Method Article

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

DOI:

10.3791/55873

⸱

September 15th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, 3Department of Bioengineering, Northeastern University, 4Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre davranış ve kök hücre farklılaşması etkileyebilecek birçok biyolojik bir çekim gücü vardır. Genel hücre kültür yaklaşımlar içinde orta kontrol hücre davranış olarak çözünür faktörler güveniyor. Ancak, çözünür eklemeler belirli motifler içeren hikâyeler, matris bağlı büyüme faktörleri gibi sinyal, hücre-hücre sinyallemesi ve hücreleri üzerinde ortak etkiler vardır kayma biyokimyasal cues taklit edemez. Ayrıca, yüzey sertliği gibi Matrix biyofiziksel özellikleri geleneksel hücre kültürü çalışmalarının yöntemler kullanarak kolaylıkla yönetilebilir değil hücre kader, önemli rol oynarlar. Bu yöntemde, desenli biyoaktif proteinler sentetik polietilen glikol (PEG) hydrogels photochemistry kullanarak sağlamak için basit bir protokol tanımlayan. Bu platform yüzey sertliği ve kayma biyokimyasal cues bağımsız kontrol için sağlar. Bu hydrogels çok sayıda fizyolojik ilgili sertlik değerleri elde edebilirsiniz. Ayrıca, bu hydrogels yüzeylerin photopatterned biyoaktif peptidler ile olabilir veya proteinler thiol-KD ile kimya reaksiyonları tıklatın. Bu yöntemler protein işlevi sonra yüzey immobilizasyon korumak için optimize edilmiştir. Bu, herhangi bir protein veya peptid ilgi desenleri çeşitli oluşturmak için uygulanacak çok yönlü bir protokoldür. Son olarak, onlar dağınık şekilde belirli sinyallere yanıt olarak bu biyoaktif hydrogels yüzeyler numaralı seribaşı hücreler zamanla izlenebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre davranışını etkiler birçok çekim gücü vardır. Genel olarak, tipik hücre kodlamayla teknikleri çözünür faktörler üzerinde hücresel yanıt temin için itimat; Ancak, bu yaklaşım için sınırlamalar vardır. Bu yöntemler yaygın bulunan tüm sinyal motifleri doğru görüntüleyemiyor içinde vivo. Böyle sinyal mekanizmaları münzevi büyüme faktörleri, hücre-hücre sinyallemesi ve dağınık şekilde özel biyokimyasal ipuçları içerir. Ayrıca, yüzey sertliği hücre davranış ve kök hücre farklılaşması içinde önemli bir rol oynayabilir ve kolaylıkla ortak hücre kodlamayla uygulamaları1,2kullanarak yönetilebilir değil. B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlık malzemeleri hidrojel sentezi için

  1. hazırla hisse senedi çözümler PEGDA, lityum fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) ve steril koşullarda fibronektin ve temel Hesaplamalar (tablo 1A).
    1. Tartmak ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bileşikler geçiyoruz. Tipik olarak, çözüm konsantrasyonu 50 ve 200 mg/mL (5-%20 ağırlık/hacim) arasında çalışma PEGDA korumak. Sterilizasyon için 0,22-µm şırınga filtre aracılığıyla PEGDA çözüm pipette.
      Not: gelen ışık onları korumak için kaydırma bir folyo ile kaplı PEGDA çözümleri tutun. (Her deneme için önerilir) PEGDA taze bir çözüm hazırlayın.
      2. Üretici firmaya esaslı ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PEG hydrogels yüzeyinde biyoaktif desenleri oluşturmak için protokol şekil 1' de gösterilmiştir. Bir elektronik tablo birim ve konsantrasyon için her hisse senedi eriyik (tablo 1A) hesaplamak için geliştirilmiştir. Proteinler hidrojel yüzey immobilize 2-iminothiolane (şekil 1B) ile değiştirilir. Bu reaksiyon tablo 1Bbirimlerden kullanılarak gerçekleştirilir. Öncü hidrojel çözüm i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı biyolojik uygulamalar için biyoaktif protein desen oluşturmak için bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı farklı deneyler için adapte yapılan birçok değişikliği vardır. İlk olarak, hücre ek gereksinimleri için farklı hücre türleri değişir. Zavallı hücre eki jeller için başlangıçta gözlem yapılırsa, öncü çözüm içindeki ECM protein konsantrasyonu artan tavsiye edilir. Diğer ECM protein kollajen, laminin veya bunların bir arada farklı türleri dahil olmak üzere fibronektin yerine kullanılabilir. Her yeni hü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada özellikle Amerikan Kalp Derneği bilim adamı kalkınma hibe gelen hibe tarafından desteklenmiştir (G.D. 12SDG12050083), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21HL102773, R01HL118245 G.D. için) ve Ulusal Bilim Vakfı (CBET-1263455 ve G.D. CBET-1350240).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEG-diakrilat (PEGDA)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-3400Ayrıca sentezlenebilir veya diğer satıcılar aracılığıyla satın alınabilir. Farklı moleküler ağırlıklar kullanılabilir.
Lityum Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP)Laboratuvarda sentezlenen
FibronektinCorning356008gibi diğer hücre bağlanma proteinleri kullanılabilir
SigmaD8537-500ML
PhotomaskFineLine Imagingn/aYüksek çözünürlüklü DPI ile şeffaf sayfalara özel baskılar.
Bağlayıcı KlipslerÇeşitli Satıcılar
Kompakt UV Işık Kaynağı (365nm)UVPUVP-21Diğer UV ışık kaynakları kullanılabilir, güç kalibrasyonu gereklidir.
2-iminotiolan (Pierce Traut ' s Reaktifi)Thermo Sci.26101
Ellman' s Reaktifi: DTNB; 5,5-ditio-bis (2-nitrobenzoik asit)Thermo Sci.22582
insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler)Lonzageçiş sayısı 6- 10 arasında
EGM-2 MediaLonzaCC31-56, CC-3162EGM-2 büyüme faktörü olmayan deneylerde kullanılmıştır. Hücre bakımı için tam EGM-2 ortamı kullanıldı
%0.25 Tripsin EDTALife Tech25200-056
Tripsin NötrleştiriciLife TechR-002-100
SantrifüjÇeşitli Venders
HemositometreHausser Sci. Parlak çizgi
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma AldrichE6758
0.22 ve mikro; m filtreHücre Tedavisi229743
1 mL Şırınga
Cam Mikroskop SlaytlarFisher Sci.12-550C
Plastik ara parçalarÇeşitli Satıcılar0.5mm kalınlık
% 70 EtanolBICCA2546.70-1
Biyo-kalkanBiyo-kalkan19-150-0010
Bradford Reaktifi BIO-RAD
Tuz Giderici Reçine - Sephadex G-25GE Healthcare95016-754
Microspin KolonlarThermo Sci.
AR-G2 rehometerTA Instruments
Laminin, matrigel Fosfat tamponlu salin (PBS) , PI69725

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
  2. Evans, N. D., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrogel PatterningPhotochemistry TechniqueBioactive ProteinsPEG HydrogelsThiol ene ChemistrySubstrate StiffnessSpatial CuesProtein ImmobilizationCell MigrationVEGF Patterning

Related Articles