Yöntem makalesi

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı

11K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55886

⸱

25 Temmuz 2017

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Ulm University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Özet

Uterus elektroporasyonu, gelişmekte olan fare embriyolarının serebral korteksindeki radyal göç sürecini incelemek için hızlı ve güçlü bir yaklaşımdır. Radyal göçün farklı adımlarını tarif etmede ve bu işlemi kontrol eden moleküler mekanizmaları karakterize etmede yardımcı oldu. Göç eden nöronları doğrudan ve dinamik olarak analiz etmek için zamanla izlenmesi gerekiyor. Bu protokol , utero elektroporasyon ile organotipik dilim kültürü ve radikal göç eden kortikal nöronların doğrudan muayene ve dinamik analizine imkan veren zaman atlamalı konfokal görüntüleme yöntemlerini bir araya getiren bir iş akışı tanımlamaktadır. Ayrıca, göç hızı, hız profili ve radyal yönlendirme değişiklikleri gibi göç eden nöronların ayrıntılı karakterizasyonu da mümkündür. Bu yöntem, kurtarma deneylerinin yanı sıra fonksiyon kaybı ve kazancı ile radyal olarak göç eden kortikal nöronlarda ilgi çekici genlerin işlevsel analizlerini gerçekleştirmek için kolayca adapte edilebilir. HızlandırılmışGöç eden nöronların görüntülenmesi, ortaya çıktıktan sonra, nöronal migrasyon bozukluklarının fare modellerinde serebral korteks gelişimini incelemek için etkili bir araç olan en gelişmiş tekniktir.

Giriş

Neokorteks bilişsel, duygusal ve sensorimotor işlevlerin başlıca sitesidir. Beynin yüzeyine paralel altı yatay tabakadan oluşur. Gelişme sırasında, dorsal telencefalonun yan duvarındaki progenitör hücreler, radyal olarak pial yüzeyine doğru göç eden ve katmana spesifik bir nöronal kimlik edinen projeksiyon nöronlarına neden olur. Ventriküler / subventriküler bölgelerde (VZ / SVZ) üretildikten sonra, bu nöronlar geçici olarak çok kutuplu olurlar ve göçlerini yavaşlatırlar. Orta bölgede (IZ) kısa bir süre kaldıktan sonra, iki kutuplu morfolojiye geçerler, radyal glial iskele üzerine bağlanırlar ve radyal olarak göç ederek korteks plakasına (CP) geçerler. Nihai hedef yansıtmalarına ulaştıklarında nöronlar radyal glial süreçlerden ayrılır ve katmana özgü kimlik kazanır. Nöronal migrasyonun farklı adımlarını etkileyen genlerdeki mutasyonlar, lissen gibi şiddetli kortikal malformasyona neden olabilirEfali veya beyaz cevher heterotopisi 1 , 2 .

Enerjide elektroporasyon, kemirgen embriyolarının 3 , 4 gelişmekte olan beyinde sinir öncü hücreleri transfekte etmek için hızlı ve güçlü bir tekniktir. Bu teknikle, nöronların geliştirilmesindeki işlevlerini incelemek için ilgilenilen genleri knockdown ve / veya aşırı ifade etmek mümkündür. Bu yöntem özellikle morfolojik ayrıntıların tanımlanmasına ve radyal göç sürecinin moleküler mekanizmalarının karakterize edilmesine yardımcı olmuştur ( 5 , 6 , 7 , 8 , 9) . Radyal olarak göç eden nöronlar, hücre şekli, göç hızı ve göç yönü gibi zaman içerisinde doğrudan ve sürekli gözlem gerektiren dinamik değişiklikler yaparlar. Organotipik dilim kültürüElektroporasyona uğramış beyinlerin tekrar ve zaman atlamalı konfokal görüntülemesi zaman içinde göç eden nöronları doğrudan gözlemlemesine izin verir. Bu kombine yaklaşımı kullanarak, elektroporasyona uğramış beyinlerin sabit doku kesitlerinde araştırılamayan göç eden nöronların farklı özelliklerini analiz etmek mümkündür.

Geçenlerde kortikal gelişim 10 sırasında transkripsiyon faktörü B hücreli KLL / lenfoma 11a (Bcl11a) rolünü incelemek için Electroporated beyinlerinin dilim kültürlerde nöronları göç zaman atlamalı konfokal görüntüleme uyguladı. Bcl11a, genç göç eden kortikal nöronlarda eksprese edilir ve fonksiyonlarını incelemek için bir koşullu mutant Bcl11a aleli ( Bcl11a flox ) 11 kullanılır . Bcl11a flox / flox beyinlerinin kortikal progenitörlerine Cre optik proteini (GFP) ile birlikte Cre rekombinazın elektroporasyonu, sadece birkaç hücrenin bir mutasyona uğramış olduğu bir mozaik mutant durum yaratmamızı sağladı.Aksi takdirde vahşi tipli arka plan. Bcl11a'nın hücre özerk işlevlerini tek hücre düzeyinde incelemek bu şekilde mümkündü. Bcl11a mutant nöronlarının, hız profillerinde düşük hız, kaymalar ve ayrıca göç sırasında rasgele benzeri oryantasyon değişiklikleri sergilediğini bulduk 10 . Anlatılan protokolde, fare beyinlerinin başarılı elektroporasyon ve dilim kültür hazırlığı 12 için bir iş akışı ve kortikal dilim kültürlerinin zaman kazanım konfokal görüntülemesi açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Hayvan Refahı Komitesi (Regierungspräsidium Tübingen) tarafından onaylanmış ve Alman Hayvan Refahı Yasası ve 2010/63 / AB AB Direktifi uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. Utero Elektroporasyonunda

  1. Mikroenjeksiyon iğneleri
    1. Kutu filamentli (2.5 mm x 2.5 mm) bir mikropipet çekici ve aşağıdaki program ile borosilikat cam kapillerleri (dış çap: 1.0 mm, iç çap: 0.58 mm, uzunluk: 100 mm) çekerek mikroenjeksiyon iğnelerine yerleştirin. HEAT: 540, PULL : 125, YÜKSEKLİK: 20 ve GECİKMELER: 140. Bir RAMP testi (HEAT değeri: RAMP + 25) uygulayarak her bir filaman için HEAT değerini belirleyin.
    2. Böcek iğneleri, embriyonik güne (E) 13.5 veya daha genç ve 30 ila 40 μm arasında enjekte etmek için 20 ila 30 μm'lik bir uç boyutu elde etmek için mikro gözle 38 ° 'lik bir açıda ve orta devir hızına orta eğri doğum yaparken enjekte etmek içinevreleri. Depolama için ipuçlarına zarar vermemek için iğneleri modelleme kili bulunan bir kutuya veya petri kabında düzeltin.
  2. Plazmid DNA Çözeltisi
    1. Üreticinin talimatlarına göre bir endotoksin içermeyen maxi hazırlama kiti kullanarak flüoresan raportör proteini ( örn., GFP) içeren plasmid DNA yapısını hazırlayın.
    2. % 0.01'lik bir nihai konsantrasyonda Hızlı Yeşil içeren endotoksin içermeyen Tris-EDTA tamponu içinde plazmid DNA solüsyonunu 1 - 2 μg / μL son konsantrasyona kadar inceltin. Çözelti çözeltisi ve -20 ° C'de saklayın.
  3. Bakteriostatik Sodyum Klorid Çözeltisi
    1. Bakteriyostatik sodyum klorür çözeltisini, izotonik% 0.9 sodyum klorür çözeltisine% 0.9'luk bir nihai konsantrasyona kadar benzil alkol ilave ederek hazırlayın. Kullanımdan hemen önce steril filtre çözeltisi.
  4. Carprofen Enjeksiyon Çözümü
    1. Karprofen enjeksiyon solüsyonunu,Steril izotonik% 0.9 sodyum klorür çözeltisine 0.5 mg / mL'lik nihai konsantrasyona karprofen eklenir. 28 güne kadar 4 ° C'de saklayın.
  5. Anestezi, DNA Enjeksiyonu ve Elektroporasyon
    1. Bir E14.5 zamanlanmış gebe farenin ağırlığına koyun ve bir buharlaştırıcıya bağlı şeffaf bir anestezi bölmesine yerleştirin ve% 5 izofluran ile doyurun. Hayvan bilinçsiz olduğunda, 37 ° C'lik bir ısıtma plakasına bağlı bir anestezi maskesine aktarın ve onu% 1.8 - 2.2 izofluran ile anestezi altında tutmaya devam edin.
      Not: Cerrahi anestezinin gelişimini kuyruk tutam ve pedal refleksleri kaybı ile değerlendirin (ayak parmağı çimdikleme).
    2. Analjezik için fare vücut ağırlığının her birine (5 mg / kg vücut ağırlığı) subkütan olarak 100 μL carprofen enjeksiyon solüsyonu enjekte edin. Fareyi aşağıya bakacak şekilde çevirin ve kurutmalarını önlemek için gözleri petrol jölesi ile dikkatle örtün.
    3. Kolları yavaşça yayıp düzeltinCerrahi bant ile ısıtma plakasına. Karnı% 70 etanol ile sterilize ettikten sonra selüloz svapları kullanarak iyot solüsyonu (7.5 mg / mL) sterilize edin. Bu işlemi uygun dezenfeksiyon için üç kez tekrarlayın.
    4. Karını karın kesisi için bir alan (çap: 2 - 2.5 cm) dışarı atmak için kesilmiş steril gazlı bezle kapatın. Gazlı bezleri bakteriostatik sodyum klorür çözeltisi ile nemlendirin.
      Dikkat: Pedal refleksi kaybıyla cerrahi anestezinin gelişimini tekrar gözden geçirin.
    5. Mikro Adson Forseps (tırtıklı, uzunluk: 12 cm) ve ince makas (yana eğik, 9 cm uzunluğunda), karın orta hat boyunca cildi yaklaşık 1.5 cm keser. Linea alba boyunca alttaki kasları kesin.
    6. Ring forsepsiyle (uzunluk: 9 cm, dış çap: 3 mm, iç çap: 2,2 mm) bir rahim boynuzunu çıkarın ve hafifçe nemlendirilmiş gazlı bezin üzerine yerleştirin.
      Dikkat: Uterus boynuzunu halka forsepsiyle sadece embriyoların arasında vePlasentaları veya herhangi bir besleme gemisini rahatsız etmeyin. Uterusu bakteriostatik sodyum klorür çözeltisi ile her zaman nemli tutun.
    7. Yüzük forsepsiyle dikkatli bir şekilde bir embriyo yerleştirin ve sagital sinüse paralel hilal şeklinde bir gölge oluşturan yanal ventrikülün yerini tespit edin. Enjeksiyon bölgesi, pigmentli göz ile sinüslerin birleştiği nokta arasındaki hattın ortasında bulunur ve burada sagital sinüs iki transvers sinüse dallar. Mikroenjeksiyon iğnesini uterus duvarından ve lateral ventriküle itin.
      Not: Gerekirse, iğnenin geri çekilmesi ile enjeksiyon derinliği düzeltilebilir.
    8. Aşağıdaki ayarlar kullanılarak, bir ayak pedalıyla çalıştırılan bir mikroenjektör ile lateral ventriküle 1 ila 2 μL DNA solüsyonu enjekte edin: 25 psi, puls başına 10 ila 20 ms ve 5 ila 10 darbe. Başarılı enjeksiyon, ventriküler sistemi doldurması gereken renkli DNA çözeltisi ile izlenebilir.
    9. 'Pozitif' terminalin enjekte edilen ventrikül ile aynı tarafta olacağı şekilde cımbız tipi elektrotları (E13.5 veya daha küçük ve 3 mm çaplı, E14.5 veya daha eski için 5 mm çaplı) yerleştirin ve 'negatif' Terminal embriyonun başının altındaki enjekte edilen ventrikülün karşı tarafındadır.
    10. Elektroporasyon yerini bir kaç damla bakteriyostatik sodyum klorür çözeltisi ile nemlendirin ve 950 ms aralıklarla 50 ms zaman aralığında 5 elektrik akımı darbesi uygulayın (E13.5 veya daha genç için 35 V, E14.5 veya daha eski için 40 V).
      Not: 60 ila 90 mA akımları, başarılı elektroporasyon için genellikle yeterlidir. Daha düşük akımlar, nöronları etkili bir şekilde transekte etmezken, daha yüksek akımlar embriyonik ölümü sağlayabilir.
    11. Uterus boynuzunun her embriyo prosedürünü tekrarlayın (Adım 1.5.7. Ila 1.5.10 arası.) Ve hafifçe karın boşluğuna yerleştirin.
    12. Uterus boynunu diğer taraftan çıkarın ve işlemi tekrarlayınAdım 1.5.7'de anlatılan derinlik. 1.5.11'e.
    13. Mikro Adson Forceps, Mathieu İğne Tutucu (tungsten karpit, uzunluk: 14 cm) ve emilebilir olmayan cerrahi sütür (3/8 daire, 13 mm, koniklik noktası) kullanarak deriyi sütüre etmeden önce kas tabakasını sütüre ederek karın boşluğunu kapatın.
      Dikkat: Dikiş sırasında uterus veya başka organları tutmamaya özen gösterin.
    14. İyot çözeltisi (7.5 mg / mL) ile dikkatli bir şekilde cilt dikişini dezenfekte edin ve selüloz svapları kullanarak perioküler fazlalık petrol jölesini hafifçe çıkarın. Uyanana kadar fare kızılötesi bir lambanın altına koyun. Önümüzdeki iki gün boyunca fareyi yakından izleyin. 12 ila 24 saat sonra Adım 1.5.2'de açıklandığı gibi analjezi tedavisini tekrarlayın.

2. Organotipik Dilim Kültürü

  1. Laminin Stok Çözümü
    1. 1 mg / mL laminin stok solüsyonu elde etmek için 1 mg liyofilize laminin steril suda eritilir. 50 mcL alikotları a hazırlayın-80 ° C'de saklayın.
  2. Poli-L-Lizin Stok Çözeltisi
    1. 1 mg / mL poli-L-lisin stok solüsyonu elde etmek için 50 mg poli-L-lisin steril suda eritilir. 0.5 mL alikotları hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
  3. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini Tamamlayın (Komple HBSS)
    1. 50 mL 10x HBSS solüsyonu, 1.25 mL 1 M HEPES tamponu (pH 7.4), 15 mL 1 M D-glikoz solüsyonu, 5 mL 100 mM kalsiyum klorür solüsyonu, 5 mL 100 mM magnezyum sülfat Çözeltisi ve 2 mL 1 M sodyum hidrojen karbonat çözeltisi ilave edildi. 0,5 L steril su ekleyin, steril filtre ve 4 ° C'de saklayın.
  4. Dilim Kültür Ortamı
    1. 35 mL Bazal Orta Kartal (BME), 12.9 mL tamamlanmış HBSS (bölüm 2.3.1'e bakın), 1.35 mL 1 M D-glikoz, 0.25 mL 200 mM L-glutamin ve 0.5 mL penisilin-streptomisin'i birleştirin. 50 mL dilim kültürü elde edinorta. Steril filtre ve son konsantrasyonu% 5 olan at serumu ekleyin. 4 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
  5. Düşük Erime Noktası (LMP) Agaroz Çözeltisi
    1. 1,5 g LMP agarozun 50 mL tamamlanmış HBSS'ye bir mikrodalga fırında 1 ila 2 dakika boyunca orta güçte ısıtılarak eritilerek% 3 LMP agaroz solüsyonu hazırlayın.
      Not: Kaynatmada taşmayı önlemek için ısıyı dikkatle izleyin.
    2. Çözelti, kullanıma hazır olana kadar 38 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. 4 ° C'de saklayın ve bir kez tekrar kullanın.
  6. Membran Ek Parçalarının Kaplanması
    1. Kaplama çözeltisi elde etmek için (6 ekleme için yeterli) 6 mL steril suya bir kısım laminin stok solüsyonu (Adım 2.1.1 cf) ve bir kısım poli-L-lizin stok solüsyonu (c adım 2.2.1.) Ilave edin. .
    2. Her bir kuyunun tabanında 2 mL steril su ihtiva eden bir 6 oyuklu plaka içine zar insertleri yerleştirin. 1 mL kaplama solüsyonu ilave edin(Basamak 2.6.1), gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 karbondioksit atmosferi altında inkübe edin.
      Not: Sadece polietilen-flüoroetilen (PTFE) membran gibi optik olarak temiz membranlara sahip ara parçaları kullanın.
    3. Membranları üç kez 1 mL steril su ile yıkayın ve kurutun. Aynı gün kaplamalı zarları kullanın ya da 4 haftada 4 ° C'de temiz 6 gözlü bir plakta saklayın.
  7. Beyin Diseksiyonu ve Gömme
    1. Elektroporasyondan iki gün sonra fareyi, bir buharlaştırıcıya bağlı şeffaf bir odaya yerleştirin ve% 5 izofluranla doyurun. Hayvan bilinçsiz olduğunda odadan çıkarın ve servikal dislokasyon ile kurban edin.
    2. Embriyoları içeren uterus çıkarın ve buz soğukluğu tam HBSS ile 10 cm Petri kabına yerleştirin.
      Not: Bundan sonra tüm çözümleri, embriyoları ve beyinleri buzda tutun.
    3. Bir stereomikroskop, ince uçlu forseps kullanın (düz,11 cm) ve bir çift Vannas Tübingen Bahar Makası (açılı, uzunluk: 9.5 cm) her bir embriyonu rahimden ayırmak ve onu buz gibi soğuk HBSS içeren bir başka petri kabına aktarmak için kullanınız.
    4. Beyin sapı seviyesinde bir kesi yapın ve sagital orta hat boyunca kesim yapın. Beyni kapsayan deriyi ve kıkırdakı soyun. Daha sonra, hemisferlerin hemen arkasındaki beyin sapını kesin ve beyin kafatasından çıkarın. Beyni bir mikro-kaşık spatula (185 mm x 5 mm) ile buz gibi soğuk HBSS içeren 12 plaka ile aktarın. 12 gözlü plakadaki çöplerden tüm beyinleri toplayın.
    5. Floresan parlaklık ve elektroporasyon yapılan bölgenin büyüklüğü için 12-yuvalı plakadaki beyinleri taramak için bir flüoresan stereomikroskop kullanın. Daha ileri işlem için varsayımsal somatosensoryal kortekste parlak flüoresan sinyalleriyle 2 ila 4 beyin seçin.
    6. 38 ° C'de tutulan% 3 LMP agaroz çözeltisini soyulmuş tek kullanımlık gömme kalıbına dökün. removE beyin 12 kuyucuklu bir plaka ile bir mikro kaşık spatula ile dikkatle ve ince doku kağıdı kullanarak beynin etrafında aşırı HBSS eksiksiz tahliye.
    7. Beyni agaroz çözeltisine yavaşça yerleştirin, kalıbın altına itin ve 20 derecelik bir iğne kullanarak pozisyonunu dikkatle ayarlayın. Koronal kesitler için, beyindeki koku alma ampulleri yukarı doğru bakacak şekilde yönlendirin. Agaroz çözeltisi katılaşıncaya kadar kalıp buzda tutun ve beynin kesilmesi ile devam edin.
  8. Vibrasyonlu Kesit ve Dilim Kültürü
    1. Agaroz bloğu kalıptan çıkarın ve steril bir petri kapının kapağının üzerine yerleştirin. Fazla agarozu, temiz bir tıraş bıçağı ile ayırın ve diğer taraftan olfaktor ampullerin yaklaşık 2 ila 3 mm altına ve 1 mm agaroz bırakın. Kıvrımlı agaroz bloğunu, koku alma ampulleri, siyanoakrilat tutkalı kullanarak bir örnek aşamasına doğru aşağı bakacak şekilde düzeltin.
      Not: Aletleri ve ekipmanları% 70 etano ile sterilize edinL bölümlemeden önce.
    2. Örnek aşamasını, buz gibi soğuk HBSS içeren titreşimli bıçak mikroskobu dilimleme odasına aktarın ve dorsal yüzü bıçağa doğru konumlandırın. Elektroporasyonlu bölgeyi içeren 250 μm kalınlığında beyin dilimlerini 0,9 mm'den düşük orta şiddette ve 0,09-0,12 mm / s'lik çok yavaş kesit hızı ile kesin. Genellikle başarılı bir şekilde elektroporasyona tabi tutulan beyinden parlak floresan sinyali olan 4-6 dilim elde edilir.
    3. Bükülmüş bir mikro-kaşık spatula ve ince uçlu forseps ile, beyin dilimlerini çevreleyen agaroz ile dikkatli bir şekilde buz gibi soğuk HBSS içeren 6 plakalı bir plakaya aktarın.
      Dikkat: Aktarım sırasında forsepsle sadece bölümlerin çevresindeki agaroz jantlara dokunarak beyin dokusuna zarar vermemek için dikkatli olun.
    4. Seçilen tüm beyinleri Adım 2.8.1'de açıklandığı gibi işleyin. 2.8.3'e.
    5. Beyin yerleştirmeden önce 100 μL komple HBSS ile membran eklentilerini nemlendirin.Dilimleri konumlandırmayı kolaylaştırmak için membranlara yapıştırın. 1 membranlı parçaya en fazla 5 dilim yerleştirilebilir.
    6. Dilimleri, eğilmiş bir mikro-kaşık spatula ve ince uçlu forseps kullanarak membranlara dikkatlice aktarın. Agaroz jantına forseps ile hafifçe dokunarak spatula üzerine bir dilim yavaşça çekin ve dilimi spatula'dan zar üzerine hafifçe itin. Dilimi forseps kullanarak yerleştirin ve kalan dilimleri aktarmaya devam edin. Fazla komple HBSS'yi bir pipetle çıkarın.
      Not: Dilimleri birbiriyle örtüşmeyin.
    7. Forsepps yardımıyla dikkatlice dilim kültür ortamı (cf Adım 2.4.1.) 1.8 mL içeren bir 6-kuyucuklu plaka içine dilimler ile membran insert yerleştirin ve 37 ° C'de ve% 5 karbon dioksit atmosferi zaman geçene kadar inkübe edin. görüntüleme.

3. Zamanaşımı Görüntüleme

  1. Mikroskop Kurulumu
    1. Sahne alanına yerleştirilen bir iklim odası ayarlayın.Ters çevrilmiş konfokal mikroskop ile 37 ° C ve% 5 karbondioksit atmosferi. Lazer yoğunluğunu azaltmak ve hücre yaşayabilirliğini artırmak için hibrid bir dedektör kullanın. Ayrıntılı analiz için, 0,6 veya daha yüksek bir sayısal diyafram ile 40X ekstra uzun çalışma mesafesi kullanın.
      Not: Görüntüleme işlemi sırasında kararlı bir odak sağlamak için, mikroskopun tüm bileşenleri görüntülemeden önce 2-3 saat önceden 37 ° C'ye ısıtılmalıdır.
  2. Dilim Görüntüleme
    1. Ters çevrilmiş flüoresan mikroskop kullanılarak membran içeren 6 oyuklu plakadan görüntüleme için bir beyin dilimi seçin.
      Dikkat: Ultraviyole ışığa uzun süre maruz bırakılmamalıdır, çünkü bu durum hücresel fotodamerjere neden olabilir.
      Not: Üst SVZ'de parlak tek nöronlu, dilimin pial yüzeyine radyal olarak göç eden bir dilim seçin. Tüm CP'ye yayılmış radyal glial hücrelerin ince flüoresan işlemleri, sağlam bir radyal glial iskele gösteriyor ki bu daD radyal olarak göç eden kortikal nöronlarla.
    2. Forsep yardımı ile 2 ml dilim kültür ortamı içeren 50 mm çaplı bir cam tabağa çalkalamak için zaman atlamalı görüntüleme için seçilen dilim ile zar insertini aktarın. Konfokal mikroskopun iklim odasına tabak yerleştirin.
    3. Çözünürlüğü 512 piksel olarak 512 olarak ayarlayın ve tarama hızını 400 Hz'den 700 Hz'e yükseltin ve böylece kare hızını saniyede yaklaşık 1.4 ile 2.5 kare arasında artırın. En fazla iki kere ortalamayı kullanmayın. Elektroporasyonlu bölge boyunca (genellikle 400-100 μm) bir z-yığınını 1.5 μm'lik adım boyutuyla tanımlayın. Toplu olarak bu ayarlar, fotoğraf alımı sırasında fotodameri düşük tutarken görüntünün yeterli çözünürlüğünü ve parlaklığını sağlar. Her 30 dakikada bir z-yığını alarak zaman atlamalı seriyi başlatın.
      Not: Dilimin lazer ışığına uzun süre maruz kalması, fotodamarjı indükleyerek hücrelerin yaşayabilirliğini azaltacaktır. Exp ayarlayınBuna göre lazer ışığına vakit ayırın.
    4. ImageJ yazılımı (https://imagej.nih.gov/iij/) veya eşdeğeri kullanarak zaman atım serisini analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Daha önce, utero elektroporasyon ile Bcl11a'nın genetik silinmesinin, geç doğan üst katman projeksiyon nöronlarının radyal göçünü 10 engellediğini göstermiştik. Kre-IRES-GFP ihtiva eden bir DNA plazmid vektörü Elektroporasyon verimli flox / flox beyinleri 11 koşullu Bcl11a içinde Bcl11a silindi. Elektroporasyondan üç gün sonra E14.5 elektroporasyona uğramış beyinl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Radyal göç, neokorteks gelişiminde önemli bir süreçtir. Bu sürecin farklı adımlarını etkileyen genlerdeki mutasyonlar, lissensefali ve beyaz cevher heterotopisi gibi ağır kortikal malformasyonlara neden olabilir 1 , 2 . Geçtiğimiz günlerde genç göç eden kortikal projeksiyon nöronlarında ifade edilen Bcl11a'nın radyal göçte rol oynadığını gösterdik. Aktif nöronlarda Bcl11a'nın genetik olarak silinmesinin kutuplaşma ve migrasyon kusurları...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yararlı tartışmalar için Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka ve Matthias Toberer'a mükemmel teknik yardım ve Victor Tarabykin'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgamesinschaft'ın SB'ye (BR-2215) verilmesi ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
izofluranAbbott Laboratuvarları 506949Forene
6 oyuklu plakaCorning351146
12 oyuklu plakaCorning351143
emilmeyen cerrahi sütürEthiconK890H3/8 daire, 13 mm, konik nokta
Micro Adson ForsepsGüzel Bilim Araçları11018-12tırtıklı, uzunluk: 12 cm
ince makasGüzel Bilim Araçları14063-09yana açılı, uzunluk: 9 cm
Mathieu İğne TutucuGüzel Bilim Aletleri12510-14tungsten karbür, uzunluk: 14 cm
ince uçlu forsepsGüzel Bilim Aletleri11370-40düz, 11 cm
Vannas Tü bingen Bahar MakasıGüzel Bilim Araçları15005-08açılı, 9,5 cm
halka forsepsGüzel Bilim Araçları11103-09OD: 3 mm, ID, 2,2 mm, uzunluk: 9 cm
HBSS (10X)Gibco14180046
L-GlutaminGibco25030081
Penisilin/StreptomisinGibco15140122
at serumuGibco
BMEGibco41010026
borosilikat cam kılcal damarlarHarvard Aparatı30-00161.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anestezi sistemiHarvard Apparaus72-6471
anestezi odasıHarvard Apparaus34-0460
fluosorber filtre kabıHarvard Apparaus34-0415
düşük erime noktalı agarozInvitrogen16520100
titreşimli bıçak mikrotomuLeicaVT1200 S
floresan stereo mikroskopLeicaM205 FA
stereo mikroskopLeicaM125
ters floresan doku kültürü mikroskobuLeicaDM IL LED
konfokal lazer tarama mikroskobuLeicaTCS SP5II
hibrid dedektörLeicaHyD
objektif, 40x/0.60 NALeica11506201
mikroskobu sıcaklık kontrol sistemiYaşam Görüntüleme HizmetleriKüp, Tuğla & Kutu
hücre kültürü ekiMilliporePICM0RG50
mikro öğütücüNarishigeEG-45vermek için 38 ° C açı kullanır
;052-0500-900Picospritzer III
carprofenPfizer Hayvan SağlığıNDC 61106-8507Rimadil
emdedding kalıpPolysciences18986-1
endotoksin içermeyen plazmid maxi kitQiagen12362
hızlı yeşilSigmaF7252
lamininSigmaL2020
poli-L-lizinSigmaP5899
HEPESSigmaH4034
D-glikozSigmaG6152
kalsiyum klorürSigmaC7902
magnezyum sülfatSigmaM2643
sodyum bikarbonatSigmaS6297
kare dalga elektroporatörSonidelCUY21EDIT
5 mm platin disk elektrotlu cımbızSonidelCUY650P5
mikropipet çektirmeSutter EnstrümanıP-97
kutu filamentSutter AletiFB255B2,5 mm x 2,5 mm
mikro kaşık spatulaVWR231-0191185 mm x 5 mm
cam alt çanak, 50 mmDünya Hassas AletlerFD5040-100
26050088, mikro enjektör Parker Hannifin  eğim Serisi

Kaynaklar

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  5. LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
  6. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  8. Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
  9. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
  10. Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
  11. John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9(2002).
  13. Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
  14. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518(2014).
  15. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
  16. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  17. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  18. Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
  19. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
  20. Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
  21. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).
  22. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
  23. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Radyal N ron GKortikal N ron PolarizasyonuNeokorteks Geli imiG H z AnaliziSapma A s l mFloresan Stereomikroskopi

İlgili makaleler