Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

Summary

Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .

Abstract

Hücre davranış ve kök hücre farklılaşması etkileyebilecek birçok biyolojik bir çekim gücü vardır. Genel hücre kültür yaklaşımlar içinde orta kontrol hücre davranış olarak çözünür faktörler güveniyor. Ancak, çözünür eklemeler belirli motifler içeren hikâyeler, matris bağlı büyüme faktörleri gibi sinyal, hücre-hücre sinyallemesi ve hücreleri üzerinde ortak etkiler vardır kayma biyokimyasal cues taklit edemez. Ayrıca, yüzey sertliği gibi Matrix biyofiziksel özellikleri geleneksel hücre kültürü çalışmalarının yöntemler kullanarak kolaylıkla yönetilebilir değil hücre kader, önemli rol oynarlar. Bu yöntemde, desenli biyoaktif proteinler sentetik polietilen glikol (PEG) hydrogels photochemistry kullanarak sağlamak için basit bir protokol tanımlayan. Bu platform yüzey sertliği ve kayma biyokimyasal cues bağımsız kontrol için sağlar. Bu hydrogels çok sayıda fizyolojik ilgili sertlik değerleri elde edebilirsiniz. Ayrıca, bu hydrogels yüzeylerin photopatterned biyoaktif peptidler ile olabilir veya proteinler thiol-KD ile kimya reaksiyonları tıklatın. Bu yöntemler protein işlevi sonra yüzey immobilizasyon korumak için optimize edilmiştir. Bu, herhangi bir protein veya peptid ilgi desenleri çeşitli oluşturmak için uygulanacak çok yönlü bir protokoldür. Son olarak, onlar dağınık şekilde belirli sinyallere yanıt olarak bu biyoaktif hydrogels yüzeyler numaralı seribaşı hücreler zamanla izlenebilir.

Introduction

Hücre davranışını etkiler birçok çekim gücü vardır. Genel olarak, tipik hücre kodlamayla teknikleri çözünür faktörler üzerinde hücresel yanıt temin için itimat; Ancak, bu yaklaşım için sınırlamalar vardır. Bu yöntemler yaygın bulunan tüm sinyal motifleri doğru görüntüleyemiyor içinde vivo. Böyle sinyal mekanizmaları münzevi büyüme faktörleri, hücre-hücre sinyallemesi ve dağınık şekilde özel biyokimyasal ipuçları içerir. Ayrıca, yüzey sertliği hücre davranış ve kök hücre farklılaşması içinde önemli bir rol oynayabilir ve kolaylıkla ortak hücre kodlamayla uygulamaları^1,2kullanarak yönetilebilir değil. Biomaterial yaklaşımlar sinyal mekanizmaların keşfetmeye başlamak için yeni bir platform sunuyoruz. Özellikle, hydrogels yüzey sertliği^3,4, immobilizing proteinler ve peptidler^5,6, ayarlama ve dağınık şekilde belirli kalıpları^7, oluşturmak için mükemmel aday olan ⁸.

Hydrogels doku Mühendisliği hücre dışı Matriks (ECM)^9,10ile onların biyofiziksel ve biyokimyasal ortak nedeniyle iskele olarak yaygın olarak kullanılır. Biyouyumlu ve vücudun birçok dokularda bulunan doğal polimerler için iskele, ortak seçenekleri bulunmaktadır. Doğal polimerler yüzeyler kullanma sınırlaması onlar bioconjugation için kolay elde edilebilir kimyasal moieties olmaması. Öte yandan, sentetik hydrogels, bu nedenle PEG, hedeflenen kimyaları^11,12mükemmel platformlar şunlardır. Ayrıca, PEG hydrogels hücresel yanıt temin değil ve bu nedenle inert omurgalarına biyoaktif iskele oluşturmak için kullanılır.

Biyoaktif hydrogels oluşturmak için kimya reaksiyonları istihdam edilmektedir photopolymerization ve thiol-KD'ı tıklatın. Bu photoreactions bir photoinitiator ve UV ışık kaynağı gerektirir. Photoinitiators UV ışığına tanıttığında, formu radikaller koparamaz. Tezler radikaller reaksiyonu başlatmak için gerekli olan ancak protein bioactivity^12,13olumsuz yönde etkileyebilir. Bu nedenle, photoinitiator ve UV pozlama süreleri protein bioactivity korumak için en iyi duruma getirmek çok önemlidir.

Bu yöntemde, hydrogels akrilat akrilat zinciri büyüme photopolymerization sentezlenmiş. PEG-diacrylate (PEGDA) monomerleri dallı polimer ağlar hidrojel yapısı için sorumlu oluşturmak için birbirleri ile tepki. PEGDA monomerleri jel öncü çözüm içindeki konsantrasyonu substrat sertlik kontrol edecek. Hidrojel boyutu nedeniyle küçük gözenek, ECM proteinler fibronektin gibi kolayca hidrojel hücre eki amacıyla içinde dahil edilebilir. Son olarak, bu hydrogels yüzey ile biyoaktif peptidler desenli olabilir veya proteinler thiol-KD ile kimya reaksiyonları tıklatın. Burada, unreacted ücretsiz İnceltilebilen hidrojel sistemi içinde protein veya UV ışığına maruz kaldığında peptid bulunan ücretsiz thiols ile tepki olacaktır. Proteinler veya peptidler hidrojel yüzeyinde immobilize sonra hidrojel 4 ° C'de birkaç hafta için bioactivity kaybetmeden depolanabilir. Bu kolaylık, esnek deneysel planlama ve labs arasında işbirliği imkanı sunmaktadır. Genel olarak, bu platform biyomekanik ve mekansal biyokimyasal kontrol, bağımsız birbirlerinin hücresel davranışlarını etkilemek belgili tanımlık fırsat sağlar.

Protocol

1. hazırlık malzemeleri hidrojel sentezi için

1. hazırla hisse senedi çözümler PEGDA, lityum fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) ve steril koşullarda fibronektin ve temel Hesaplamalar (tablo 1A).
   1. Tartmak ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bileşikler geçiyoruz. Tipik olarak, çözüm konsantrasyonu 50 ve 200 mg/mL (5-%20 ağırlık/hacim) arasında çalışma PEGDA korumak. Sterilizasyon için 0,22-µm şırınga filtre aracılığıyla PEGDA çözüm pipette.
      Not: gelen ışık onları korumak için kaydırma bir folyo ile kaplı PEGDA çözümleri tutun. (Her deneme için önerilir) PEGDA taze bir çözüm hazırlayın.
   Üretici firmaya esaslı
   2. reconstitute fibronektin protein toz ' s tavsiye. 1 mg/mL, aliquot, fibronektin hisse senedi çözüm korumak 60 ila 100 µL aliquots, içine ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de depolayın. Aliquots 4 ° C'de defrost için birkaç saat veya gece kullanmadan önce. Protein hisse senedi steril koşullarda verilmediyse, sterilizasyon için 0,22 µm şırınga filtre kullanın.
      Not: Fibronektin hücre eki için kullanılır. Diğer ECM proteinler yerine.
   3. LAP stok belgili tanımlık eriyik için tartmak ve içinde PBS çözülür; 25 mg/mL tipik bir hisse senedi toplama olduğunu. Eriterek ile herhangi bir sorun olursa solüsyon içeren temizleyicide. Çözüm sterilizasyon için 0,22 µm filtre geçişi. Kapak folyo sarma ile tur ve 4 ° C'de için birkaç ay kadar devam.
      Not: Photochemistry için kullanılan photoinitiator kucak mı.
2. Hidrojel oluşumu için steril cam slayt kalıpları hazırlamak.
   1. Otoklav bir polyester sayfası; bir her jel kalıp için gereklidir. İki cam slayt ve üç plastik çubukları (0.5 mm kalınlığında) her jel kalıp için en az 2 h için % 70 etanol içinde emmek, ancak genellikle geceleme ıslatın izin verin. % 70 etanol için kullanmadan önce 10 dk içinde beş bağlayıcı klipleri her jel kalıp için emmek.
   2. Hücre kültür hood hava kuru birkaç saat için izin için cam slaytlar, çubukları ve bağlayıcı klipleri bir küçük autoclaved levha üzerine koyun.
   3. Bir cam slayt kenarındaki plastik çubukları yerleştirerek hidrojel kalıpları hazırlama. İkinci cam slayt üstüne yerleştirin. Çubukları bağlayıcı klipleri, iki uzun her tarafı ve bir top ile yanyana sıkıca güvenli.
      Not: Eğer bu düzgün monte değil, jel çözüm sızıntısı olacak.
   4. Yüzey sterilize hücre kültürü ile kalıp kullanmadan 30 dk önce ışık UV hood. Yarım aracılığıyla, flip her iki yüzeyler maruz kalıp.

2. Proteinler ile ücretsiz Thiol değiştirme

1. thiol proteinler (tablo 1A) üzerinde Amin dönüştürme için elektronik tablo hesaplamalar kullanarak hisse senedi çözümleri hazırlayın.
   1. Tepki tampon yapmak için PBS pH 8 için ayarlamak ve 5 mM EDTA ekleyin. Pipet tepki arabelleğe 0,22 µm şırınga filtre sterilizasyon için.
      Not: disülfür bağları oluşturan thiols korur gibi EDTA, önemlidir. Thiol grupları yapılmasına tepki için azaltılmış formunda kalmalı.
   2. Tartmak 2-iminothiolane (Traut ' s reaktif) ve 2 mg/mL (14 mM) hisse senedi çözüm konsantrasyon için tepki arabellekte geçiyoruz. Çözüm 0,22-µm şırınga filtre sterilizasyon için geçişi. 4 ° C'de için birkaç ay kadar hisse senedi çözüm mağaza.
      Not: 2-iminothiolane ücretsiz aminler solvent maruz üzerinde proteinler tepki verir ve bunları ücretsiz thiols dönüştürür moleküldür.
   3. Reaksiyon arabellek 0,1 ve 1 mg/mL arasında bir konsantrasyon, protein reconstitute. Sürece daha önce steril, sterilizasyon için 0,22-µm şırınga filtre aracılığıyla bu çözüm pipette.
      Not: Bu proteinin hidrojel yüzeye desenli biyokimyasal sinyal buydu. Protein konsantrasyonları farklılık gösterebilir, Ayrıca, daha yüksek konsantrasyonlarda güçlü protein desenler için ideal iken.
2. Her iki hisse senedi çözümleri birlikte karıştırılarak 2-iminothiolane ile protein tepki; tablo 1B doğru hacim oranı hesaplamak için kullanın. Genelde 8:1 2-iminothiolane protein molar oranını kullanırsınız.
   Not: Daha büyük proteinler bir veya daha fazla konsantrasyonları sulandırmak, 2-iminothiolane daha yüksek bir molar oranını kullanın. Üreticiye başvurun ' s protokolü ¹⁵.
3. Oda sıcaklığında 1 h için tepki kuluçkaya. Thiolated protein ürün üretici takip kalan Reaktanları kaldırmak için desalting spin mikro-sütun kullanmak ' s protokolü ¹⁶.
   Not: Dışlama bu reçine 5 KDa sınırıdır.
4. Kullanım Ellman ' s tahlil kantitatif ölçmek için ücretsiz thiols protein başına sayısı. Üretici takip ' s Protokolü tahlil ¹⁷.

3. Hidrojel oluşumu

1. jel öncü çözüm temel alan değerleri üzerinde Oluştur Tablo 1 c hesaplanır. Mix birlikte PEGDA, fibronektin ve kucak birimleri. Şiddetle homojen bir çözüm olun ama kabarcıklar iç karışıklık yaratarak önlemek için çözüm pipette. Işıktan korunan çözüm devam.
2. Jel öncü çözüm jel kalıp iki cam slayda dikkatle pipette. Tipik olarak, kalıp için 800 ile 1.000 µL arasında bir birim eklemek. Jel çözüm için UV ışık kalıp içinde maruz (dalga boyu: 365 nm, güç: 3-4 mW/cm ²) 1-2 hidrojel oluşturmak üzere min için.
   Not: yetenekleri biçimlenme yüzey proteini sınırlar gibi hidrojel uzun süreli UV ışığa maruz bırakmayın.
3. Bağlayıcı klipleri almak ve iki yan çubukları basınç uygulayarak üst cam slayt yavaşça çıkarın.
4. Bir uygun ölçekli biyopsi yumruk hidrojel örnekleri kesmek için kullanın. Birden çok hydrogels çoğaltır hizmet ve örnekleri denetlemek için jel dikdörtgenden dışarı yumruk.

4. Hidrojel sertlik ölçümleri

1. yumruk hydrogels 8'li ile dışarı mm çap biyopsi yumruk için bir 8 mm paralel plaka rheometer. Bir hidrojel örnek rheometer yük (Tablo reçetesi görmek).
2. Alt paralel plaka geometri yani 8 mm çapında yapımı kadar jel yüzeyi ile temas. Gap mesafe 0.5 mm kalınlığında hidrojel örnek için 0.5 mm.
3. Gerçekleştir zaman piyango % 0.1 soy, 0.1 Hz frekans ve 37 5 min için ° C. ortalama G ' değerleri arasında her zaman süpürme. Çoğaltır her kompozisyon için bağımsız hydrogels çalışacak.
   Not: G ' değer-meli var olmak kararlı zaman puan arasında; Eğer onlar are değil, yüzde süzün ve sıklığı piyango uygun seçmek için gerçekleştirilmesi ¹⁴ değerleri.

5. Protein desenlendirme

1. hazırla bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) programı kullanarak photomask için gerekli kalıbı. Photomask yüksek çözünürlüklü bir yazıcı kullanarak bir şeffaf kağıda yazdırmak. Photomask % 70 etanol için kullanmadan önce 10 dk bekletin. Hava photomask kuru bir hücre kültür başlıklı kullanmadan önce izin.
2. Adımında hidrojel 2 yüzeye yüzey desenlendirme için hazırlanan thiolated protein çözüm ekleyin. 1-2 µL/cm ² thiolated protein çözüm her boşaltma jel yüzeyine pipette.
   Not: Protein birimin en aza indirmek önemlidir; Sadece hidrojel örnek tüm yüzeyine eşit olarak örtecek kadar eklemek.
3. Dikkatle photomask hidrojel bir yüzeye yerleştirin. Hava kabarcıkları hidrojel yüzey arasındaki photomask izin verme. Yavaşça aşağı oluşturan herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için maskeyi basın.
4. Ortaya çıkarmak için UV ışığı ikinci turunda hidrojel (dalga boyu: 365 nm, güç: 3-4 mW/cm ²) için 30-60 s.
   Not: Protein fonksiyon kaybına neden olmadan güçlü bir desen oluşturmak için yeterli UV ışık desen maruz önemlidir.
5. Hydrogels unreacted tür kaldırmak ve her hidrojel iyi plaka içinde yerleştirmek için PBS ile yıkayın. Jeller her kuyunun içine yerleştirirken dikkatli olun; desenli yüzeyi yukarı yüz olduğundan emin olun. Jelleri PBS içinde 4 ° C'de yıkama; jelleri istikrarlı en az iki hafta 4 ° C.

6. Hydrogels hücre tohum için hazırlık

1. 5-10 dk 37 ° C'de tohum önce Bazal ortamda jelleri kuluçkaya. İnsan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) için EGM-2 Orta büyüme faktörleri olmadan kullanın. Her eklenen orta hacmi en aza indirmek iyi hidrojel yüzen önlemek için. 48-şey plaka için orta 250 µL hacmi kullanın.
2. Spin aşağı 300 x plaka g hydrogels kuyu alt kısmında bulunur ve değil yüzer emin olmak için 3 dakika için. Bunu hemen hücre tohum önce.

7. Hücre tohumlama Hydrogels üzerinde

hücre Tohumculuk

1. kullanımı Standart steril memeli hücre kültür yordamları ve deneysel prosedürler. HUVECs Standart hücre dekolmanı protokolleri kullanarak doku kültürü şişeler kaldırın. Steril PBS ile doku kültürü çanak yıkama ve tripsin 3-5 dk 37 ile kuluçkaya ° C.
2. Trypsinized hücre süspansiyon aşırı hücre orta veya tripsin nötrleştirici çözümü ile yavaşlaması.
3. Santrifüj 300 x g de hücre süspansiyon aşağı spin için 5 dk. dikkatle süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet devam.
4. Hücre Pelet Bazal EGM-2 hiçbir büyüme faktörleri ile resuspend. Bir hemasitometre Hücre sayımı için kullanın.
Yavaş yavaş her de bu yüzden jelleri rahatsız etmemek için merkezi haline pipetting tarafından
5. eklemek 75.000 hücreler/cm ² her hidrojel için yüzey. Bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de iyi tabak yerleştirin İçin birkaç çıkarmak günler, düzenli aralıklarla yemek gözlem için.

8. Bioactivity değerlendirilmesi

1. kültür E. coli LB suyu 37 ° C ve 200 rpm yörünge bir süspansiyon süspansiyon geceleme. E. coli kültür spin, dikkatle boşaltmak ve PBS asgari miktar hücre Pelet sulandırmak. Lizozim tartmak ve 1 mg/mL için stok belgili tanımlık eriyik, sulandırmak.
2. Küçük hacimli (25 µL) lizozim hisse senedi çözümü microcentrifuge tüpler içine pipette. KUCAK photoinitiator (0-12 mM) çeşitli düzeylerde ekleyin ve UV ışık 1 dk örnekleri ortaya çıkarmak. Ayrı bir grup tur (2 mM) aynı miktarda lizozim ekleyin ve örnekleri için değişen UV ışık kez açığa (0-4 dk). Her tedavi için çoğaltır içerir.
Lizozim örnekleri için bir final lizozim protein konsantrasyonu 0.5 mg/mL
3. Ekle eşit birim konsantre E. coli çözüm. Oda sıcaklığında 4 h için karma çözümler kuluçkaya.
   Not: Bu süre bakteriyel hücre duvarı parçalayıcı ve proteinler çözüm içine serbest bırakmak fonksiyonel lizozim sağlar.
4. Tedavi edilmezse lizozim E. coli ile olumlu bir denetim için inkübe kullanın; bu % 100 biyoaktif ölçüm düşünün. PBS bir negatif kontrol yalnız ile inkübe lizozim çözüm kullanın.
5. Hücre artıkları kaldırmak ve süpernatant korumak için örnekleri spin. Toplam konsantrasyonu protein içinde bakteriyel lysate miktarını ölçmek için süpernatant ölçmek için bir Bradford tahlil çalıştırın.
6. Çalıştırmak üretici aşağıdaki Bradford tahlil ' s protokolü ¹⁸. Kat değiştirme protein konsantrasyon negatif denetimine göre hesaplamak.

Results

PEG hydrogels yüzeyinde biyoaktif desenleri oluşturmak için protokol şekil 1' de gösterilmiştir. Bir elektronik tablo birim ve konsantrasyon için her hisse senedi eriyik (tablo 1A) hesaplamak için geliştirilmiştir. Proteinler hidrojel yüzey immobilize 2-iminothiolane (şekil 1B) ile değiştirilir. Bu reaksiyon tablo 1Bbirimlerden kullanılarak gerçekleştirilir. Öncü hidrojel çözüm i...

Discussion

Bu iletişim kuralı biyolojik uygulamalar için biyoaktif protein desen oluşturmak için bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı farklı deneyler için adapte yapılan birçok değişikliği vardır. İlk olarak, hücre ek gereksinimleri için farklı hücre türleri değişir. Zavallı hücre eki jeller için başlangıçta gözlem yapılırsa, öncü çözüm içindeki ECM protein konsantrasyonu artan tavsiye edilir. Diğer ECM protein kollajen, laminin veya bunların bir arada farklı türleri dahil olmak üzere fibronektin yerine kullanılabilir. Her yeni hü...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diakrilat (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Ayrıca sentezlenebilir veya diğer satıcılar aracılığıyla satın alınabilir. Farklı moleküler ağırlıklar kullanılabilir.
Lityum Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP)			Laboratuvarda sentezlenen
Fibronektin	Corning	356008	gibi diğer hücre bağlanma proteinleri kullanılabilir
	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	Yüksek çözünürlüklü DPI ile şeffaf sayfalara özel baskılar.
Bağlayıcı Klipsler			Çeşitli Satıcılar
Kompakt UV Işık Kaynağı (365nm)	UVP	UVP-21	Diğer UV ışık kaynakları kullanılabilir, güç kalibrasyonu gereklidir.
2-iminotiolan (Pierce Traut ' s Reaktifi)	Thermo Sci.	26101
Ellman' s Reaktifi: DTNB; 5,5-ditio-bis (2-nitrobenzoik asit)	Thermo Sci.	22582
insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler)	Lonza		geçiş sayısı 6- 10 arasında
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 büyüme faktörü olmayan deneylerde kullanılmıştır. Hücre bakımı için tam EGM-2 ortamı kullanıldı
%0.25 Tripsin EDTA	Life Tech	25200-056
Tripsin Nötrleştirici	Life Tech	R-002-100
Santrifüj	Çeşitli Venders
Hemositometre	Hausser Sci. Parlak çizgi
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0.22 ve mikro; m filtre	Hücre Tedavisi	229743
1 mL Şırınga
Cam Mikroskop Slaytlar	Fisher Sci.	12-550C
Plastik ara parçalar	Çeşitli Satıcılar		0.5mm kalınlık
% 70 Etanol	BICCA	2546.70-1
Biyo-kalkan	Biyo-kalkan	19-150-0010
Bradford Reaktifi	BIO-RAD
Tuz Giderici Reçine - Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Microspin Kolonlar	Thermo Sci.
AR-G2 rehometer	TA Instruments