Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü
Bu makalede
Özet
Özet
Spinal kord nöronlarının izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunmaktayız. Nöronlar yenidoğan C57BL / 6 farelerinden elde edilir ve 1-3 doğum sonrası izole edilir. Bir fare çöpü, genellikle bir üreme çiftinden doğan 4-10 yavru, bir deney için toplanır ve izofluran ile ötenazi yapıldıktan sonra omurilik kordları her fareden ayrı ayrı toplanır. Spinal kol disseke edilir ve omurilik o kolondan salınır. Omurga kordonları nöronların ve diğer hücrelerin dokudan salınmasına izin veren bir enzimatik proteaz için teslimat yüzey alanını arttırmak üzere kıyılır. Tritürasyon daha sonra hücreleri çözeltiye boşaltmak için kullanılır. Bu çözelti, daha sonra, nöronların izole edilmesine olanak tanıyan, çözeltideki çeşitli hücreleri ayırmak için bir yoğunluk derecesinde fraksiyon haline getirilir. Bir çöp grubundan yaklaşık 1-2.5 x 106 nöron izole edilebilir. Nöronlar daha sonra yapışkanlı fiillerle kaplanmış oyukların üzerine serilirUygun gelişme ve olgunlaşma için izin verilen rs. Nöronlar büyüme ve kültür ortamında olgunluğa erişmek için yaklaşık 7 gün alır ve bundan sonra tedavi ve analiz için kullanılabilir.
Giriş
Spinal kord patolojisini anlamak, makroskopik ve mikroskobik seviyelerde çeşitli modellerin kullanılmasını gerektirir. Büyük ve küçük hayvan modelleri 1 , 2 , 3 spinal kord hastalığının ve yaralanmasının in vivo araştırmalarında kullanılır. Bu sorunların in vivo incelenmesi esastır ancak omurilik analizi, tüm omurilik homojenatı veya doku kesitleri 4 ile sınırlıdır. Bu, var olan nöronlar ve çevresindeki glialar arasında omurilikteki spesifik tepkileri ve hedefleri ayırmaya çalışırken bazı belirsizlik yaratır. Genetik olarak man....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu prosedürdeki hayvanlara bakım ve tedavi, Colorado Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'nin kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.
1. Çözüm Hazırlama
- Tüm çözeltileri, Tablo 1'de gösterildiği gibi uygun sıcaklıklarda hazırlayın ve saklayın.
2. Kaplama Kuyuları ve Slaytlar
NOT: Nöronlar plastik veya cam yüzeylere iyi yapışmamaktadır.
- Nöronların izolasyonundan bir gün önce steril 24-çukurlu bir kültür plakasının kuyularını 0.5 mL Poly-D-Lysine (PDL, Tablo 2 ) ile kaplayın ve O / N....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu tekniği kullanarak, tek bir çöp (4-10 yavru), kültür plakalarına eklenmeye uygun 1-2.5-106 nöronların izolasyonuna olanak tanır. Tipik olarak, 4-8 oyuk yukarıda belirtilen konsantrasyonda tohumlanır ( yani 300.000 hücre / mL). Şekil 3 , düşük ( a ) ve yüksek ( b ) büyütme ışık mikroskopisinde kültürde bir hafta sonra nöronların bu konsantrasyonda görünüşünü göstermektedir. Bununla birlikte, aynı zamanda 500,000 h.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu teknik, omurilik nöronlarının güvenilir bir şekilde kültürlenmesine izin verir. Teknik yeterlilik elde edildiğinde, tamamlanması yaklaşık 3,5 saat sürer. Nöronların izolasyonunu, yaklaşık 4 saat içinde 2 ayrı çöpten (toplam 16 fare) gerçekleştirebildik. Fizibilitedeki ana adım, omurilik kablolarını farelerden ayıklamaktır. Verim, çeşitli kuyucukların kaplanmasına ve çeşitli koşullar altında nöronların test edilmesine imkan verir. Olgunlaşma sonrasındaki nöronları tedavi edebildik ve Western leke analizi ile protein e.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklamaları yok.
Teşekkürler
Yazarların onayları yok.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hazırda Bekletme A Orta - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hazırda Bekletme A Eksi Kalsiyum - 500 mL | Beyin Bitleri | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Takviyesi 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Liyofilize - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobazal A Orta - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poli-D-Lizin (PDL) hidrobromür - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Fare Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Tripan Mavisi - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Yoğunluk Gradyan Ortamı - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Diklorodimetilsilan ( DMDCS, Sigma Silikoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Kloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Cam Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipet ampulü - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| MARKA® Petri kabı, cam - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Steril 24 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (cam sayma odası) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Cam Slaytlar - 12 mm steril kapaklı cam - kaplamasız | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Tavşan Monoklonal Antikoru - 100 & mikro; L | Abcam | ab177487 | Paraformaldehit (PFA) içinde fiksasyon ve %5 BSA ile bloke edildikten sonra, 12 mm'lik bir lamel üzerindeki hücreler, 4 ° C'de 18 saat boyunca 1:200 oranında seyreltilmiş antikor içinde inkübe edildi; C |
| MAP-2 Fare Monoklonal Antikoru - 50 & mikro; L | Abcam | ab11267 | Paraformaldehit içinde fiksasyon ve %5 BSA ile bloke edildikten sonra, 12 mm'lik bir lamel üzerindeki hücreler, 4 ° C'de 18 saat boyunca 1:500 oranında seyreltilmiş antikor içinde inkübe edildi; Ç |
Kaynaklar
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ische....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
