Yöntem makalesi

Eş zamanlı ölçüm HDAC1 ve HDAC6 faaliyete HeLa hücreleri kullanarak UHPLC-MS

DOI:

10.3791/55878

⸱

10 Ağustos 2017

 ,  ,  , 
1Section des Sciences Pharmaceutiques, Universités des Geneva–Lausanne (EPGL)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut Yöntem birden çok yüzeylerde UHPLC-MS analizi tarafından Histon uyku (HDAC) HeLa hücreleri izoformu özgü inhibitörleri tanımlanmasını sağlar. Bu yaşam HDAC1 ve HDAC6 etkinliği yansıtmak üzere geliştirilen bir antikor-Alerjik yöntemdir tek-izoformu boş hücre deneyleri aksine hücre çevre.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni Histon deacetylase (HDAC) inhibitörleri ilaç keşif ilgi artan bir arayıştır. İzoformu seçicilik romidepsin, bir sınıf onay beri spot oldu ben HDAC inhibitörü kanser tedavisi ve HDAC6 özgü yavaşlatıcılar, Multipl Miyelom için klinik incelenmesi için. Mevcut yöntemi HDAC1 ve HDAC6 hücrelerde test bileşikler inhibitör etkinliğini belirlemek için kullanılır. İzoformu etkinlik ultra yüksek performanslı sıvı Kromatografi-Kütle spektrometresi (UHPLC-MS) analizi belirli yüzeylerde tedavi ve tedavi edilmezse HeLa hücreleri ile inkübe ölçülür. Yöntem boş hücre biyokimyasal testleri izole izoformlarının üzerinde yürütülen aksine hücre ortamında endojen HDAC etkinliği yansıtan bir avantaja sahiptir. Ayrıca, sentetik yüzeylerde miktar üzerinde temel aldığından, yöntem antikor tanıma endojen acetylated proteinlerin gerektirmez. Birden fazla hücre satır ve otomatik bir işlemin kolayca uyarlanabilir. Yöntem zaten neuroblasts içinde HDAC6-seçici bileşikler bulmada faydalı olmuştur. Temsilcisi sonuçları are göstermek burada standart HDAC inhibitörleri trichostatin ile bir (non-spesifik), MS275 (HDAC1 özel) ve tubastatin (HDAC6 özel) kullanarak HeLa hücreleri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDACs enzim Histon Kromatin yapısı içinde deacetylate mümkün bir aileye ait. Onlar da diğer protein yüzeylerde sitozol içinde ve çeşitli hücre bölmeleri içinde bulunurlar. 18 HDAC izoformlarının toplam defa tespit edilmiştir ve transkripsiyon faktörleri ve gen ifadesinin yanı sıra hücre sinyallemesi düzenlenmesi de dahil olmak üzere birkaç hücre mekanizmaları ile ilgili ve1,2,3,4,5,6,7taşıma. HDAC katalitik inhibitörleri kanser tedavisi için potansiyel terapötik ilaç olarak ortaya çıkmıştır. Şu anda FDA tarafından onaylanmış çoğu HDAC inhibitörleri T hücreli Lenfoma ve multiple Miyelom tedavisi için ve non-spesifik HDAC inhibitörleri, vorinostat (SAHA), belinostat ve panobinostat8,9gibi. Ancak, yan etkileri bir dizi pan-inhibitörleri ile ilişkili olmuştur ve izoformu özgü küçük moleküller için arama tıbbi kimya ve ilaç bulma gelen sıcak bir konudur. Buna göre sınıf ı (HDAC1-3 ve HDAC8) selektif inhibitörü romidepsin olduğunu bir onaylanmış durumdaki ilaç10, HDAC6 özgü inhibitörleri şu anda klinik çalışmalarda, Multipl Miyelom11,12,13,14,15artan tedavi potansiyele sahip altında iken.

Deneyleri HDAC karakterize etmek için eleme inhibitörleri (tek izoformu, nükleer özü veya hücre lysate) enzimatik kaynağı olan bir HDAC substrat kuluçka temel alır. Belgili tanımlık substrate genellikle N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16gibi bir yarilabilir fluorophore (Örneğin, coumarin) birleştiğinde bir asetil lizin kalıntı içeren bir küçük peptid sırası'dır. İzoformu özel etkinlikler arasında ayırt etmek için her izoformu içeren ayrı boş hücre deneyleri gerekli olan ve canlı hücreler gerçek izoformu etkinliğinde yansıtmıyor. İzoformu özel yüzeylerde Benzil gibi piyasada (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 belirli substrat) ve (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic asit tert-butil ester (BATCP, HDAC6 belirli substrat) (şekil 1B). Onlar aynı yarilabilir fluorophore ayı verilen bu ancak, MAL içeren bir çok substrat karışımı, MOCPAC ve canlı hücreler için verilen BATCP deacetylated ürünlerin tek tespiti Fluorometrik ölçüm tarafından izin vermeyeceğim.

Burada açıklanan yöntemi algılama ve her yüzey ve deacetylated ürün UHPLC-ESI-MS/MS analiz17tarafından takip bir çok maddeyi tahlil kullanarak HeLa hücreleri içinde göreli miktar olanak sağlar. Bir HDAC tahlil doğrudan kimlik HDAC inhibitör etkinliği ve özgüllük test bileşikler endojen HDACs etkinleştirmek için HeLa hücreleri üzerinde yapılan. HDAC1 ve HDAC6, aynı anda değerlendirilir bir odak vardır. Bir tek kuluçka tahlil enzimatik Bu ölçümlerde elde etmek için non-spesifik ve belirli HDAC yüzeylerde karışımı bir 96-şey plaka üzerinde kaplama tedavi ve tedavi edilmezse HeLa hücreleri eklenir. Bir kuluçka adım hücreleri yüzeylerde ve ayrılır ve bir UHPLC-MS (şekil 1 c) yöntemiyle tespit onların anılan sıraya göre tepki ürünler serbest bırakmak için lysed. MAL, MOCPAC ve BATCP yüzeylerde deacetylated ürünleri deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) ve deacetylated BATCP (dBATCP), sırasıyla vardır. Doz-yanıt eğrileri aktif bileşikler ile inşa edilebilir.

figure-introduction-1
Şekil 1: HDAC1 ve HDAC6 özel inhibitörleri birden çok yüzeylerde UHPLC-MS analizi tarafından tanımlamak hücre tabanlı HDAC tahlil için genel düzeni. Tipik 96-şey plaka tedavi (test bileşikleri) içeren bir(a)düzeni ve tedavi edilmezse (kontrol) HeLa hücreleri yanı sıra boş hücre boşlukları. (B) kimyasal yapısı yüzeylerde endojen HDACs tarafından deacetylated için bir karışım (21 her µM) eklendi. (C) eklenen yüzeylerde (MAL, MOCPAC ve BATCP) ve deacetylated ürünlerini doruklarına gösterilen tipik UHPLC-MS Kromatografik (dMAL, dMOCPAC ve dBACTP, sırasıyla). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre kültürü

Not: Standart doku kültürü mahallede aşağıdaki adımlar gerçekleştirilir. Steril tekniği ile aşinalık bekleniyor.















  3. figure-protocol-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Non-selektif ve selektif inhibitörü HDAC1 için tanımlayıcı uygulamanın yönteminin göstermek için (sınıf ı) ve HDAC6 (sınıf IIB), HeLa hücreleri bilinen standart bileşenleri ile tedavi: trichostatin A (non-selektif HDAC1 ve HDAC6 arasında)18, MS275 (HDAC1-selektif inhibitörü)19ve tubastatin (HDAC6-selektif inhibitörü)20. Mevcut yöntem (şekil 1) kullanarak, ŞA50 değerleri doğruda...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDAC inhibisyon geçerli odaklı bir kanser tedavisi21HDAC6-selektif inhibitörü ilaç keşif sıcak bir konudur. HDAC seçicilik genellikle bireysel HDAC izoformlarının21doğru inhibitör etki gücüne belirlemek niyetinde yüksek üretilen iş, boş hücre deneyleri bir dizi tarafından değerlendirilir. Ancak, bir inhibitörü selectivity ayrıca canlı hücrelerde Histon gibi endojen protein yüzeylerde asetilasyon durumunu değerlendirerek onaylandığı takdirde (için sınıf ı HDACs) ve tübülin (...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar maliyet eylem CM1406 kabul (epigenetik Kimya Biyoloji). Bu yayında bildirilen araştırma Pierre Mercier Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BATCPSigma-AldrichB4061
MALSigma-AldrichSCP0168Eşanlamlı: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPACSigma-AldrichM2195
MS275Sigma-AldrichEPS002
Trichostatin ASigma-AldrichT8552
Tubastatin ASigma-AldrichSML0044
Asetonitril, HPLC sınıfıFisher Scientific10660131
Formik asit, LC / MS sınıfıFisher Scientific10596814
H < sub > 2 < / sub >O, HPLC sınıfıdamıtılmış H < sub > 2 < / sub >O Mili-Q saflaştırma sistemi
HeLa hücreleriATCCATCC CRM-CCL-2
Hücre ayrışması reaktif TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013
DMSO, hücre kültürü sınıfıApplichem146463
DPBSThermoFisher Scientific14190144
Fetal sığır serumuBiowestS1810
MEMThermoFisher Scientific22561021
Penisilin-StreptomisinBiyokonsepti4-01F00-H
10x RIPA tamponuAbcamab156034
SigmaFast proteaz inhibitör tabletleriSigma-AldrichS8820
96 oyuklu plakalar, steril, düz dipli, doku kültürü ile muamele edilmiş CorningVWR29442-058
96 oyuklu plakalar, steril olmayan, V tabanlı Santrifüjlemeaşamasında kullanılanVWR29442-404
96 oyuklu plaka, konik tabanlı, NuncThermoFisher Scientific249944Acquity UHPLC sistemi ile uyumlu
T75 hücre kültürü şişeleri CorningSigma-AldrichCLS430641
Soyulabilir ısı yalıtım folyosuSular186002789
Acquity UPLC sistemiSular
Eppendorf Santrifüj 5810 RFisher Scientific05-413-323
Entegrasyon yazılımı: MassLynx V4.1WatersKatalog numarası mevcut değil
Kombi termo mühürleyici SP-0669/240WatersKatalog numarası mevcut değil
Quattro micro API Tandem Dört Kutuplu SistemSularıKatalog numarası mevcut değil
ile filtrelenmiş Corning

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
  2. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
  3. Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
  4. Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
  5. Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
  6. Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
  7. Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
  8. Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
  9. Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
  10. Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
  11. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211).
  12. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012).
  13. U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013).
  14. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015).
  15. Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
  16. Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935(2003).
  17. Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
  18. Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
  19. Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
  20. Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
  21. Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).
  22. Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
  23. Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
  24. Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
  25. Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
  26. Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , Wiley. (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

HDAC1 HDAC6 AktivitesiUHPLC MS AnaliziHDAC nhibit r Se icili iSubstrat Deasetilasyon EnsayesiH cre Lizis ProtokolTrichostatin A MS275Tubastatin A SpesifitesiMOCPAC BATCP Tespitila Ke fi Taramas

İlgili makaleler