. Yer bu Petri kabına buz üzerinde hemen sonra ve hiç kullanmadığınız dışında kez.
    6. Daha önce bir stereoscope içinde bir diseksiyon başlık altında-20 ° C'de depolanan bir granit blok yerleştirmek. Düşük sıcaklık diseksiyon işlem sırasında korumak için granit blok yüzeyinde beyin dokusu ile Petri kabına yerleştirin. Stereoscope aşağıdaki adımları boyunca görsel kılavuz olarak kullanın.
    7. Olfaktör ampuller sağlam kalırsa, onları forseps veya microscalpels ile kesim tarafından ayıklayın. Buna ek olarak, bir microscalpel iki serebral hemisferlerin ayıran bir ensizyon yapmak ve beyincik kaldırmak için kullanın. Hemisferlerin Forseps ile taze, soğutulmuş HBSS içeren bir Petri kabına aktarın.
    8. Yalnızca ayrılmış cortices elde etmek için bir microscalpel ile hemisferlerin içinden orta yapıları incelemek. İyi forseps kortikal dokudan meninkslerde, bir sayfa benzeri yapıda soyulmak ve soğuk HBSS ile yeni bir petri izole cortices aktarmak için kullanın. Bir sonraki adımda tripsin eylem için yüzey alanını artırmak için doku kıyma için microscalpel kullanın.
    9. Pasteur pipet prewarmed tripsin-EDTA (her tüpün içinde 8 cortices) 4 mL içeren 15 mL santrifüj tüpü cortices aktarmak için kullanın. Kortikal dokusu tripsin-EDTA 37 ° C'de 5-7 dk ile maruz
    10. Pasteur pipet ile dikkatli bir şekilde tripsin-EDTA kaldırın ve 400 µl 0.15 mg/ml Dnaz ekleyin ben çözüm santrifüj tüpü için. Tüp veya girdap tüm doku ayrışmış ve sıvı içinde kalan hiçbir doku parçaları kadar tahrik. Doku tamamen erimesi mümkün değildir, Pasteur pipet ucu ile kalan parçaları kaldırın.
    11. Santrifüj Disosiye hücre çözümü 200 x g 3 dakika süreyle de içeren tüp süpernatant Pasteur pipet ile kaldırmak hücreleri bozmadan. Astrocyte kültür (2.1.2. adımda tanımlanan) orta 1 mL tüp ile bir micropipette ekleyin ve resuspend ve homojen bir çözüm oluşturmak için tahrik.
    12. Astrocyte kültür orta serolojik pipet ile 10 mL T-75 şişesi aktarın. 1 mL hücre çözümü (2.1.11 adımda hazırlanan) bir micropipette ile 250 µl şişesi şişe başına hücre değer bir yavru beyin plaka ekleyin. Ordudan terhis edilen hücre çözümü kültür orta arasında eşit olarak dağıtabilmenizi ve yavaşça şişeye daha fazla bile bir dağıtım desteklemek için tahrik.
    13. Oksijen kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2kaplama şişeler kültür. 24 ve 72 kültür s ulaştıktan sonra mekanik şişeye yapışık olmayan hücre tipleri, sinir hücreleri ve oligodendrocytes gibi ayırmak için tahrik.
    14. Daha sonra her bu timepoints de, bir medya değişiklik yapmak. Kültür medya yapıştırılır hücreleri kapsayan şişeye dibinde yatıyor şişeye dikey olarak tut. Pipet karşı hücreleri ayıklama önlemek için balonun alt köşesinde bastırıp bir Pasteur pipet ile Kültür orta Aspire edin. Şişeye özgün yatay pozisyonda yerleştirin ve hafifçe serolojik pipet içeren hücreleri üzerinde astrocyte orta 10 mL ekleyin.
    15. Şişeler için kuluçka makinesi her medya değişiklikten sonra dönün. % 90 confluency elde sonra mekanik olarak bir kez daha kalan herhangi bir uygun olmayan hücreleri kaldırmak için balonun kışkırtmak.
    16. Astrocytes bir vakum ve Pasteur pipet ile Kültür orta yaptırmayı geçiş. 5 mL % 0.25 tripsin-EDTA serolojik pipet ile yapıştırılan hücrenin üzerine ekleyin. Yavaşça şişeye tripsin tüm hücreleri kapsar emin olmak için kışkırtmak ve 5-7 dk 37 ° C ve %5 CO2şişeye kuluçkaya.
    17. Tripsin serolojik pipet ile hücrelere astrocyte orta 1 mL ekleyerek gidermek. Şişeye serolojik pipet ile hücre çözümü ayıklamak ve steril 15 mL santrifüj tüpü aktar. Santrifüj tüpü 200 x g 3 dk de kapasitesi.
    18. Süpernatant serolojik pipet ile kaldırın ve 1 mL astrocyte kültür orta resuspend. Hücre çözümü homojen olduğundan emin olmak için tüp kışkırtmak. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayacı ile çözümde hücreleri saydırmak.
      Not: % 90 birleşmesi genellikle olan bir şişesi yaklaşık 3 milyon astrocytes verir.
    19. Astrocyte kültür orta 10 mL T-75 şişesi için ekleyin. 1:4 seyreltme zaten kültür ortamı içeren T-75 şişeye bir micropipette ile hücre çözümü (Adım 2.1.18) 250 µl aktararak gerçekleştirin. Şişeye bir homojen hücre dağılımı yüzey boyunca emin olmak için yavaşça kışkırtmak.
    20. Adımları %2.1.16-2.1.19 90 confluency hücreleri geçiş için elde her zaman tekrar.
  2. Sıçan fetusa kortikal nöron izolasyon
    1. Adım 2.1.1 ve 2.1.2, ortak kültür medya, oluşan Neurobasal orta + (nöron için) % 2 B-27 eki + %1 G-5 serum ücretsiz ek (astrocytes) + %0.25 prewarmed ortamdır özel durum olarak benzer ürünleri takip L-glutamin.
    2. Zaman aşımına uğradı-hamile embriyonik gün 18 Sprague-Dawley Rat ile karbon dioksit boğulma ötenazi ve ölüm tarafından işten çıkarma onaylayın.
    3. Sıçan fetusa ayıklamak ve Petri yemekler görsel rehberlik ve steril makas, microscalpel ve forseps53 için bir stereoscope kullanarak soğutulmuş granit blok yüzeyinde HBSS içeren beyin dokusunda kalanından cortices incelemek . Sonra art arda diseksiyon başkanları, beyin, serebral hemisferlerin ve cortices her doku için yeni HBSS dolu bir Petri kabına aktarın.
    4. Tripsin için yüzey alanını artırmak için daha küçük parçalara kortikal doku kıyma. 4-6 cortices bir Pasteur ile bir tüp ile 5 mL prewarmed tripsin-EDTA de pipet ve 37 ° C doku ayırmak için korumak transfer. 5-7 dk az el ile karıştırın ve doku topaklanma önlemek için tüp kışkırtmak.
    5. Tüp 37 ° C 10 dakika sonra kaldırın. Adım 2.1 daha önce açıklandığı gibi tripsin-EDTA ayıklamak ve 0.15 mg/mL Dnaz çözüm 1,8 mL ile yerine. Daha sonra girdap çözüm kadar doku doku parçaları sıvı içinde yüzen yok ile homojen, görünür.
    6. Disosiye doku çözüm vasıl 200 x g 3 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırdıktan sonra ortak kültür orta 2 mL resuspend. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayacı ile Bu çözümde hücreleri saydırmak.
      Not: 3.0-5.0 x 106 hücreler/kortikal Yarımküre her zamanki verimidir.
    7. Yeni bir hücre çözümü 2.0-4.0 x 105 hücre/mL yukarıda tanımlanan ortak kültür medya yoğunluğu ile hazırlayın.

3. mikro-sütunların içine astrositik kabloları gelişimi

  1. ECM çekirdek imalat
    Not: ECM hidrojel mikro-sütunları iç için aynı gün içinde hücre tohum gerçekleştirilecek eklenmesi gerekir.
    1. İçinde bir biyogüvenlik kabini, 1 mg/mL hazırlamak çözüm sıçan kuyruk tip ı kollajen bir steril microcentrifuge tüp ortak kültür ortamında. Microcentrifuge tüp buz ECM çözümü ile kullanımda ne zaman dışında her zaman korumak.
    2. 1-2 µL turnusol kağıdı onun pH tahmin etmek için bir şerit üzerine bir micropipette ile ECM çözümünün aktarın. 1 N sodyum hidroksit (NaOH) veya hidroklorik asit (HCl) sırasıyla ECM çözüm pH azaltmak veya artırmak için bir micropipette ile 1 µL ekleyin ve homojenize için yukarı ve aşağı pipet. Bir turnusol kağıdı şeridi ile yeni pH doğrulayın ve daha fazla asit veya baz, pH 7.2 7.4 aralığında stabil kadar gerektiği gibi ekleyin.
    3. Petri yemekler 1.2 adımından diseksiyon kukuIeta hareket ve 4-5 mikro-sütunları veya bir tekne bir boş, steril 35-60 mm Petri kabına için steril iyi Forseps ile aktarın. Stereoscope rehberlik için kullanarak, her mikro-sütun ve emme DPBS ve hava kabarcıkları Lümen boş bir ucundaki micropipette 10 µL ucu yerleştirmek. Sonraki adımda eklediğiniz ECM serbestçe Lümen karşıdan karşıya akış sağlamak için stereoscope ile hava kabarcıkları yokluğu onaylayın.
    4. P10 micropipette ECM çözümü, 10 µL hidrojel mikro-sütunları bir ucunu karşı uç ve ECM giriş stereoscope ile gözlemleyerek Lümen (yaklaşık 3-5 µL), doldurmak için yeterli bir çözüm sunmak yer ile şarj edin. Küçük bir rezervuar (2-4 µL) mikro-sütun, her iki ucunda ECM çözümünün pipette.
      Not: Her zaman 4-5 mikro-sütunları yönetmek veya bu mikro-sütun yapısını görevlisinideponun neden olabileceğinden yapıları, kurutma önlemek için bir seferde bir tekne uzun süreli. Tamamen kurutulmuş mikro-sütunları sıkıca hücre tohum için onların kullanımı engelleyen Petri yemekler yüzeyine takın. Bu aşağıda açıklanan kuluçka dönemi sırasında dışarı akmasını ECM neden olabilir çünkü ortak kültür ortamı (olarak hidrasyon ölçümü) aşırı miktarda mikro-sütunlar eklenemez.
    5. Ortak kültür medya bir halka etrafında sütunları kuluçka sırasında kurumasını önlemek için bir nem lavabo sunmak Petri kabına pipet. ECM içeren mikro-37 ° C ve % 5 CO2 polimerizasyon kollajen nöronlar ve/veya astrocytes eklemeden önce tanıtmak 1 h için içeren sütunları Petri kabına kuluçkaya.
      Not: ECM içi boş Lümen iç yüzey kaplama bir tabaka oluşturması gerektiğini yerine sağlam bir ECM çekirdek iç kapsayan, ikisi de stereoscope kullanarak görülebilir. ECM bir çekirdek oluşturur, sadece layer terk edene kadar kuluçka dönemi devam. Oluşan bu katman ile astrocyte hücre çözümü iç kaplama adımları mikro sütununda doldurabilirsiniz.
    6. Kuluçka döneminde astrocyte hücre çözümü (aşağıda açıklandığı gibi) hazırlayın.
  2. Astrocyte ve mikro sütunlarda nöron tohumlama
    1. (Arasında dördüncü ve on ikinci geçit) kaplama astrocytes adımları 2.1.16-2.1.19 içinde açıklandığı gibi geçiş. Şişeye hücre sayısı sayım sonra hücre çözümü 9.0-12,0 x 105 hücre/mL solüsyon hücre kültürü medyada askıya yoğunluğu, hazır olun.
    2. Bir stereoscope kullanarak, mikro-sütunları bir ucunda bir P10 micropipette ucu yerleştirin ve yeterli hücre çözümü (~ 5 µL) tamamen doldurmak için Lümen aktarın. Aynı derecede yukarıda ECM ile bitmiş, hücre çözümü küçük rezervuarlar mikro sütunların her iki ucuna ekleyin.
    3. Petri yemekler 37 ° C ve % 5 CO2 astrocytes eki ECM tanıtmak 1 h için kaplama mikro sütunlarda kuluçkaya. Nöronlar mikro-sütunlar için ekli değil, 3.2.5 adıma devam edin.
    4. İlk kuluçka süresi 1-2 µL kesilmediğini gözleyerek stereoscope altında her iki ucunda da bir micropipette, mikro sütunlarla içine adım 2.2.7 elde kortikal nöron çözüm ekleyin. Bu yeterli miktarda ortam bulaşıkları kurutma önlemek ve tekrar nöronlar yapışma için izin vermek için 37 ° C ve % 5 CO2 40 min için kuluçkaya mevcut olduğundan emin olun.
      Not: Kortikal nöron çözüm de 1-2 gün sonra paket oluşumu, adımı 3.2.4 dikkatle kültür medya üzerinden bir micropipette ile Petri kabına çıkardıktan sonra gerçekleştirmek eklenebilir.
    5. Sonra kuluçka dönemi, dikkatlice 3 veya 6 mL 35-60 mm Petri yemekler için ortak kültür ortamının kaplama mikro sütunlarla sırasıyla içeren Petri yemekler doldurun. Kültür tanıtmak için 37 ° C ve % 5 CO2 kaplama mikro sütunlarda korumak demetleri 6-10 h sonra birlikte, kablo gibi bir yapı oluşturan kendinden montajlı hizalanmış astrositik,.
  3. Astrocyte kablo mimarisinin sabitleme
    Not: sonra oluşumu demetleri, yaklaşık 6-12 h yapıları, kültür, astrositik iskele hizalanmış yapısını çöküşü önlemek için aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. 3 mg/mL sıçan kuyruk kollajen bir steril microcentrifuge tüp hazırlamak ben çözüm ortak kültür medya. 7.2-7,4 takip adım 3.1.2 özetlenen yordamı için çözüm pH ayarlayın. Buz kullanılmadığı zaman kolajen stok ve ortak kültür medyada Bakımı ve hazırlanan kollajen çözüm her zaman buz üzerinde yerleştirin.
    2. Medya bazı medya mikro sütunların nemlendirme sağlar nem lavabo oluşturmak için çanak iki tarafında bırakarak bir micropipette ile astrositik iskele içeren Petri yemekler kaldırın. Görsel öğeyi yardım etmek için bir stereoscope altında tabak yerleştirin.
    3. Bir micropipette ile mikro-stereoscope için görsel kılavuzu kullanarak sütunları, her iki ucuna 2-3 µL kollajen çözüm ve deşarj almak. Çanak etrafındaki çanak kenarlarında bir nem lavabo olarak hareket için yeterli miktarda ortam olduğundan emin olun. Petri yemekler 30 dk 37 ° C ve % 5 CO2 yeni eklenen kollajen jelleşme tanıtmak için oksijen bir kuluçka için mikro sütunlarla kuluçkaya.
    4. Yavaş yavaş ortak kültür medya 3 veya 6 mL ekleyin (35 ya da 60 mm Petri, sırasıyla yemekleri) için Petri yemekleri bir pipet ile ve bulaşıkları 37 oC ve %5 CO2oksijen bir kuluçka kültür.

4. çıkarma astrositik demetleri hidrojel iç

  1. Cam coverslips bir otoklav içinde sterilize. Poli-L-lizin (PLL) 20 µg/mL çözeltisi steril hücre kültür sınıf suda hazırlayın.
  2. Bir biyogüvenlik kabini içinde el ile steril cam coverslips bir steril 10 cm Petri kabına aktarın ve coverslips karşılamak için yeterli PLL çözüm ekleyin.
  3. PLL üçün 37 ° C'de yüzey kat için 30 dk ile kaplı coverslips, kuluçkaya. PLL çözüm Pasteur pipet ile 30 dk. sonra durulama üç kez coverslip için hücre kültür sınıf su ekleyip Pasteur pipet ile kaldırarak çıkarın.
  4. Hizalanmış gliyal paket oluşturulması sonra mikro-sütun ince steril Petri kabına için steril iyi Forseps ile transfer. ve su kaybı önlemek ve paket Sağlık sağlamak için bir micropipette ile ortak kültür ortamının 10 µL küçük bir havuz ekleyin. Astrositik paket hidrojel mikro sütundan bir stereoscope için görsel kılavuzu kullanarak steril cerrahi Forseps ile hafifçe bir ucundan çekerek çıkarın.
  5. Astrositik paket Forseps ile tutarak, bir PLL kaplı coverslip monte edin. Tamir edip protokolü ile leke.

5. Vitro çalışmalar için Immunocytochemistry

Not: Bu çalışma için birincil antikorlar tavşan anti-gliyal asidik fibrillary protein (GFAP'nin) (1:500), edildi anti-β-tübülin III (1:500) fare, tavşan Anti-kollajen ben (1:500), anti-testin fare (1: 200) ve tavşan anti-vimentin (1: 100). İkincil antikorlar Anti-fare 568 eşek, eşek Anti-tavşan 568, eşek Anti-tavşan 488 ve eşek Anti-fare 568 (tüm 1:500) idi. Tüm durumlarda, tamamen mikro-sütunları kapsayacak şekilde her çözüm yeterli hacmi ekleyin.

  1. 1 x DPBS bir kimyasal duman başlık içinde bir % 4 birim/birim (v/v) formaldehit çözümde hazırlayın.
    Dikkat: formaldehit toksik bir bileşik kanserojen olduğu bilinen ve ayrı bir kapta bertaraf gerekir. Her zaman bu bileşik bir kimyasal duman başlık içinde işlemek ve kişisel koruyucu ekipman (PPE) laboratuvar mont, koruyucu gözlük ve eldiven gibi kullanmaktadır.
  2. Mikro sütunların söz konusu olduğunda, yanlışlıkla hidrojel silindir suctioning olmadan bir Pasteur pipet ile yapıları içeren Petri yemekler kültür ortamından atmak. Mikro-sütunları veya bağlı coverslips (ikisi de Petri yemekler üzerinde kalır) karşılamak için yeterli formaldehit çözüm ekleyin ve 18-24 ° C'de 35 dk için kuluçkaya
  3. Sabit mikro-sütunları veya serolojik pipet ile coverslips %4.0 formaldehit çözüm ayıklamak. Sabit mikro-sütunlarla üç kez PBS hızlı bir şekilde ekleme ve iki kez PBS kaldırma ve sonra onları 10 dk üçüncü bir süre için emmek izin durulayın.
  4. Normal at serum (NHS) bir konsantrasyon % 4 v / v. hazırla % 0,3 v/v NHS çözüm solvent kullanarak bir konsantrasyon, non-iyonik deterjan ile a eriyik için PBS içinde çözülür.
  5. PBS mikro-sütunları veya bir pipet ile coverslips içeren Petri yemekler kaldırın. Mikro-sütun/coverslips hücreleri permeabilize 18-24 ° C'de 60 dk için karşılamak için yeterli % 0,3 deterjan çözüm ekleyin.
  6. Deterjan solüsyonu ve durulama hızlı bir şekilde iki kez PBS ile üç kez 5 dk. hesapla % 4 NHS gerekli hacmi ve her birincil antikorların iliklerine kadar bir çözüm istenen antikor konsantrasyonları ile hazırlamak için almak ve.
  7. PBS gelen Petri yemekler kaldırın ve birincil yeterli antikor ekleyin (%4 oranında sulandırılmış NHS-DPBS) mikro-sütunları veya ayıklanan astrositik demetleri kapsayacak şekilde çözüm. Kuluçkaya geceleme (12-16 h) 4 ° C'de
  8. Birincil antikor çözüm almak ve hızlı bir şekilde iki kez PBS ile ve üç kez her 5 min için iliklerine tarafından durulayın. Karanlıkta, her antikor %4.0 NHS çözümde mevcut 1:500 bir seyreltme ikincil antikor çözüm hazırlamak.
  9. 18-24 ° C'de 2 h için ikincil antikor çözüm hücrelerle kuluçkaya Kuluçka tüm süre boyunca, Petri yemekler ışığa maruz kalma önlemek için alüminyum folyo ile mikro sütunları içeren kapak.
  10. İkincil antikor çözüm kaldırın ve çekirdekleri leke için 18-24 ° C'de 10 dakika Höchst çözümü (1:10, 000) ekleyin.
    Dikkat: Bir kanserojen değerlendirilmelidir bilinen bir alkil Höchst var. Bu nedenle, bu ayrı bir kapta bertaraf gerekir ve KKE kullanılması gerekir her zaman bu Ajan işlenirken.
  11. PBS ile beş kez, daha sonra her zaman 5-10 dakika süreyle yıkayın, PBS ve alüminyum folyo ile kapatın lekeli mikro-sütun 4 ° C'de depolayın. Takılı astrositik demetleri, söz konusu olduğunda sulu montaj orta bir damla için bir paket eklemek, başka bir cam coverslip sabit paket yerleştirin ve her iki coverslips uzun süreli saklanması ve sonraki görüntüleme için tırnak cilası ile mühür.

6. canlılığı tahlil Live-ölü (Calcein-AM/etidyum Homodimer) Staining

  1. Reaktif çözüm 5 μl calcein AM (susuz Dimetil sülfoksit (DMSO) 4 mM) ve 20 μl etidyum homodimer-1 (EthD-1) (2 mM DMSO/H2O 1:4 v/v) 1 x DPBS 10 mL için ekleyerek hazırlayın. Alüminyum folyo ile çözüm kapak veya gelen ışık korumak için karanlıkta saklamak.
  2. Pasteur pipet kaplama mikro sütunlarla içeren Petri kabına medyadan Aspire edin ve yeterli bir çözüm (yapıları kapsayacak şekilde yukarıda hazırlanan) ekleyin. Petri kabına çözüm gelen ışık korumak için kapalı tutmak 37 ° C ve % 5 CO2, 30 dk için kuluçkaya.
  3. Bir micropipette veya Pasteur pipet ile çözüm kaldırın. 2 - 3 kez DPBS ile adım 5.3 açıklandığı gibi yıkayın. Petri yemekler DPBS ile çanak büyüklüğüne göre sel. Görüntü hücre hemen sonra epifluorescence ya da confocal görüntüleme kullanıyor.
    Not: Membran geçirgen calcein AM calcein için metabolik olarak aktif hücreleri tarafından dönüşüm calcein yeşil Floresans verir. Ölü hücreleri hücre ve nükleik asitler, kırmızı Floresans neden onun bağlama içine EthD-1 giriş izni membran şaibeli hücreler olarak işaretlenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başlangıçta, faz kontrast mikroskobu cytoarchitecture genel kararlılığını zamanın bir fonksiyonu olarak ve astrocyte adezyon ve paket oluşumu ilerlemesini izlemek için kullanılan. Kaplama sonra 1 h astrocytes küresel Morfoloji (şekil 2A) mikro sütunlarla Lümen çapında bulundu. 5 h, süreçleri uzanan astrocytes başladı ve 8 h iken tarafından taahhüt hücreleri tam bir işlem taşıyan Morfoloji sergilendi ve mikro-sütun (şekil 2A) boyu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PNS daha destekleyici bir ortam için karşılaştırıldığında, MSS özellikle zararlı sonuçları neurotrauma ve ateş işleme sınırlıdır. Memeli CNS ciddi bir hakaret sonra gliyal bir yara izi oluşan bir çekirdek axon akıbet inhibe Proteoglikanlar14salgılar dağınık reaktif astrocytes yoğun bir meshwork tarafından çevrili fibrotik ve inflamatuar hücre oluşan. Bu yara izi akson uçları12rejenerasyon karşı fiziksel ve biyokimyasal tıkanıklığı gibi davranır. Ayrıca, Yetişkin memeli CNS ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mali destek sağlanan ulusal sağlık Enstitüleri [U01-NS094340 (Cullen) ve F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Vakfı [tedavi boru hattı Program #9998 (Cullen)], Penn tıp Neuroscience Center Pilot Ödülü (Cullen), tarafından Ulusal Bilim Vakfı [yüksek lisans araştırma bursu DGE-1321851 (Struzyna)], Department of Veterans Affairs [RR & D hak gözden #B1097-ben (Cullen)] ve ABD Ordusu tıbbi araştırma ve gereç komut [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Akupunktur iğnesi (300 & mikro; m çap)Lhasa MedicalHS.30x40Çap, mikro sütun lümeni için istenen boyuta göre değiştirilebilir.
Petri kabıFisher08772B
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)Invitrogen14200075
Polistiren tek kullanımlık serolojik pipetFisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
Mikrolitre cam kılcal tüp (701 ve mikro; m)Fisher21-170JÇap, mikro kolon kabuğu için istenen boyuta göre değiştirilebilir.
Microcap ampul dağıtıcıFisher21-170JAmpul, mikrokapak tüpleriyle birlikte gelir.
Sıcak plakaFisherSP88857200
Manyetik çubukFisher1451352
MikropipetSigmaZ683884-1EA
25 mm ölçer iğneFisher14-826-49
Mikro NeşterRoboz CerrahiRS-6270
MakasGüzel Bilim Araçları14081-09
ForsepsDünyası Hassas Aletler501985
Sıcak boncuk sterilizatörüSigmaZ378550-1EA
StereoskopNikonSMZ800N
Mikro spatulaFisherS50821
Sıçan kuyruğu tip I kollajenCorning3542364 >m'de koruyun; C ve yalnızca gerektiğinde çıkarın. Kullanım sırasında sıcaklığını korumak için buz kullanın.
Mikrosantrifüj tüpüFisher02-681-256
Sodyum hidroksit (NaOH)FisherSS2661
Hidroklorik asit (HCl)FisherSA48-1
Turnusol kağıdıFisher09-876-18
Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)Canlandırıcı141701124 >m;C'de saklayın.
% 0.25 Tripsin-EDTAInvitrogen25200056-20 >m'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
Sığır pankreatik deoksiribonükleaz (Dnase) ISigma10104159001-20 º'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
Dulbecco'nun Ham'ın F-12 Besin Karışımı ile Modifiye Eagle Medium (DMEM)Gibco11330-0324 ºC'de saklayın.
Fetal sığır serumu (FBS)Atlanta BiologicalsS11195-20ºC'de saklayın.
Doğum sonrası gün 0 veya gün 1 Sprague Dawley sıçan yavrularıCharles RiverStrain 001
Nörobazal embriyonik nöron bazal ortamInvitrogen211030494º'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
B-27 serum içermeyen takviyeInvitrogen12587010-20 >m'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
L-glutaminInvitrogen35050061-20 >m'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
G5 astrositik takviyeInvitrogen17503012
Sprague Dawley embriyonik gün 18 sıçanCharles RiverStrain 001
Pasteur pipetFisher22-042816
15 mL santrifüj tüpüEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
SantrifüjFisher05-413-115
HemositometreFisher02-671-6
Kuluçkamakinesi Fisher13 998 076
Formaldehit %40FisherF77P-4Formaldehit, kanserojen olduğu bilinen toksik bir bileşiktir ve ayrı bir kapta atılmalıdır.
Cam kapak kaymaFisher12-548-5M
OjeElektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)72180
Fluoromont montaj ortamıSouthern Biotech0100-01
Poli-L-lizinSigmaP4707
Fosfat tamponlu salinFisherBP3994
Triton X-100SigmaT8787
Normal at serumuGibco16050-122
Tavşan anti-glial asidik fibriler protein (GFAP) birincil antikoruMilliporeAB5804-20ºC'de saklayın.
Fare anti-beta-tubulin III birincil antikoruSigmaT8578-20 ° C'de saklayın.
Tavşan anti-kollajen I birincil antikoruAbcamab34710-20 ° C'de saklayın.
Tavşan anti-vimentinMilliporeAB3400-20 ° C'de saklayın.
Fare anti-nestinMilliporeAB5326-20ºC'de saklayın.
Eşek anti-fare 568 ikincil antikorInvitrogenA100374 & ordm; C'de saklayın.
Eşek anti-tavşan 568 ikincil antikorInvitrogenA100424ºC'de saklayın.
Eşek anti-tavşan 488 ikincil antikorInvitrogenA212064ºC'de saklayın.
Hoechst 33342, TrihidroklorürInvitrogenH35704ºC'de saklayın. Hoechst, kanserojen olarak tedavi edilmesi gereken bilinen bir mutajendir. Bu nedenle ayrı bir kapta atılmalıdır.
CalceinSigmaC1359Susuz DMSO
Etidyum homodimer-1Yaşam TeknolojileriE1169DMSO/H2O içinde 2 mM 1:4 (h/h)
Dimetil sülfoksan (DMSO)Sigma276855
A1RSI Lazer Taramalı Konfokal MikroskopNikonİmmün etiketli yapıların konfokal rekonstrüksiyonlarını almak için kullanılır.
Eclipse Ti-S MikroskobuNikonFaz kontrastlı görüntülerin çekilmesi için kullanılır. Nikon Elements Basic Research yazılımı (4.10.01) ile arabirim içeren bir QiClick kamera kullanılarak dijital görüntü elde etme ile.
içinde 4 mM

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  2. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  3. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  4. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  5. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  6. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  7. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  8. Huebner, E. A., Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  9. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons’ Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  10. Kyungsuk, K., Liu, K., et al. Promoting Axon Regeneration in the Adult CNS by Modulation of the PTEN / mTOR Pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  11. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nat. Neurosci. 18 (7), 942-952 (2015).
  12. Cregg, J. M., DePaul, M. A., Filous, A. R., Lang, B. T., Tran, A., Silver, J. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp. Neurol. 253, 197-207 (2014).
  13. Buffo, A., Rolando, C., Ceruti, S. Astrocytes in the damaged brain: Molecular and cellular insights into their reactive response and healing potential. Biochem. Pharmacol. 79 (2), 77-89 (2010).
  14. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146-156 (2004).
  15. Toy, D., Namgung, U. Role of Glial Cells in Axonal Regeneration. Exp. Neurobiol. 22 (2), 68-76 (2013).
  16. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  17. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  18. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  19. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  20. Fry, E. J., Chagnon, M. J., López-Vales, R., Tremblay, M. L., David, S. Corticospinal tract regeneration after spinal cord injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma deficient mice. Glia. 58 (4), 423-433 (2010).
  21. Lin, B., Xu, Y., Zhang, B., He, Y., Yan, Y., He, M. -C. MEK inhibition reduces glial scar formation and promotes the recovery of sensorimotor function in rats following spinal cord injury. Exp. Ther. Med. 7 (1), 66-72 (2014).
  22. Bradbury, E. J., Carter, L. M. Manipulating the glial scar: Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 306-316 (2011).
  23. Vadivelu, S., Stewart, T. J., et al. NG2+ Progenitors Derived From Embryonic Stem Cells Penetrate Glial Scar and Promote Axonal Outgrowth Into White Matter After Spinal Cord Injury. Stem Cells Transl. Med. 4, 401-411 (2015).
  24. Nishimura, Y., Natsume, A., et al. Interferon-beta delivery via human neural stem cell abates glial scar formation in spinal cord injury. Cell Transplant. 22 (12), 2187-2201 (2013).
  25. Guo, Z., Zhang, L., Wu, Z., Chen, Y., Wang, F., Chen, G. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  26. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  27. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  28. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  29. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  30. Morrison, B. I. III, Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  31. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  32. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  33. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  34. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain tissue. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).
  35. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  36. Stiles, J., Jernigan, T. L. The basics of brain development. Neuropsychol. Rev. 20 (4), 327-348 (2010).
  37. Kaneko, N., Marín, O., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67 (2), 213-223 (2010).
  38. Hidalgo, A., Booth, G. E. Glia dictate pioneer axon trajectories in the Drosophila embryonic CNS. Development. 127 (2), 393-402 (2000).
  39. Chotard, C., Salecker, I. Neurons and glia: Team players in axon guidance. Trends Neurosci. 27 (11), 655-661 (2004).
  40. Wang, C., Liu, F., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21 (11), 1534-1550 (2011).
  41. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487 (4), 407-427 (2005).
  42. Zukor, K. A., Kent, D. T., Odelberg, S. J. Meningeal cells and glia establish a permissive environment for axon regeneration after spinal cord injury in newts. Neural Dev. 6, (2011).
  43. Reier, P. J. Penetration of grafted astrocytic scars by regenerating optic nerve axons in xenopus tadpoles. Brain Res. 164 (1-2), 61-68 (1979).
  44. Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
  45. Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-Dependent Glial Cell Bridges Facilitate Spinal Cord Regeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 32 (22), 7477-7492 (2012).
  46. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  47. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  48. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  49. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  50. Alexander, J. K., Fuss, B., Colello, R. J. Electric field-induced astrocyte alignment directs neurite outgrowth. Neuron Glia Biol. 2 (2), 93-103 (2006).
  51. Hsiao, T. W., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes alignment and reactivity on collagen hydrogels patterned with ECM proteins. Biomaterials. 39, 124-130 (2015).
  52. Alekseeva, T., Katechia, K., Robertson, M., Riehle, M. O., Barnett, S. C. Long-term neurite orientation on astrocyte monolayers aligned by microtopography. Biomaterials. 28 (36), 5498-5508 (2007).
  53. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  54. Conway, A., Schaffer, D. V. Biomaterial microenvironments to support the generation of new neurons in the adult brain. Stem Cells. 32 (510), 1220-1229 (2014).
  55. Barry, D., McDermott, H. Differentiation of radial glia from radial precursor cells and transformation into astrocytes in the developing rat spinal cord. Glia. 50 (3), 187-197 (2005).
  56. Pertusa, M., Garcia-Matas, S., Rodriguez-Farre, E., Sanfeliu, C., Cristofol, R. Astrocytes aged in vitro show a decreased neuroprotective capacity. J. Neurochem. 101 (3), 794-805 (2007).
  57. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  58. Balgude, A. P., Yu, X., Szymanski, A., Bellamkonda, R. V. Agarose gel stiffness determines rate of DRG neurite extension in 3D cultures. Biomaterials. 22 (10), 1077-1084 (2001).
  59. Smeal, R. M., Tresco, P. A. The influence of substrate curvature on neurite outgrowth is cell type dependent. Exp. Neurol. 213 (2), 281-292 (2008).
  60. Smeal, R. M., Rabbitt, R., Biran, R., Tresco, P. A. Substrate curvature influences the direction of nerve outgrowth. Ann. Biomed. Eng. 33 (3), 376-382 (2005).
  61. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  62. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L. A., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2016).
  63. McCarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of Separate Astroglial and Oligodendroglial Cell Cultures from Rat Cerebral Tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  64. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  65. Kim, S. U., Stern, J., Kim, M. W., Pleasure, D. E. Culture of purified rat astrocytes in serum-free medium supplemented with mitogen. Brain Res. 274 (1), 79-86 (1983).
  66. Morrison, R. S., de Vellis, J. Growth of purified astrocytes in a chemically defined medium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 (11), 7205-7209 (1981).
  67. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
  68. Hsiao, T. W., Swarup, V. M., Kuberan, B., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes specifically remove surface-adsorbed fibrinogen and locally express chondroitin sulfate proteoglycans. Acta Biomater. 9 (7), 7200-7208 (2013).
  69. Phillips, J. B., Bunting, S. C. J., Hall, S. M., Brown, R. A. Neural tissue engineering: a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 11 (9), 1611-1617 (2005).
  70. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  71. Filous, A. R., Miller, J. H., Coulson-Thomas, Y. M., Horn, K. P., Alilain, W. J., Silver, J. Immature astrocytes promote CNS axonal regeneration when combined with chondroitinase ABC. Dev. Neurobiol. 70 (12), 826-841 (2010).
  72. Johansson, S., Strömberg, I. Guidance of dopaminergic neuritic growth by immature astrocytes in organotypic cultures of rat fetal ventral mesencephalon. J. Comp. Neurol. 443 (3), 237-249 (2002).
  73. Jiang, Z., Han, Y., Cao, X. Induced pluripotent stem cell (iPSCs) and their application in immunotherapy. Cell. Mol. Immunol. 11 (1), 17-24 (2014).
  74. Wang, L., Cao, J., et al. Immunogenicity and functional evaluation of iPSC-derived organs for transplantation. Cell Discov. 1, (2015).
  75. Wolmer-Solberg, N., Cederarv, M., Falci, S., Odeberg, J. Human neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress an allogeneic lymphocyte response. Stem Cell Res. 2 (1), 56-67 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aligned Astrocyte NetworksTissue Engineered ScaffoldsHydrogel Micro columnAstrocyte Self assemblyCollagen CoatingConfocal ImagingGFAP ExpressionNeurite ExtensionCNS RegenerationLiving Scaffolds

İlgili makaleler