Method Article

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

DOI:

10.3791/55910

⸱

June 10th, 2017

 ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry, Beijing Forestry University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bitki hücre duvarlarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozun Raman görüntüleme ve çok değişkenli analizi kullanılarak görselleştirilmesi için genel bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Raman görüntüsünün bitki biyokütle uygulamasına uygulanması, sulu çözeltiler üzerinde mekansal ve kompozisyonsal bilgi sunabileceği için artmaktadır. Analiz, genellikle kapsamlı numune hazırlığı gerektirmez; Yapısal ve kimyasal bilgiler etiketsiz olarak elde edilebilir. Bununla birlikte, her Raman görüntüsü binlerce spektrum içermektedir; Gizli bilgileri ayıklarken, özellikle de benzer kimyasal yapıya sahip bileşenler için güçlükler doğar. Bu çalışma, bu sorunu çözmek için çok değişkenli bir analizi ortaya koymaktadır. Protokol, bitki hücre duvarı içerisindeki lignin, selüloz ve hemiselüloz dahil olmak üzere ana bileşenleri görselleştirmek için genel bir yöntem oluşturmaktadır. Bu protokolde, numune hazırlama, spektral edinme ve veri işleme prosedürleri anlatılmıştır. Numune hazırlama ve veri analizinde operatör becerisine oldukça bağımlıdır. Bu yaklaşımı kullanarak, uzman olmayan bir kullanıcı tarafından bir Raman araştırması yapılabilir.H kalite verisi ve bitki hücre duvar analizi için anlamlı sonuçlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki biyokütlesi, Dünya'daki en bol yenilenebilir kaynaktır; esas olarak lignin, selüloz ve hemiselülozdan oluşur; ve çekici bir biyoenerji ve biyo-bazlı kimyasal kaynağı olarak kabul edilir1. Ne yazık ki, bozulmaya direnebilir ve bitki hücre duvarına hidrolitik stabilite veya yapısal sağlamlık kazandırabilir. Bu tür bir direnç, erişilebilir yüzey alanına, biyokütle partikül boyutuna, polimerizasyon derecesine, selüloz kristalliğine ve koruyucu lignin2'ye atfedilebilir. Bu nedenle, bitki hücre duvarının yapısal ve kimyasal doğasının kapsamlı bir şekilde anlaşılması, bitki biyolojisi ve kimyası açısından olduğu kadar ticari kullanım açısından da önemlidir. Kromatografi, kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi gibi yaygın olarak kullanılan ıslak kimya analizleri, yalnızca ölçülen numunenin ortalama bileşim verilerini sağlar. Ayrıca, bu yöntemler invazivdir ve bitki dokusunun orijinal yapısını tahrip eder3.

Raman görüntüleme tekniği, uzamsal olarak çözülmüş kimyasal bilgilerin tahribatsız görselleştirilmesi için güçlü bir araçtır4. Bir fotonla esnek olmayan saçılmaya neden olmak için bir lazer ışığı kullanır ve moleküler titreşimlerden kaynaklanan polarize edilebilirlikteki değişikliklere dayanır. Bu durumda, su zayıf Raman saçılımına neden olur, bu da bu yaklaşımı biyolojik örneklerin yerinde incelemeleri için uygun hale getirir5. Raman görüntüleme tekniğinin bitki hücre duvarına uygulanması, tek hücre ve hatta hücre duvarı katmanları ölçeğindeki çözünürlükle bitki hücre duvarlarının yapısını ve bileşimini doğal hallerinde açıklığa kavuşturabilir6. Bir bitki hücre duvarının tipik bir Raman görüntüleme analizi genellikle üç adımdan oluşur: 1) numune hazırlama, 2) spektral toplama ve 3) veri işleme.

Raman görüntülemenin en büyük avantajlarından biri, minimum numune hazırlığı ile etiketsiz ve tahribatsız spektrumlar elde etme yeteneği olsa da, ilgilenilen yüzeyi ortaya çıkarmak için fiziksel numune kesitleme hala gereklidir. Teknik, optik focus7'nin korunmasına bağlı olduğundan, düz bir yüzey elde etmek için bu işlem dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Spektral alım, görüntü kalitesi ve kapsamlı alım süreleri arasında bir denge gerektirir8. Veri işleme, özellikle selüloz ve hemiselüloz gibi benzer kimyasal yapılara sahip bileşenler için görüntü verilerinden kimyasal bilgileri etkili bir şekilde çıkarmayı amaçlar. Güçlü spektral örtüşme nedeniyle, kesin spektrumları ayırt etmek zordur. Bu durumda, çok değişkenli analiz, saklanan yapısal ve kimyasal bilgileri etkili bir şekilde ortaya çıkarmak için basit bir yaklaşımdır9. Bu çalışma, lignin, selüloz ve hemiselüloz dahil olmak üzere bitki hücre duvarlarındaki ana bileşenleri görselleştirmek için Raman görüntülemenin kullanımını açıklayan genel bir protokol sunmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Numune Hazırlama

  1. Bitki örneğinden küçük bir doku bloğu (yaklaşık 3 mm x 3 mm x 5 mm) kesin ( örn. Kavak kökü).
  2. Dokuyu 30 dakika kaynar deiyonize suya daldırın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca hemen deiyonize suya aktarın. Doku, kabın altına sızana kadar bu adımı tekrarlayın; dokudaki havanın alınmış olduğunu ve dokunun yumuşadığını belirtin.
    Not: Bu adımdan önce altına batan numuneler için, genellikle bu döngüyü 3-5 kez tekrarlayın.
  3. Deiyonize suyun içindeki 20, 50, 70, 90% (h / h) miktarlardaki polietilen glikol (PEG) ve saf PEG'yi hazırlayın ve solüsyonları 65 ° C'de tutun.
  4. Suyu, yerinden çıkartmak ve PEG'nin sızmasına izin vermek için, dokuyu bir dizi dereceli PEG banyosunda inkübe edin.
    Not: Genellikle, molekül ağırlığı 2,000 olan (PEG2000) PEG, gömme için kullanılır.
    1. Doku g ile işleyin(A) 1 saat boyunca% 20 PEG, (b) 1.5 saat boyunca% 50 PEG, (c) 2 saat boyunca% 70 PEG, (d) 2 saat boyunca% 90 PEG, ve (E)% 10 PEG ile 10 saat.
  5. Kaseti 65 ° C'de fırında önceden ısıtın. Bloğu içeren PEG'yi kasete dökün ve daha sonra önceden ısıtılmış cımbız veya iğne kullanarak doku bloğunu istenen bir yere yerleştirin.
  6. Kaseti yavaşça soğutun ve doku kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.
  7. Keskin bir tıraş bıçağı kullanarak küçük bir blok (yaklaşık 1 cm x 1 cm x 2 cm) içine hedef doku içeren PEG bloğu parçalayın ve mikrotom üzerine monte edin.
  8. PEG bloğundan ince kesitleri kesin (tipik olarak 3-10 μm).
  9. PEG'yi dokudan çıkartmak için, bölmeyi deiyonize su ile bir saat camında 10 kez durulayın.
  10. Ekstraktları çıkarmak için bölümleri toluen / etanol (2: 1, v / v) ile 6 saat bekletin. 65 mL deiyonize su, 0.5 mL asetik asit ve 0.6 g sodyum klorür karıştırılarak reaksiyon sıvısı hazırlanır.Bir kapta ritüel edin. 5 mL şişeye bir bölüm ve 3 mL reaksiyon sıvısı ekleyin. Şişenin üst kısmını vidalayın.
  11. Dokunun lignini çıkarmak için şişeyi 75 ° C'de 2 saat boyunca su banyosunda ısıtın. Parçayı deiyonize su ile 10 kez saat camında yıkayın.
  12. İşlenmemiş / tasfiye edilmemiş bölümü cam mikroskop lamı üzerine aktarın. Fırçaları veya iğneleri kullanarak bölümü dikkatle açın. Ekstra deiyonize suyu kağıttan kağıtla çıkarın.
  13. Kesiti D 2 O içine sokun. Numuneyi bir cam kapak folyosuyla örtün. D2O'nun buharlaşmasını önlemek için kapak kağıdını oje ile mühürle.

2. Spektral Edinme

  1. Konfokal Raman mikroskopunun cihaz çalıştırma yazılımını açın. Lazeri açın (dalga boyu = 532 nm), 100X mikroskop objektifli kristal silisyumun yüzeyine odaklayın ve cihazı kalibre etmek için kalibrasyon düğmesine tıklayın.
  2. Aleti değiştirOptik mikroskop moduna geçirin ve mikroskop lambasını açın. Mikroskop lamı, objektife bakacak şekilde kapak kaymasıyla birlikte sahneye monte edin.
  3. 20X mikroskop objektifle örneği inceleyin ve ilgi alanını bulun. Lamel içine daldırma yağı uygulayın ve daldırmalı mikroskop objektif (60X, sayısal diyafram NA = 1.35) geçiş yapın. Numunenin yüzeyine odaklanın.
  4. Cihazı, Raman test moduna getirin ve mikroskop lambasını kapatın.
  5. Dikdörtgen bir araç kullanarak bir haritalama alanı seçin. Elde edilen spektrumların sayısını belirlemek için adım boyutunu değiştirin.
    Not: Adım boyutunun farkında olun (genellikle objektifin sayısal diyaframı ile hesaplanan spot çapından daha büyük, teorik olarak 1.22λ / NA). Bunun altındaki boyutlar aşırı örneklemeye neden olur.
  6. Uygun bir edinim zamanında (genellikle <8 saat) en iyi sinyal-gürültü oranı (SNR) ve spektral kaliteyi elde etmek için optimum spektral parametreleri ayarlayın, depeNumunenin uygunluğuna değinerek. Genellikle, görüntüleme parametrelerini cihaz yazılımında aşağıdaki gibi girin: lazer (532 nm), filtre (100%), delik (300), yarık (100), spektrometre (1,840 cm -1 ), oluklar (1200 t), objektif 60X yağ) ve edinme süresi (2 s).
  7. Veri işleme öncesinde spektral verileri saklayın ve evrensel bir biçime ( ör. TXT dosyaları) dönüştürün.

3. Veri Analizi

  1. Spektral verileri (TXT dosyaları) veri analizi yazılımına yükleyin ( örn., Matlab). SNR'yi iyileştirmek için veri kümesindeki bir gürültü azaltma tekniği uygulayın ( örneğin, Savitzsky-Golay algoritması veya dalgacık algoritması)
  2. Lignin ve polisakarit görüntüleri üretmek için işlem görmemiş numuneler kullanın. Lignin görüntülemede, aromatik halka simetrik gerilme titreşiminden dolayı 1,600 cm -1 civarında spektral zirveyi göz önünde bulundurun. Polisakkarit görüntüleme (selüloz ve hemiselüloz dahil) için, spektral zirveyi aCH ve CH 2 gerilmelerinden dolayı 2,889 cm -1 yuvarlaktır.
  3. Selüloz ve hemiselüloz görüntüleri oluşturmak için lekeleyici örnekleri kullanın. Elde edilen spektrumlarda selüloz ve hemiselülozun spektrumlarını ayırt etmek ve dağılımlarını görüntülemek için kendinden modelleme eğrisi çözünürlüğü (SMCR) uygulayın.
  4. Farklı hücre duvarı katmanlarından Raman spektrumlarını ayırt etmek için elde edilen verilere temel bileşen analizi (PCA) ve kümeleme analizi uygulayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 , bir bitki hücre duvarının Raman görüntüsü için tipik bir mikro-Raman sistemine genel bir bakış sunmaktadır. Örnek olarak, kavak ( Populus nigra L.) orijinal Raman spektrumlarında belirgin taban çizgileri ve sivri uçlar bulunur ( Şekil 2a ). Raman görüntüleme veri seti (APRI) için otomatik ön işleme yöntemini yaptıktan sonra, bu iki spektral kirletici başarıyla kaldırılır ( Şekil 2b

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki hücre duvarı, hücre köşesi (CC), ikincil duvar (SW, S1, S2 ve S3 katmanları) ve bileşik orta lamel (CML, orta lamel artı birincil birincil Duvar), bu da numunenin hazırlanması sırasında düz bir yüzey elde edilmesini zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, ahşaptan daha karmaşık bir yapıya sahip bitki örnekleri, özellikle çim, çoğunlukla ince kesit vermeye izin vermek için katılaştırılmaya ihtiyaç duyar. PEG, suda çözünür olduğu için kesme ve Raman araştırması için ideal bir sert matristir. Deiyonize suyla durulama ile kola...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mali destek için Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'na (2016YDF0600803) teşekkür ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MikrotomTermo Bilimsel MikromHM430
Konfokal Raman mikroskobuHoriba Jobin YvonXplora
FırınŞangay ZHICHENGZXFD-A5040

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonzalo, G. D., et al. Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation. J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).
  2. Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
  3. Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
  4. Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
  5. Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
  6. Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
  7. Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
  8. Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
  9. Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
  10. Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
  11. Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891(2016).
  12. Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
  13. Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
  14. Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
  15. Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Raman ImagingMultivariate AnalysisPlant Cell WallLignin VisualizationCellulose ImagingHemicellulose AnalysisSpectral AcquisitionData ProcessingSample PreparationConfocal Microscopy

Related Articles