Mevcut Yöntem birden çok yüzeylerde UHPLC-MS analizi tarafından Histon uyku (HDAC) HeLa hücreleri izoformu özgü inhibitörleri tanımlanmasını sağlar. Bu yaşam HDAC1 ve HDAC6 etkinliği yansıtmak üzere geliştirilen bir antikor-Alerjik yöntemdir tek-izoformu boş hücre deneyleri aksine hücre çevre.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Eş zamanlı ölçüm HDAC1 ve HDAC6 faaliyete HeLa hücreleri kullanarak UHPLC-MS
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Yeni Histon deacetylase (HDAC) inhibitörleri ilaç keşif ilgi artan bir arayıştır. İzoformu seçicilik romidepsin, bir sınıf onay beri spot oldu ben HDAC inhibitörü kanser tedavisi ve HDAC6 özgü yavaşlatıcılar, Multipl Miyelom için klinik incelenmesi için. Mevcut yöntemi HDAC1 ve HDAC6 hücrelerde test bileşikler inhibitör etkinliğini belirlemek için kullanılır. İzoformu etkinlik ultra yüksek performanslı sıvı Kromatografi-Kütle spektrometresi (UHPLC-MS) analizi belirli yüzeylerde tedavi ve tedavi edilmezse HeLa hücreleri ile inkübe ölçülür. Yöntem boş hücre biyokimyasal testleri izole izoformlarının üzerinde yürütülen aksine hücre ortamında endojen HDAC etkinliği yansıtan bir avantaja sahiptir. Ayrıca, sentetik yüzeylerde miktar üzerinde temel aldığından, yöntem antikor tanıma endojen acetylated proteinlerin gerektirmez. Birden fazla hücre satır ve otomatik bir işlemin kolayca uyarlanabilir. Yöntem zaten neuroblasts içinde HDAC6-seçici bileşikler bulmada faydalı olmuştur. Temsilcisi sonuçları are göstermek burada standart HDAC inhibitörleri trichostatin ile bir (non-spesifik), MS275 (HDAC1 özel) ve tubastatin (HDAC6 özel) kullanarak HeLa hücreleri.
Giriş
HDACs enzim Histon Kromatin yapısı içinde deacetylate mümkün bir aileye ait. Onlar da diğer protein yüzeylerde sitozol içinde ve çeşitli hücre bölmeleri içinde bulunurlar. 18 HDAC izoformlarının toplam defa tespit edilmiştir ve transkripsiyon faktörleri ve gen ifadesinin yanı sıra hücre sinyallemesi düzenlenmesi de dahil olmak üzere birkaç hücre mekanizmaları ile ilgili ve1,2,3,4,5,6,7taşıma. HDAC katalitik inhibitörleri kanser tedavisi i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hücre kültürü
Not: Standart doku kültürü mahallede aşağıdaki adımlar gerçekleştirilir. Steril tekniği ile aşinalık bekleniyor.
- HeLa hücreleri için %80 confluency % 10 fetal sığır serum, penisilin G takıma MEM bir T75 hücre kültür şişesi içinde kültür (100 U/mL) ve streptomisin (100 mg/mL).
Not: Hücre kültürü, tedavi ve lizis adımları %5 CO2 steril koşullarda oksijen bir ortamda gerçekleştirilen 37 ° C'de hücre kuluçka adımlarla laminar akış altında yapılmaktadır. - 5 mL DPBS de iki kez hücrelerle yıkama, DPBS Aspire edin ve hücre ayrılma reaktif 1 mL ekleyin. Hücreleri ayırmak 5 min için 37 ° C'de kuluçk....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Non-selektif ve selektif inhibitörü HDAC1 için tanımlayıcı uygulamanın yönteminin göstermek için (sınıf ı) ve HDAC6 (sınıf IIB), HeLa hücreleri bilinen standart bileşenleri ile tedavi: trichostatin A (non-selektif HDAC1 ve HDAC6 arasında)18, MS275 (HDAC1-selektif inhibitörü)19ve tubastatin (HDAC6-selektif inhibitörü)20. Mevcut yöntem (şekil 1) kullanarak, ŞA50 değerleri doğruda.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
HDAC inhibisyon geçerli odaklı bir kanser tedavisi21HDAC6-selektif inhibitörü ilaç keşif sıcak bir konudur. HDAC seçicilik genellikle bireysel HDAC izoformlarının21doğru inhibitör etki gücüne belirlemek niyetinde yüksek üretilen iş, boş hücre deneyleri bir dizi tarafından değerlendirilir. Ancak, bir inhibitörü selectivity ayrıca canlı hücrelerde Histon gibi endojen protein yüzeylerde asetilasyon durumunu değerlendirerek onaylandığı takdirde (için sınıf ı HDACs) ve tübülin (.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar maliyet eylem CM1406 kabul (epigenetik Kimya Biyoloji). Bu yayında bildirilen araştırma Pierre Mercier Vakfı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Eşanlamlı: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Asetonitril, HPLC sınıfı | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formik asit, LC / MS sınıfı | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H < sub > 2 < / sub >O, HPLC sınıfı | damıtılmış H < sub > 2 < / sub >O Mili-Q saflaştırma sistemi | ||
| HeLa hücreleri | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Hücre ayrışması reaktif TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, hücre kültürü sınıfı | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal sığır serumu | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penisilin-Streptomisin | Biyokonsepti | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA tamponu | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast proteaz inhibitör tabletleri | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96 oyuklu plakalar, steril, düz dipli, doku kültürü ile muamele edilmiş Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96 oyuklu plakalar, steril olmayan, V tabanlı Santrifüjleme | aşamasında kullanılan | VWR | 29442-404 |
| 96 oyuklu plaka, konik tabanlı, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | Acquity UHPLC sistemi ile uyumlu |
| T75 hücre kültürü şişeleri Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Soyulabilir ısı yalıtım folyosu | Sular | 186002789 | |
| Acquity UPLC sistemi | Sular | ||
| Eppendorf Santrifüj 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Entegrasyon yazılımı: MassLynx V4.1 | Waters | Katalog numarası mevcut değil | |
| Kombi termo mühürleyici SP-0669/240 | Waters | Katalog numarası mevcut değil | |
| Quattro micro API Tandem Dört Kutuplu Sistem | Suları | Katalog numarası mevcut değil |
Kaynaklar
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
