Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

11.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55913

⸱

12 Temmuz 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan saflaştırılmış germ hücresi popülasyonlarının elde edilmesi için bir yöntemin standartlaştırılmasını açıklamaktadır. Mekanik testis ayrışmasını, Hoechst-33342 ve propidyum iyodür ile boyamayı ve FACS sınıflandırmasını birleştiren basit bir protokoldür ve erkek üreme biyolojisi karşılaştırmalı çalışmalarında geniş uygulamalar yapılmıştır.

Özet

Floresanla aktive hücre ayırma (FACS), memeli testiküler germ hücrelerinin zenginleştirilmiş popülasyonlarının izole edilmesi için tercih edilen yöntemlerden biridir. Şu anda, yüksek verim ve saflık ile 9 murin germ hücresi popülasyonuna kadar ayrım yapılmasına izin vermektedir. Ayrımcılık ve saflaştırma konusundaki bu yüksek çözünürlük, spermatogenez boyunca kromatin yapısındaki ve miktarındaki benzersiz değişiklikler nedeniyle mümkündür. Bu modeller, Hoechst-33342 (Hoechst) gibi flüoresan DNA bağlama boyaları ile boyanan erkek germ hücrelerinin akış sitometrisi ile yakalanabilir. Burada, memeli testiküler germ hücrelerini izole etmek için yakın geçmişte geliştirilmiş bir protokolün ayrıntılı bir tarifi. Kısaca, tek hücreli süspansiyonlar, testis dokusundan mekanik ayrışma ile, Hoechst ve propidyum iyodür (PI) ile çift boyalı ve akış sitometrisi ile işlenerek üretilir. Farklı DNA içeriğine (Hoechst yoğunluğu) sahip canlı hücrelerin seçimi (PI negatif) de dahil olmak üzere seri geçitlendirme stratejisi, iFACS sıralama sırasında 5 germ hücresi türünü ayırt etmek için kullanılır. Buna spermatogonia (% 66), primer (% 71) ve sekonder (% 85) spermatosit ve spermatidler (% 90), ayrıca yuvarlak (% 93) olarak ayrılmış ve uzatma (% 87) alt popülasyonlar. Tüm iş akışının yürütülmesi basittir, 4 hücre türünün aynı anda uygun FACS makinesi ile izolasyonuna izin verir ve 2 saatten daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Azaltılmış işlem süresi, ex vivo hücrelerin fizyolojisini korumak için çok önemlidir; bu yöntem, erkek germ hücresi biyolojisinin aşağı akışlı yüksek verimli çalışma için idealdir. Dahası, memelilerin germ hücrelerinin çoklu spesifik arındırılması için standartlaştırılmış bir protokol, değişkenlerin metodolojik kaynaklarını ortadan kaldırır ve farklı hayvan modelleri için tek bir reaktif kümesinin kullanılmasına izin verir.

Giriş

Spermatogenezis progresyonunu temsil eden bir in vitro sistem eksikliği ve testiste büyük hücresel heterojenlik varlığı göz önüne alındığında, erkek germ hücresi biyolojisi çalışmaları, zenginleştirilmiş belirli hücre tip popülasyonlarını izole etmek için sağlam teknikler gerektirir. Fluoresansla aktive hücre ayırma (FACS), yüksek verim ve saflık sağladığı ve tanımlayabileceği germ hücresi türlerinin sayısındaki diğer izolasyon yöntemlerini aştığı için bu amaçla 1 , 2 , 3 , 4 , 5 yaygın olarak kullanılmıştır ve 6 , 7 , 8'i seçin . Akış sitometrisi analizi ilkesi, tekli hücrelerin lazer ışını uyarılmasından sonra diferansiyel ışık örüntülerinin saptanmasına dayanır. Bir hücre lazerden geçerken ışığı yansıtır / saçar(Ileriye saçılma; FSC) ve hücre içi karmaşıklığa (yan saçılım; SSC) orantılı olarak her açıdan. Akış sitometrisi hakkında ayrıntılı bilgi için Ormerod 9'a bakın.

Erkek germ hücreleri, spermatogenezin farklı aşamalarında DNA içeriğinde, kromatin yapısında, boyutta ve şekle özgü modifikasyonlara maruz kalırlar. Böylece, farklı hücre popülasyonları, ışık saçılması ve DNA boyama ile flüoresan boyalar 10 , 11 ile birleştirilerek tanımlanabilir ve ayrılabilir. Son 10 yılda testis hücrelerinin akım sitometrisi analizinde sıklıkla kullanılan Hoechst-33342 (Hoechst) gibi bu amaçla birkaç boyayı (Geisinger ve Rodriguez-Casuriaga 3'te inceledik) 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoUV uyarısıyla n uyarma, Hoechst, hücresel DNA içeriğiyle orantılı olarak mavi flüoresan yayar; far kırmızı floresans ise kromatin yapısında ve sıkıştırmada değişkenliği yansıtmaktadır 1 , 13 , 14 . Sonuç olarak, farklı aşamalardaki erkek germ hücreleri, Hoechst lekeli tek hücre süspansiyonlarının FACS sırasında özel desenler sergilerler (Ho-FACS; 1 , 12 ). İlginç bir şekilde, spermatogonial evrede sadece aktif olan bir boya akışı mekanizması nedeniyle, Hoechst mavisi flüoresansının yoğunluğu, bu hücrelerdeki kromatin içeriğiyle orantılı değildir ve Ho-FACS 15 sırasında bir yan popülasyon olarak kümelenir. Ek olarak, Hoechst boyamayı geçirgen olmayan boya propidyum iyodür (PI) ile birleştirmek, kullanıcıların canlı (PI negatif) ile ölü (PI pozitif) hücrelerden FACS 1 sırasında ayırt etmelerini sağlarSup>, 2 , 10 , 12 . Bu strateji, testis germ hücrelerinin akış sitometrik analizlerinde daha önce kullanılmış ve mayoozun 4 farklı evresi I 1 , 2 , 4 , 16'da bulunan hücreler de dahil olmak üzere, 9 germ hücresi türünü ayırt etmek için farede geniş kapsamlı olarak optimize edilmiştir. Bu çalışmanın amacı için Hoechst boyamanın üç ana avantajı vardır. Birincisi, Ho-FACS, fare modeli 1 , 2 , 12'de erkek germ hücrelerinin izolasyonuna ve fare ve kobay 17 , 18 , 19 gibi diğer kemiricilere başarılı bir şekilde uygulanmıştır. İkincisi, Hoechst, hücreye nüfuz eden bir boya olup membran permeabilizasyonu gerektirmez, bu nedenle prezervatifHücre bütünlüğünü sağlar. Son olarak, Hoechst öncelikle poli (d [AT]) DNA dizileri 1 , 20'ye bağlandığından RNase tedavisine gerek yoktur; bu, RNA'nın korunması anlamına gelir ve DNA ve proteinlerin yanı sıra mikropların daha aşağı moleküler çalışmaları için de kullanılabilir Hücre farklılaşması.

Memeli türlerin akış sitometrisi analizlerinde gözlenen DNA ploidi ve / veya lekelenme özelliklerine benzerlik göstermesine rağmen (Geisinger ve Rodriguez-Casuriaga 3'te gözden geçirilmiştir ), akış sitometrisiyle erkek germ hücresi izolasyonu için tarif edilen protokollerde iyi değişkenlik mevcuttur. Farklı çalışmalar, doku ayrışması için spesifik protokolleri kullandı ve başta fare, sıçan ve kobay olmak üzere farklı model organizmalardaki farklı DNA bağlama boyalarını (tek başına veya kombinasyon halinde) ve FACS geçiş stratejilerini kullandı. Dolayısıyla, farklı türler için toplanan verilerin doğrudan kıyaslanması sigara içiminden etkilenebilirMetodolojiler arasındaki değişkenlikten kaynaklanan teknik olmayan eserler. Önemli olarak, memelilerin spermatogenezi (2N-4N-2N-1N) boyunca kromatin dinamikleri çarpıcı korunması, standartlaştırılmış bir protokolün çeşitli memeli türlerine çapraz olarak uygulanabileceğini düşündürmektedir.

Bu çalışmanın amacı, daha önce yayınlanmış teknikler 2 , 20'yi birleştirip uyarlayarak, farklı memeli türlerine uygulanabilen tek bir iş akışı geliştirmekti. Doku işleme için bir yöntem Standardizasyon enzimatik sindirim 5 için gerekli olan türe özgü düzeltme gereksinimini ortadan mekanik ayrışmayı gerçekleştirerek elde edilmiştir. Kemirgen hayvan testis dokunun mekanik ayrışma enzimatik Doku sindirimi 20 ve her iki yöntem de Sergi Sergi tarafından üretilen tek hücre süspansiyonlarının Ho-FACS daha iyi bir performans gösterilmiştir dikkat çekicidirKarşılaştırılabilir sonuçlar 5 . Prensip olarak, bu protokol, 5 germ hücresi popülasyonunu izole etmek için kullanılan ayarları açıklamaktadır: spermatogonia (SPG); Primer (SPC I) ve sekonder spermatositler (SPC II) ve spermatidler (SPD) - yuvarlak (rSPD) ve uzatma (eSPD). En önemlisi, ana gereksinimler doku ayrışması ve bir UV lazer ile donatılmış bir hücre sıralayıcıya erişim için olan, laboratuarda uygulanması kolaydır. Bu iş akışı ( Şekil 1 ) hızlı ve basittir ve 4 germ hücresi popülasyonunun taze testis dokusundan 2 saatten daha kısa sürede aynı anda izolasyonuna izin verir. İndirgenmiş işlem süresi, daha ileri prosedürler için hücresel bütünlüğü korumak için çok önemlidir. Ayrıca, 5 farklı türün başarılı bir performans göstermesi, memelilerde yaygın olarak uygulanabileceğini ve memeli erkek üreme biyolü karşılaştırmalı çalışmalar için germ hücrelerini izole etmek için ideal bir yöntem haline getirdiğini göstermektedirlenmiştir.

Bu protokol, hazırlık adımlarının yanı sıra (1) testiküler dokunun mekanik ayrışması ve (2) testiküler hücrelerin Hoechst ve PI ile boyanması ve ardından (3) ilgili spermatogenik hücrelerin FACS sınıflandırılması olmak üzere üç ana bölümden oluşur. Bir kez toplandığında, farklı memeli testiküler germ hücrelerinin zenginleştirilmiş popülasyonları çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu protokol, birçok farklı memeli türünden erkek germ hücrelerini saflaştırmak için "bir boyut uyuyor" ayrışma yöntemini açıklıyor. Kullanıcıların izole edilmiş germ hücreleri ile yürütmek istedikleri türüne bağlı olarak, diğer medya veya tamponlar kullanılabilir. Aşağıdaki protokol adımları, bir tam murin testisinden tek hücre süspansiyonu üretmek içindir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıda açıklanan tüm prosedürler, St. Louis'deki Washington Üniversitesi'ndeki Hayvan Çalışmaları Komitesinin düzenlemelerine uymaktadır.

1. Mekanik Ayrışma Protokolü Hazırlıkları

  1. Tüm murin testisin ayrılması için önceden ıslak 50 μm'lik bir atılabilir doku ayrıştırma kartuşu.
    NOT: Bu tek kullanımlık kağıt parçalanma kartuşu dokuların kesilmesi için tasarlanmış mikrobladları ve yaklaşık olarak altıgen altı delikli, hareketsiz bir çelik hasır içerir. Bu protokolü türlere ve istenen hücre tiplerine göre uyarlamak için doku ayrıştırma kartuşu için farklı boyutlarda örgü mevcuttur. Bu makalede adı geçen tüm memeli türleri için 50 μm kartuşlar kullanılmıştır.
    1. 50 ml tek kullanımlık doku ayrıştırma kartuşu üzerine 1 mL buz soğuk fenol kırmızısı serbest 1x Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yükleyin.
      NOT: Fenol kırmızısı, kırmızı fluoresan tespitini etkileyebilirFACS sırasında.
    2. Şırınga portundan tek kullanımlık 3 mL iğnesiz şırınga ile doku ayrıştırma kartuşundan 1x DMEM'yi aspire edin.
  2. "ON" düğmesine basarak doku ayrıştırma sistemini açın. Bu sistem "ısınma" zamanı gerektirmez.
  3. Buzla soğutulmuş 1x DMEM ile önceden ıslak üç 40 μm'lik atılabilir filtre. Her bir 40 μm'lik atılabilir filtreyi 50 mL konik tüp üzerine yerleştirin. Pipet 1 mL 1x DMEM ve sıvıdan geçmesine izin verin.
  4. Testiküler dokuların toplanması için 100 mm x 15 mm'lik bir Petri kabı hazırlayın. Petri kabına 1x DMEM 500 mcL pipetleyin.

2. Mekanik Ayrılma Protokolü için Testiküler Doku Hazırlanması

  1. Cerrahi makas ve forseps ile taze tüm testisleri veya testiküler fragmanları (diğer memeli türleri ile ilgileniyorsanız) dikkatlice çıkarmak için bir erkek fare ayırın.
    NOT: Dokuda yağ ve nekroz bulunmadığından emin olun. Cu Esh testis dokuları dondurulmuş dokulara kıyasla üstün tek hücreli süspansiyon kalitesi üretir.
    1. Toplanan testisleri / fragmanları 500 mcL 1x DMEM ihtiva eden hazırlanmış 100 mm x 15 mm Petri kabına aktarın.
    2. Kırmızı kan hücrelerini (varsa) çıkarmak için dokuyu 1x DMEM içinde hafifçe durulayın.
  2. Tunica albugineayı dikkatlice çıkarın. Tunika albuginea kalınlığı farklı türlerde farklılık gösterecektir.
    1. Testislerin bir ucunu forsepsle tutun.
    2. Testisin bir ucunu önceki adımdaki forsepslerle tutarken testisin diğer ucunu bir neşterle delin.
    3. Adım 2.2.1 'deki forsepsle hala testisin bir ucunu tutan bir neşter kullanarak testis tübelerini kazıyın.
  3. Bir neşter kullanılarak ~ 2-3 mm3 parçalar halinde testis tübüller kesilir.

3. Testiküler Dokuların Mekanik Ayrılmasıyla Tek Hücreli Süspansiyonların Elde Edilmesi

Ontent "> NOT: Aşağıda açıklanan ayrışma adımları, yetişkin bir fare testisidir. Juvenile farelerden veya fare olmayan türlerden testiküler dokuların hacimleri buna göre ayarlanmalıdır.Çocuk hayvanlar germ hücrelerinin tüm aşamalarını içermeyebilir Bazı memeli türleri Testis dokusu kompozisyonu, çiftleşme mevsiminde çiftleşme yapmayan mevsime göre değişir.

  1. Forseps kullanarak önceden ıslatılmış 50 μm doku ayrıştırma kartuşuna küçük testis tübü parçalarını aktarın ve 1 mL DMF 1 mL ekleyin.
  2. Doku ayrıştırma kartuşunu doku ayrıştırma sistemine yükleyin ve düğmeyi "bekleme" durumundan "çalıştır" moduna çevirerek 5 dakika işlem yapın.
  3. Doku ayrıştırma sisteminden doku ayrıştırma kartuşunu çıkarın ve şırınga limanından bir kez atılabilen 3 mL iğnesiz şırınga ile hücre süspansiyonunu aspire edin.
    1. Doku ayrıştırma kartuşundaki tüm sıvıyı çıkarmak için birkaç kez aspire edin. Değil1 mL'nin hepsi doku ayrıştırma kartuşundan geri kazanılabilir.
  4. Aspire edilen hücre süspansiyonunu, iki kez atılabilen 40 μm'lik filtrelerden geçirin. Herhangi bir hücre agregasını kaldırmak için iki kez filtreleyin.
    1. 50 ml lik konik bir tüpe önceden ıslatılmış 40 μm filtre yerleştirin. Doğrudan şırınga 40μm filtre üzerine aspire hücreleri ekleyin. Tek kullanımlık pipetle geçirilen tek hücreli pipetle pipetle alın.
    2. Kullanılmış önceden ıslanmış 40 μm filtreyi çıkarın ve 50 mL'lik konik tüp içinde önceden ıslatılmış 40 μm'lik bir filtre yerleştirin. Toplanan tek hücreli süspansiyonu temiz 40 μm filtreye pipetleyin.
    3. Filtreli tek hücreli süspansiyonu, tek kullanımlık bir pipetle toplayın.
  5. 50 μm'lik doku ayrıştırma kartuşuna geri pipetle filtrelenen hücre süspansiyonu ve bir doku ayrıştırma sisteminde 5 dakika daha işleme tabi tutulur.
  6. Doku ayrıştıran tüm sıvıyı geri kazanınKartuş üzerinde.

4. Hoechst ve Propidium Iodide (PI) ile boyama

  1. 50 um'lik doku ayrıştırma kartuşundan temiz bir 1.5 mL tüp içine toplanan hücre süspansiyonunu aktarın. Yaklaşık olarak 1-1.5 mL tek hücre süspansiyonu geri kazanılır.
  2. Geri kazanılan tekli hücre süspansiyonunu dört adet 1.5 mL veya 5 mL tüpe bölün.
    1. İlk üç tüp için, dört tüpün sonuna tek hücreli süspansiyon pipetleyin ve 150 μL pipetleyin (tek hücre süspansiyonunun yaklaşık 550 μL).
      NOT: Son tüpteki tek hücreli süspansiyonun miktarı, adım 3.6'daki hücre süspansiyonunun toparlanma verimliliğine bağlı olarak değişiklik gösterebilir.
  3. Dört tüpün ilk tüpünü FACS oturumu için lekeleyici olmayan bir kontrol olarak ayarlayın.
  4. Tek boya boyalı (PI veya Hoechst) hücre süspansiyonlarını kontrol olarak hazırlayın. Her boruya 2.5 μL Hoechst veya 1 μL PI ekleyin (ikinci ve third).
  5. Çift lekeli bir tüp hazırlayın. Bu, germ hücresi alt popülasyonlarının toplanması için kullanılacaktır. Son tüpe 2.5 μL Hoechst ve 1 μL PI ekleyin.
    NOT: Hoechst'in raf ömrü 2-3 aydır. Daha eski boya stoklarını kullanmak FACS oturumu sırasında önemli değişiklikler yapacaktır.
  6. Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Örnekleri bir tüp döndürücü içine yerleştirin veya 1,5 mL tüpleri 5-10 dakikada bir ters çevirin.
  7. Hücre süspansiyonunu önceden ıslatılmış 40 μm'lik bir süzgeçle filtreleyin ve filtrelenmiş çözeltiyi buz ve karanlıkta FACS oturumuna kadar koruyun.
    NOT: FACS için hücre yığınlarını önlemek için filtrasyon adımı gereklidir. Ek olarak, DNase (bakınız Şekil 1 ) veya 2-Naftol-6,8-disülfonik asit dipotasyum tuzu (NDA 20 ) ile muamele, hücre yığılmayı sınırlamak için kullanılabilir. Uzun bekleme süreleri, FACS sırasında tespit edilen flüoresan sinyalini etkileyecek ve hücre ölümünde artışa neden olabilir.

5. Testis Hücrelerinin Flüoresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Kurulumu ve Saflaştırılması

  1. FACS toplama tüpleri hazırlayın.
    1. Hücre toplama için 5 mL polipropilen yuvarlak tabanlı tüpler veya 400 ml FBS ile 1.5 mL tüpleri kaplayın. Boya sonrası dekant fazlalığı FBS.
    2. Tüplere FACS toplama ortamı (1x DMEM +% 10 Fetal Sığır Serumu, FBS) ekleyin: 5 mL tüpler için 1 mL, 1.5 mL tüpler için 100 μL.
  2. Hücre sıralayıcı ve yazılımında uygun sıralama koşullarını ayarlayın.
    NOT: Aşağıda açıklanan benzer kurulum ve geçiş stratejileri ile diğer hücre ayırma makineleri ve analiz yazılımı kullanılabilir. Burada açıklanan koşullar, Gaysinskaya ve Bortvin 2 , Geisinger ve Rodriguez-Casuriaga 3 ve Getun ve diğerleri tarafından uyarlanmıştır . 4
    1. 463/2 ile ultraviyole bir lazer yükleyinHoechst mavisini algılamak için 5 nm bant geçiren filtre ve Hoechst kırmızısını algılamak ve PI tespit etmek için 680 nm LP bant geçiren filtre.
    2. Mavi ile kırmızı floresan arasında ayrım yapmak için 555DLP dikroik ayna kullanın.
    3. 70 μm'lik bir meme kullanın ve 1000-2000 hücre / saniye hızında hücreleri sıralayın.
      NOT: Sıralama etkinliği doğrudan akış hızından etkilenir. Yüksek akış hızları (> 3500 olay / sn) sıralama hızını artırır, ancak popülasyonların kontamine olmasına neden olur. Daha fazla bilgi için referans 12'ye bakınız.
  3. Kontrol örnekleri kullanarak kapıları ayarlayın.
    1. Boyanmamış numune yükleyin ve çalıştırın.
    2. FSC vs SSC arsa desenine dayalı hücre öplerini hariç tutun. Artığın sol alt kadranda hücre döküntüsü çıkar. Kullanıcı veya hücre sıralayıcısı teknisyeni tarafından hücre öpleri eşiğini keyfi olarak ayarlayın.
    3. FSC ve darbe genişliği için eşik değeri ayarlayarak tek hücrelere giriş. Farklı hücre ayırıcıların farklı yöntemler vardır.Şort singlet. Darbenin genişliği, hücrelerin lazer çaprazlanması için gereken süreyi yansıtıldığından, tek hücreli hücreler, çok hücreli agregalara kıyasla daha düşük değerlere sahiptir. FSC'ye karşı darbe genişliği için bir arsa üzerinde eşik değeri ayarlamak, tekli seçmek için kullanılabilir.
    4. Optimum fotomültiför tüpü (PMT) voltajlarını ayarlayın.
    5. PI veya Hoechst floresan sinyali eşiğini oluşturmak için hem lekelenmemiş hem de tek boyalı lekelenmiş hücreleri kullanın.
      NOT: Her bir boya için uygun floresan aralığını oluşturmak için ilgili hücreler için temel PTM voltajlarını optimize etmek önemlidir. Bu, optimum sinyal algılama ve hassasiyet için kritik öneme sahiptir. Renklendirilmemiş ve tek boyalı kontrol hücreleri, PI ve / veya Hoechst boyaları ile negatif ve pozitif boyalı hücreler aralığı oluşturmak ve sinyaldeki gürültüyü en aza indirmek için kullanılır. Kontrol hücreleri kullanılarak PMT geriliminin optimizasyonu hakkında daha fazla açıklama için lütfen Gaysinskaya ve Bortvin 2'ye başvurun.
    6. Canlı hücredeki kapıPI boyama (PI negatif) ve FSC arsa dayalı. Ölü hücreler PI floresan için pozitif olacaktır.
    7. DNA içeriği kapısını Hoechst mavisi flüoresanına dayanan bir hücre sayımı histogramı çizerek ayarlayın. Haploidi (1C), diploid (2C) ve tetraploid (4C) hücreleri temsil eden Hoechst mavisi flüoresansının artan konsantrasyonları olan 3 zirveleri görünmelidir. Her pik için bir tane olmak üzere 3 kapı ayarlayın.
    8. Germ hücrelerinin popülasyonlarına geçmeden önce FSC vs SSC arsa üzerinde en az 500.000 olayı izleyin.
  4. Farklı germ hücre popülasyonlarını kapayın.
    1. Hoechst / PI boyalı örnek yükleyin.
    2. Tüm popülasyonlarda ortak olan ilk 3 ana kapıyı ayarlayın.
      1. FSC vs SSC arsa temelinde hücre döküntülerini hariç tutun. FSC vs darbe genişliği arsa dayalı singlets seçin. PI negatif hücreleri geçitleyerek canlı hücreleri seçin.
    3. Spermatogonia kapısını tanımlayın.
    4. Hoechst mavisine ve kırmızı flüoresansı temel alan PI negatif hücreleri çizmeşiddetler. Spermatogonia yan nüfus olarak görünür (Bkz. Şekil 1 ).
    5. Kalan germ hücresi popülasyonları için kapıları tanımlayın. NOT: Görsel ayrıntılar için şekil 1 ve ek şekli 2'ye bakın.
    6. DNA içeriği kapısında PI negatif hücreleri çizin.
      1. Spermatidler için zirveyi en düşük Hoechst flüoresansıyla (1C) kaplayın.
      2. II spermatositleri için, tepeyi ara Hoechst flüoresansı (2C) ile kaplayın.
      3. Spermatosit I için zirveyi en yüksek Hoechst flüoresansıyla (4 ° C) kaplayın.
    7. DNA içeriği kapılarından spermatositleri ve spermatid popülasyonlarını rafine etmek için Hoechst mavisi ve kırmızı floresan yoğunluğunu çizin.
  5. Seçilen alt toplama kapılarını önceden hazırlanmış toplama tüplerine topla. Her testis, her bir alt popülasyonu yaklaşık olarak 0,5-6,0 x 10 6 hücreleri toplamak için 1.5 saat için 45 dakikalık bir ortalama alacaktır.
    NOT: Hoechst ma'ya uzun süreli hücre maruziyetiY popülasyonlarının yerini biraz zamanla değiştirirsiniz. 20-30 dakika FACS sonrasında ayarları yenileyin. Her alt popülasyon için maksimum verim, ayrışma aşamasının verimliliğine bağlı olacaktır.

6. Saflaştırılmış Hücrelerin Mikroskopik Değerlendirilmesi

  1. Toplanan hücreleri 500-600 xg'de 4 ° C'de 10 dakika döndürün.
  2. 1 mL buz soğukluğunda 1x fosfat tampon çözeltisi (PBS) veya 1x DMEM ile hücre topağını yeniden süspansiyon haline getirin.
    NOT: Yeniden süspansiyon hacmi, sıralanan hücrelerin sayısına ve arzulanan nihai konsantrasyona göre ayarlanabilir.
  3. Temiz cam slayt üzerine yıkanmış hücrelerin 40 μL'ini pipetleyin ve lamel yerleştirin.
  4. Geri kalan hücreleri% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin ve ileride başvurmak üzere sabit hücreleri 4 ° C'de karanlıkta saklayın.
    1. Doğrudan toplama tüplerinde 100 μL% 4 PFA pipetleyin.
    2. Hücre süspansiyonunun iyi karıştırılmasını sağlamak için tüpleri veya pipeti birkaç kez vorteksleyin.
  5. Hazırlanan slaytları, 63X'lik bir hedefin altında Hoechst flüoresanını algılamak için bir UV lamba ile donatılmış bir mikroskopta görselleştirin. Spesifik germ hücre türünün nasıl belirleneceği ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için Sonuçlar bölümüne bakın - Sınıflandırılmış germ hücresi popülasyonlarının morfolojik değerlendirmesi -.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Testiküler dokunun mekanik ayrışmasından gelen tek hücre süspansiyonları

Şekil 2 , farklı koşullar altında fare testis dokusunun mekanik ayrışmasıyla elde edilen tek hücre süspansiyonlarını karşılaştırmaktadır. Taze dokuları, lekeleyici olmayan ( Şekil 2A ) veya Hoechst ile lekelenmiş ( Şekil 2B ) numuneler, farklılaşan aşamalardaki farklı h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Memelilerde spermatogenez sırasında yüksek oranda korunmuş olan kromatin dinamikleri göz önüne alındığında, bu çalışmanın amacı, farklı memeli testis dokularından farklılaşan farklı evrim safhalarında erkek germ hücrelerini izole etmek için bir protokol geliştirmekti ( Şekil 1 ). Farklı hayvan modellerine tek bir iş akışının uygulanmasının önündeki en büyük engellerden biri, özellikle doku ayrışma protokolleri açısından türlere özel ayarlamalara ihtiyaç duyulmasıdır. Mevcut yöntemler çoğunl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Yazarlar köpek testisleri için Hillside Hayvan Hastanesine (St. Louis, MO) teşekkür eder; Jason Arand ve Dr. Ted Cicero'nun sıçan testisleri sağlamak için Washington Üniversitesi'nde (WashU) bulunan laboratuarı ve koleksiyona yardımcı olmak için Brianne Tabers; Jared Hartsock ve Washwell'de bulunan Dr Salt'ın Laboratuvarı, kobay testisleri için; Ve Minyatür domuz testisleri için WashU'da Karşılaştırmalı Tıp Bölgesinde Dr. Michael Talcott. Yazarlar ayrıca, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Stnes Barnes-Yahudi Hastanesi'ndeki Alvin J. Siteman Kanser Merkezi'ni personel tarafından işletilen hücre sıralama hizmetini veren Siteman Akış Sitometri Çekirdeği'nin kullanımı için kabul ediyorlar. Siteman Kanser Merkezi kısmen NCI Kanser Merkezi Destek Grant # P30 CA91842 tarafından desteklenmektedir.

Bu araştırma, FCT doktora bursu [SFRH / BD / 51695 / 2011'den ACL'ye], Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüsünden [R01HD078641 ve R01MH101810'dan DFC] ve bir FCT araştırma sözleşmesi [IF / 01262/2014 - AML].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 4 paraformaldehitVWR# 15710% 4 PFA, Sıralanmış hücreleri sabitlemek için
MedimachineBD Biosciences# 340588;Testis ayrışması için sistem
1X Dulbecco modifiye Eagle mediumLife Technologies# 31053DMEM, testis ayrışması için
MediconBD Biosciences#340591Testis ayrışması için ayrıştırma kartuşu
Fetal sığır serumuThermo Scientific#10082139FBS, FACS koleksiyonu için
Hoechst 33342Invitrogen#H3570Hoecsht, FACS boyama için
40 ve mikro; m hücre süzgeciGREINER BIO-ONE#89508-342Testis ayrışması için
100x 15 mm petri kabıFalcon#351029Testis diseksiyonu için
5 mL polipropilen yuvarlak tabanlı tüplerFalcon#352063FACS koleksiyonu için
1.5 mL Eppendorf tüpleriVWR# 20170-650FACS koleksiyonu için
3 mL gereksiz şırıngaBD Biosciences#309657Testis ayrışması için
50 mL konik tüpMIDSCITestis ayrışması için 
Propidium IodürInvitrogen#L7011PI, FACS boyama için
MoFlo Legacy hücre sıralayıcıBeckman Coulter#ML99030FACS
Summit Cell Sorting yazılımıBeckman Coulter#ML99030FACS için
Fosfat tamponlu salinThermo Scientific#AM9625PBS,
Mikroskobik cam slaytFisher Scientific# 12-544-4Mikroskopi için
Cam lamelFisher Scientific# 12-548-87Mikroskopi için
Tek kullanımlık transfer pipeti (3 mL)Samco Scientific# 225Testis ayrışması için
DNase IRoche# 10104159001Testis ayrışması için
Karbon çeliği cerrahi bıçakMiltex# 4-111Testis diseksiyonu için
Kontes otomatik hücre sayacıInvitrogen#C10227Otomatik hücre sayımı için
Tripan mavisi çözeltisi (% 0.4)Sigma#T8154Canlı boyama için
#C50R için mikroskopi için

Kaynaklar

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39(2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hoechst BoyamaPropidyum yod rFloresan Aktivasyonlu H cre Ay klamaSpermatogonia zolasyonuSpermatosit AnaliziSpermatid Ay r m
Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.