Yöntem makalesi

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

DOI:

10.3791/55918

⸱

26 Temmuz 2017

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine, 2Department of Basic Neurosciences, Geneva Medical Center, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Geneva Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uydu hücreleri (SC), kas liflerinin plazma membranı ile çevresindeki bazal laminat arasında bulunan kas kök hücreleridir. Kas rejenerasyonu için gereklidirler. İskelet kaslarında sıklıkla görülen yaralanmalar üzerine SC'ler harekete geçirilir. Myoblastlar olarak çoğalıyor ve kas lezyonlarını onarmak için ayırt ediliyorlar. Kas farklılaşması sırasında gerçekleşen birçok olay arasında, sitosolik Ca 2+ sinyalleri büyük önem taşır. Bu Ca2 + sinyaller hem de hücre dışı alanı Ca2 + girişi, özellikle depo çalışan Ca2 + girişi (SOCE) itibaren, iç Ca2 + depolardan Ca + 2 serbest ortaya çıkar. Bu makale, ortopedik ameliyattan sonra toplanan kas örneklerinden saf bir insan miyoblast popülasyonunu elde etmek için kullanılan bir metodu açıklamaktadır. Doku mekanik ve enzimatik olarak sindirilir ve hücreler çoğaltılır ve daha sonra spesifikasyonların varlığına göre akış sitometrisi ile sıralanırFik membran belirteçleri. Elde edilen insan miyoblastları büyütülür ve büyüme faktörlerini kültür ortamından uzaklaştırarak ayırt etmeyi taahhüt eder. Spesifik transkripsiyon faktörlerinin ekspresyon seviyeleri ve in vitro immünofloresans, kontrol koşullarında ve Ca 2 + sinyallemeyle ilgili proteinleri susturmadan sonra miyojenik farklılaşma sürecini değerlendirmek için kullanılır. Son olarak, SACE'nin güvenilir ve tekrarlanabilir ölçümlerini sağlayan bir ratiometric Ca 2+ probu olarak Fura-2'nin kullanımını ayrıntılarıyla açıkladık.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan iskelet kasları, miyojenik öncü hücrelerin kaynaşmasından kaynaklanan kontraktil, çok çekirdekli kas liflerinden oluşan gruplardan oluşur. İskelet kası, miyofibarların plazma membranı (sarcolemma) ile bazal lamina arasında bulunan iskelet kası kök hücreleri olan SC'lerin varlığı nedeniyle hasardan sonra yeniden oluşma kapasitesine sahiptir. Yaralanmamış kasında, SC'ler çoğunlukla sessiz bir durumda bulunur. Mekanik stres veya yaralanmaya tepki olarak, SC'ler aktifleştirilir (miyoblastlar), çoğalır ve yeni miyofiberleri oluşturmak için ya da SC havuzu 1 , 2'yi doldurmak için kendi kendini yenilemek üzere farklılaşır. Yıllar geçtikçe, SC'leri ve yavrularını (miyoblastları) iskelet kası biyopsilerinden izole etmek için çeşitli teknikler geliştirildi. Bu hücreler üzerinde ifade edilen hücre yüzey markörlerinin daha iyi anlaşılması ve floresans ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması (FACS) metodolojisine 3 ile, 4 , 5 , şimdi insan kasları saf kas popülasyonlarını kas örneklerinden izole etmek mümkündür.

Kalsiyum sinyali iskelet kası gelişimini, homeostazı ve yenilenmeyi düzenler. Özellikle, SOCE adlandırılan hücre-içi stokunun tükenmesi sonra aktive edilir Ca2 + girişi, bu işlemler için büyük önem 6 taşımaktadır. Hücre uyarımı üzerine, endo / sarkoplazmik retikulumdaki Ca 2+ seviyesi (ER / SR) azalır ve bu da, Ca 2+ girişinin ER / SR 7'yi tekrar doldurmasına izin veren plazma membranı Ca 2+ kanallarını harekete geçirir. SOCE'ye katılan iki ana protein, ER / SR Ca 2+ -gören stromal etkileşim molekülü 1 (STIM1) proteini ve plazma membranı Ca2 + kanalı Orai1'dir. İskelet kası bu iki proteini ve aynı ailelerin diğer proteinlerini bol miktarda ifade eder (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 ve birkaç Ca 2+ geçirgen olmayan geçici alıcı potansiyel kanonik (TRPC) ailesi kanalları 10 , 11 , 12 , 13 . SOCE yolu boyunca Ca 2+ girişi, kas oluşumu / rejenerasyonu için çok önemlidir 14 . STIM1 veya Orai1 proteinlerinin mutasyonları kas hipotoni 15 esas açan kas fonksiyonu üzerinde zararlı etkileri vardır. SOCE bozukluğu olan hayvan modelleri, azaltılmış kas kütlesini ve kuvvetini, aynı zamanda artmış yorgunluk 6 , 16 , 17 ile birlikte gösterir . Belirtildiği gibi, diğer STIM ve Orai proteinleri ve birçok TRPC kanalı iskelet kasında eksprese edilir ve şimdiye kadar ilgili rolleri belirlenememiştir. D'yi çalarakKendi ifade seviyelerine sahip oldukları için, SOCE'deki etkilerini ve insan iskelet kası farklılaşması sırasındaki rollerini araştırmak mümkündür.

SOCE ölçümü iki farklı yaklaşımla yapılabilir: elektrofizyolojik güncel kayıtlar ve Ca 2+ ölçümleri. Elektrofizyoloji, ilgi akımını ve buna bağlı elektrofizyolojik imzayı ölçtüğünden kesinlikle daha doğrudan bir yöntemdir. Bununla birlikte, bu tekniğin kas hücrelerine uygulanması çok zordur çünkü esas olarak kas hücrelerinin büyüklüğü ve endojen SOCE akımının küçük boyutu. Sitosolik Ca 2+ görüntüleme teknik açıdan çok erişilebilir, ancak sitosolde ölçülen Ca 2+ seviyesi hem Ca 2+ girişini hem de hücrenin yeniden dışarı pompalamasını ya da iç depolarda yansıtıldığından önlem daha dolaylı.

Mikoblastların küçük insan iskeletinden izole edilmesini içeren bir metodolojiEnzimatik sindirim, amplifikasyon ve FACS sonrası etal kasa bu makalede açıklanmıştır. Zamanla farklılaşan belirteçlerin ekspresyonunu izleyen kas farklılaşması ve immünofloresan protokolü işlemi 18'de tanımlanmıştır. Son olarak, SOCE'nin ölçümü ve Ca 2+ sinyal verme ve iskelet kasının diferansiyasyonunda farklı iyon kanallarının rolü açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ortopedik cerrahi sırasında sağlıklı hastalarda cerrahi atık olarak insan kas örnekleri (semitendinöz kaslardan alınan dokular) toplandı. İnsan çalışmasıyla ilgili tüm yöntemler, İsviçre Düzenleyici Sağlık Otoriteleri'nin yönergelerine ve düzenlemelerine uygun olarak ve İsviçre'deki Cenevre Kanton Yetkilileri'nden (Protokol CER n ° 12-259) Komisyon Yasası tarafından onaylanmıştır. . Bilgilendirilmiş ve yazılı onaylar, çalışmaya katılan tüm yetişkinlerden elde edildi.

1. İnsan iskelet kasında miyoblastların izolasyonu

  1. Tüm işlemler sırasında, seviye II doku kültürü başlığı altında çalışarak steril ortam ve steril tamponlar kullanarak steril koşulları muhafaza edin.
    Not: Bu prosedür pek çok insan iskelet kası üzerine uygulanabilir.

2. Ayrışma Protokolü

  1. Kas örneklerini (2 - 3 g) steril bir 6 cmplaka.
  2. Kas numunelerini 5 - 10 mL fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın. Yıkamayı tekrar et.
  3. Kıvrımlı makas ve kelepçe kullanarak bağ ve yağ dokularını çıkarın.
  4. Kas örneğini tartın (bkz. Adım 2.13) ve yeni bir steril 6 cm plakaya aktarın.
  5. 5 mL% 0.05'lik Tripsin-EDTA ilave edin.
  6. Makas kullanarak, kas dokusunu küçük parçalara (2 mm'den daha az) kesin ve kıyplayın.
  7. 10 mL serolojik bir pipet kullanarak, kıyılmış kas manyetik bir çubuk içeren 200 mL çözülme şişesine aktarın. 90 mL% 0.05'lik Tripsin-EDTA çözeltisi ayrıştırılmış kasa ile ayrışma kutusuna aktarılana kadar bu adımı tekrarlayın. Ayrıştırma şişesini kapatın ve hafif çalkalamayla 60 ° C'de 37 ° C'de inkübe edin.
  8. Ayrışma şişesini ısıtma banyosundan çıkarın ve ayrışma şişesine 10 mL fetal buzağı serumu (FCS;% 10 nihai hacim) ilave ederek enzimatik reaksiyonu durdurun. Karışımı bir pipetle homojenize edin.
  9. HazırlıkHerbirinde 70 μm hücre süzgeçli iki 50 mL tüptür. Süspansiyon geçene kadar filtreye aşağı ve yukarı pipetle atarak hücre süretöründen hücre süspansiyonuna hücre süspansiyonunun yarısını geçirin.
  10. Tüpleri 200 xg ve 20 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın.
  11. 10 ml büyüme ortamı (GM, Tablo 1 ) ile hücreleri tekrar süspansiyon ve bir 50 ml tüp yerleştirilen bir 40 mikron hücre süzgeç hücreleri geçmek. Boruyu 200 xg ve 20 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın.
  12. 10 ml'lik GM ile hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 200 xg ve 20 ° C'de tüpü 5 dakika boyunca santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın.
  13. 1 mL GM ile hücreleri tekrar süspanse edin ve bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
    Not: Genellikle kas kütlesi başına 3 x 10 5 hücre verimi hasat edilmelidir. Verim, hücrelerin sayısının kas biyopsi ağırlığına bölünmesiyle hesaplanır(Adım 2.4).
  14. 4 mL GM içeren steril bir 6 cm'lik plakaya 2 x 10 5 hücre koyun ve 37 ° C'de ve% 7 CO 2'de inkübe edin. Gerektiği kadar çok tabak hazırlayın.
  15. GM'yi 3 gün sonra değiştir.
    Not: Derhal ayrışmış hücrelerin kültür plakasına yapışması için zaman gerekir. Dahası, ilk miyojenik hücre çoğaltma süresi yaklaşık 50-60 saattir. İlk bölünmeden sonra katlama süresi yaklaşık 20 saat.
  16. Hücreler 70 ulaştıklarında, 7 gün, - - 5 sonra (10 x 1,5 yaklaşık 6 hücre / 6 cm plaka başına)% 80 kaynaşmaya, antikoru boyamasını ve hücre sıralama (aşama 3) başlar.

3. Antikor Boyama ve Hücre Ayırma

  1. PBS ile bir kez durulandıktan sonra yapışan hücreleri (6 cm'lik plakada) 37 ° C'de% 0.05'lik Tripsin-EDTA'nın 1 mL'si ile inkübe edin ve 3 dakika boyunca% 7 CO 2 (veya% 5 CO 2'de inkübe edin). GM'yi 2 mL ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücreleri 15 mL tüp içine alın. Santrifüjden sonra (5 dakika boyunca 200 xg), resGM'lerin 1 mL'sindeki hücreleri geçiştir.
  2. Bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
  3. Buz üzerinde aşağıdaki prosedürleri uygulayın.
    Not: Sitometrede doğru flüoresans kompanzasyonu ayarlama prosedürü esastır ve herhangi bir sitometrede benzer olmalıdır. Negatif kontrol olarak borular 1 ve 2 kullanılır. Tüpler 3 - 7 ilk deney sırasında sitometredeki kompanzasyonu ayarlamak için kullanılır ( Tablo 2 ). Nihai konsantrasyonu, her bir antikor için kullanılabilir ve karşılık gelen izotip (1 ug / etrafında 10 6 hücre) aynı olması gerekir.
  4. Tüpler 1 - 7 için tüp başına (5 mL tüp) 1 x 10 5 hücre gönderiniz ( Tablo 2 ). Kalan hücre süspansiyonunu, hücre ayırması için tüp 8'e yerleştirin.
  5. Hücreleri 1 mL soğuk FACS tamponu (PBS-% 5 FCS) ile yıkayın. Tüpleri 200 xg ve 4 ° C'de 5 dakika kapatın ve santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın.
  6. Tüp başına 200 μL FACS tampon ekleyin. Antikorları ekleyinE tüpü Tablo 2'ye göre. 30 dakika boyunca buzda inkübe edin.
  7. Hücreleri yıkayın: her tüp için 1 mL FACS tampon ekleyin. Tüpleri 200 xg ve 4 ° C'de 5 dakika kapatın ve santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve atın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  8. Hücreleri 500 μL FACS tamponuna tekrar süspanse edin. Tüpleri kapatın ve hücre ayırma işlemine kadar buz üzerinde tutun. Herbiri hücre ayırma işlemi sırasında hücreleri toplamak için gerekli 500 mcL GM ihtiva eden 1.5 mL'lik 4 tüp hazırlayın. Onları buzda tutun.
  9. İnsan miyoblastlarını akış sitometrisi ile sıralayın ( Şekil 1 ). CD45-pozitif hematopoietik hücreleri dışladıktan sonra, CD56 ekspresyonuna dayalı ayrı CD45 negatif hücreler. Ardından CD34, CD144 ve CD146 (insan miyoblastları CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- hücreleri olarak tanımlanır) için CD56 pozitif popülasyonunu kaplayın. Saflığı kontrol etmek için sıralanmış hücre popülasyonunun küçük bir bölümünü yeniden analiz edin.
  10. İnsan miyoblini içeren tüpleri boşaltın15 mL'lik bir tüpe ilave edin ve 5 mL'lik GM ekleyerek bir kez yıkayın. Boruyu 200 xg ve 20 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın.
  11. 1 mL GM'de hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 4 mL GM içeren kaplanmamış 6 cm'lik bir plakada hücreleri plakaya yerleştirin (plaka başına 2 x 10 5 hücre). 37 ° C'de ve% 7 CO 2'de inkübe edin.

4. Hücre Bakımı

  1. Kültür ortamının yarısını her 2 günde değiştirin. Kültür çanak eski GM 2 mL çıkarın ve GM 2 mL ekleyin.
    Not: Myoblastlar, kültür koşulları için yararlı büyüme faktörleri üretirler.
  2. Önceden farklılaşmayı önlemek için hücreler% 70-80'e ulaştığında hücreleri deneyin. PBS ile bir kez durulandıktan sonra yapışmış hücreleri (6 cm'lik plakada) 37 ° C'de% 0.05 0.05 tripsin-EDTA ve 3 dakika% 7 CO 2 ile inkübe edin. GM'yi 2 mL ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücreleri 15 mL'lik bir tüp içerisinde toplayın. Santrifüjden sonra (5 dakika boyunca 200 xg), resüs1 mL GM'de hücreleri bekletin.
  3. Hücreleri sayın ve 4 mL GM plaka başına 2 x 10 5 hücre ile 6 cm levha hazırlamak.
  4. İnsan miyoblastlarını 6 pasajda tutun veya mL başına% 1 DMSO, 1 x 10 6 hücre içeren GM içerisinde dondurun. Hücreleri aşamalı bir dondurucu kutuda dondurun (1 ° C / dakika); Uzun süreli depolamada, hücreleri sıvı nitrojene yerleştirin.

5. İnsan miyoblastlarının siRNA ile transfeksiyonu

Not: Myoblastlar, ticari transfeksiyon reaktifi kullanılarak farklılaşmanın başlatılmasından iki gün önce transfekte edilir. Spesifik siRNA'nın bir gene karşı etkisi her zaman bir kontrol siRNA'nın etkisi ile karşılaştırılır. SiRNA'lar, buz üzerinde tutulması ve eldivenlerle manipüle edilmesi gereken çift telli RNA'lardır.

  1. 6 cm'lik bir plakada (yaklaşık 1.5 x 10 6 hücre) insan miyoblastlarının% 70-80'lik konfluent monolayerini elde edin.
    Not: transfeksiyon başına 5 x 10 5 hücre bir aleyhte elde edilmesi için gerekli olanGM'de 2 gün sonra transfekte myoblastların akıcı tek tabaka.
  2. Cam lamelleri hazırlayın (7. adımda kalsiyum görüntüleme için açıklanmıştır).
  3. Sıcak GM,% 0.05'lik Tripsin-EDTA ve PBS'den 37 ° C'ye.
  4. Sterilizasyonu korumak için aşağıdaki basamakları basamak II doku kültürü kaputunda gerçekleştirin.
  5. 1.5 mL'lik bir tüpte, azaltılmış serum ortamı 500 mcL, 3 μL transfeksiyon reaktifi ve 1 uL siRNA 20 uM'de gönderilir. Hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 15-20 dakika tutun.
  6. Bu kuluçka süresi boyunca, miyoblastları transfeksiyon için hazırlayın. PBS ile bir kez durulandıktan sonra yapışmış hücreleri (6 cm'lik plakada) 37 ° C'de% 0.05 0.05 tripsin-EDTA ve 3 dakika% 7 CO 2 ile inkübe edin. GM'yi 2 mL ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücreleri 15 mL'lik bir tüp içerisinde toplayın. Santrifüjden sonra (5 dakika boyunca 200 xg), hücreleri 1 mL GM'ye tekrar süspanse edin.
  7. Bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
  8. 5 x 10 5 hücreyi tekrar süspanse edinHer bir transfeksiyon için 200 uL GM'de ( yani, 2 transfeksiyon için, 400 uL'de tekrar süspansiyon haline getirin).
  9. SiRNA-transfektan karışımının her 500 mcL'ye hücre süspansiyonundan 200 uL ekleyin. İki kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  10. Bir cam lamel içeren 3.5 cm'lik bir kültür kabına 700 μL (hücreler + siRNA-transfectant) ekleyin. 2 mL'lik nihai bir hacim elde etmek için GM ekleyin.
  11. 37 ° C'de 24 saat ve% 7 CO2 sonra tamamen taze GM 2 mL orta yerine. 24 saat sonra transfekte hücrelerin konfluent mono tabakası genellikle bulunur; Eğer öyleyse, GM'yi 2 mL farklılaşma ortamı (DM, Tablo 1 ) ile değiştirerek miyoblast farklılaşmasına neden olun.
  12. Farklılaşmanın başlatılmasından 24-48 saat sonra veya çoğalan miyoblastlarda kalsiyum görüntüleme deneyleri uygulayın.
    Not: İmmünofloresans, genellikle farklılaşmanın başlatılmasından 48 saat sonra yapılır.

6. ImmFarklılaştırma İşaretleyicileri İçin Unofluoresans Boyama

Not: İmmünofloresan boyama DM'de 48 saat sonra yapılır, ancak diğer farklılaşma zamanlarında da yapılabilir. Myogenin ve MEF2, sadece farklılaşmış hücrelerde (miyotüplere kaynaştırılmadan önce) eksprese edilen nükleer proteinlerdir ve boyama, farklılaşma sürecinin değerlendirilmesine izin verir. Myosin ağır zinciri (MyHC) sadece miyotüplerde ifade edilir ve miyotüp boyutu ve füzyon endeksini (miyotüplerdeki çekirdek sayısı / toplam çekirdek sayısı) tahmin etmek için kullanılır.

  1. DM'de 48 saat sonra, bölünmüş hücrelerin konfluent monolayer'ini oda sıcaklığında iki kez 1 mL PBS ile yıkayın. Miyotüplerin ayrılmasını önlemek için bunu dikkatle yapın.
  2. RT'de 15 dakika boyunca hücreleri 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile fikse edin. Her biri 5 dakika süreyle hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
  3. Hücreleri,% 0.25 Triton X-100 içeren 1 mL PBS ile 45 dakika boyunca geçirin ve 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın.
  4. Engelle% 0.2 Tween-10 ve% 2 keçi serumu (blok çözeltisi) ile takviye edilmiş PBS'de hücreleri inkübe ederek 30 dakika süreyle RT'de bağışıklık kazandırır.
  5. Blok solüsyonda seyreltilmiş birincil antikorları (3.5 cm'lik plaka başına 600 μL) hazırlayın.
    Not: Aşağıdaki primer antikorlar kullanılır: fare anti-miyojenin (1: 600), tavşan anti-MEF2 (1: 300) ve fare anti-MyHC antikoru (MF20, 1: 1,000). Tavşan anti-MEF2 ile aynı engelleme çözeltisi, fare anti-miyozin ağır zinciri veya fare anti-miyojenin karıştırmak mümkündür.
  6. Blok çözeltisini çıkarın ve 3.5 cm'lik plaka başına birincil antikor çözeltileri 600 μL ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de nemli bir odada inkübe edin.
  7. Hücreleri 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın. Keçi anti-fare Alexa 488 (1: 1000), keçi anti-tavşan Alexa 546 (1: 1000), blok çözelti içinde hazırlanan sekonder antikorlar 600 mcL ile karanlık bir odada oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin: Ve DAPI (1:50, stok solüsyonu 15uM'de).
    CAUTION: DAPI, eldivenlerle işlenmesi gereken toksik bir bileşiktir.
  8. Aspire edin ve hücreleri 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın.
  9. Cam kaplamaları, antifadif çözeltili polivinil alkol montaj malzemesi kullanarak yerleştirin. Onları 4 ° C'de tutun ve hücreleri görüntüleyene kadar ışığa karşı koruyun.

7. Kalsiyum Görüntüleme

  1. Önceki kültür, 25 mm çapında cam lamelleri hazırlayın. Yüzeydeki herhangi bir gres ve kiri temizlemek için 48 saat boyunca% 70 etanol içinde lamel koyun, lamel hücre adheransını azaltır.
  2. Lamelleri birkaç kez suyla duruladıktan sonra, tekrar suya koyun ve sterilize edin (otoklavlanır).
  3. 3,5 cm'lik kültür plakasına bir lamel koyun ve kurumalarını bekleyin. Daha ileri deneyler için Petri yemeklerini saklayın veya hemen kullanın.
  4. Transfere mikoblastlar (5 - 6 x 10 5 hücre) cam lamel ekleyin.
    Not: Deneyler, diferansiyasyonun indüksiyonundan 24-48 saat sonra yapılırÜzerinde veya çoğalmakta olan miyoblastlarda.
  5. Ca 2+ görüntüleme yapmak için, hücreleri PBS ile 2 kez veya doğrudan deneyler için kullanılan ortamla yıkayın (kalsiyum içeren ortam, Tablo 3 ). Karanlıkta RT'de yaklaşık 30 dakika boyunca hücrelere 2 uM Fura-2 / AM artı 1 uM pluronik asit yükleyin.
    Not: Pluronic acid, Fura-2'yi çözündürmeye yardımcı olur. Fura-2 / AM ve pluronik asit kalsiyum içeren ortamda çözülür.
  6. Hücreleri Fura-2 / AM ve pluronic asit olmaksızın aynı ortamda iki kez yıkayın ve Fura-2 / AM'nin esterlenmesini sağlamak için karanlıkta ilave bir 10-15 dakika bekletin.
  7. Fura-2 yükleme etkinliği çok düşükse, daha fazla Fura-2 ekleyin ( örn., 4 uM) ve / veya hücreleri daha uzun süre ( örn., 40 dakika) inkübe edin.
  8. Kültür plakasındaki lamelleri çıkarın ve deney odasına yerleştirin. ~ 1 mL kalsiyum içeren ortam (deney hacmine bağlı olarak) ilave edinZihinsel oda). Mikroskop sahnesine yerleştirin ve kaydı başlatın.
    Not: Floresan Ca 2+' ya duyarlı prob Fura-2, 340 nm ve 380 nm'de dönüşümlü olarak uyarılır ve emisyon ışığı 510 nm'de toplanır. Ca 2+ konsantrasyonundaki dalgalanmalar nispeten yavaş olduğu için, her 2 saniyede bir 1 oran alın.
  9. SOCE'yi etkinleştirmek için aşağıdaki klasik thapsigargin / Ca 2+ yeniden ilavesi protokolü kullanılır: hücreleri 2-3 dakika boyunca kalsiyum içeren ortamda bırakın. Ortamı, 1-2 dakika boyunca kalsiyumlu ortamla değiştirin.
    1. Dahili kalsiyum depolarını boşaltmak için 1 uM thapsigargin ekleyin.
      Not: Thapsigargin sarkoidozlu endoplazmik retikulum Ca 2+ ATPaz (SERCA) pompa aktivitesinin geri döndürülemez bir bloke edicisidir. 8-10 dakika sonra, ortamı hızla kalsiyum içeren besiyeri ile değiştirin. Ca 2+ , SOCE kanalları vasıtasıyla hücrelere girecektir. Deneyleri sona erdirmeden önce yaklaşık 5 dakika bekleyin.
      DİKKAT: Thapsigargin, eldiven ile işlenmesi gereken zehirli bir bileşiktir.

8. Ca 2+ Ölçüm Analizi

Not: Analiz edinme yazılımı ile gerçekleştirilir.

  1. Deneyi aç. Bölge 1'i, hücrelerin olmadığı bir bölgede (arka plan bölgesi) çizin ve diğer bölgeleri analiz edilecek hücrelerin sitoplazmalarında çizin (bölgeler, herhangi bir görüntü üzerinde çizilebilir: 340 nm, 380 nm, Veya oran görüntüsü). "Denemeleri çalıştır"> "referans resimler" e gidin. 340 ve 380 kanalların altında, "bölge 1" i seçip "Arka plan çıkar" ı tıklayın.
  2. Arka plan bölgesi boyunca dolaşan floresan toz spotu gibi arka plan bölgesi ile hiçbir şeyin etkilenmemesini ve hücrelerin deneyler sırasında hareket etmemesini sağlamak için tüm denemeyi (F4: ileri) çalıştırın.
    Not: Seçilen ilgi bölgeleriKaranlık alanlar içermemelidir; Aksi takdirde, oran değerinde gürültülü görünecektir, zira arka planın bir kısmı ölçümde yer alacaktır.
  3. "Verileri kaydet" i tıklayın ve tüm denemeyi tekrar oynayın.
    Not: Bu, zamanın ve oranın kaydedildiği bir e-tablo açar. Bireysel 340 nm ve 380 nm dalga boylarını kurtarmak da mümkündür.
  4. SOCE hakkında bilgi almak için deneydeki iki önemli parametreyi çıkartın: Ca 2 + yeniden ilavenin genliği ve Ca 2+ giriş fazının eğimi ( Şekil 3 ).
  5. Ca 2 + yükselmesinin maksimal amplitüdünden Ca 2+ yeniden ilavesinden hemen önce oran değerini çıkararak genliği elde edin. Ca 2+ yeniden eklemeden sonraki ilk saniyelerin doğrusal gerilemesi uyarak maksimal eğimi elde edin.
    Not: Thapsigargin tepkisinin eğrisi altındaki alan ayrıca extrac için bilgilendirici bir parametredirT, SR'de depolanan serbest kalsiyum miktarını yansıtıyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir insan kas örneğinin enzimatik ayrışmasından sonra, hücreler GM'de amplifiye edildi. CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- hücreleri olarak tanımlanan insan miyoblastları FACS'den sonra elde edildi. Myoblastlar, analiz edilen popülasyonun% 60'ından fazlasını temsil etti ( Şekil 1 ). Primer insan miyoblastları yeniden oluşturuldu, konfluansa kadar çoğaltıldı ve 48 saat DM'de kültürlendi. Transkripsiyon faktörü MEF2 ve kas spesifik protein miyozin ağır zinciri (MyHC) ekspresyonu için b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetişkin iskelet kasından insan miyoblastlarının izolasyonu ve kültürü, kas farklılaşması ve kas yenilenmesini incelemek için in vitro bir model sunar. Bu yazıda, insan miyoblastlarının yüksek verimliliğini basit ve maliyet-sınırlı şekilde arındırmaya olanak tanıyan bir protokol sunuyoruz. Buna ek olarak, bu teknik, izole edilen miyoblastların yüzdesi ve miyojenik farklılaşma verimi açısından güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Nitekim hücre sıralama sonrasında insan m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların rekabette finansal çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (hibe numarası 310030-166313), "Vakıf Marcel Levaillant" ve "Fondation pour la recherche osteo-articulaire" başlıklı "Fondation Suisse reourcheurs sur les maladies musculaires" tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Jambon' s F10ThermoFisher Scientific31550-023
FCSThermoFisher Scientific10270-106Lot 41G5532K
BSASigmaO5482
fetuinSigmaF3385
EGFCorning354001
DeksametatansonSigmaD1756
İnsülinSigmaI9278
KreatinSigma27900
PiruvatSigmaP4562
ÜridinSigmaU3003
GentamisinThermoFisher Scientific15710-049
Tripsin-EDTA %0.05ThermoFisher Scientific25300-062
70 & m hücreli süzgeçFalcon352350
40 μ m hücreli süzgeçFalcon352340
Falcon 50  mL tüpFalcon352070
Falcon 15  mL tüpFalcon352096
Falcon 5  mL tüp (FACS)Falcon352058
Kültür ortamı: OPTI-MEMThermoFisher Scientific31985-047
Transfectant reagnt: RNAiMaxThermoFisher Scientific1756064
PBSThermoFisher Scientific14190-094
Montaj ortamıFluka10981
Fare anti-MyHC *DSHBMF20 ve nbsp;Konsantre
Fare anti-miyojeninBD Pharmigen556358
Tavşan anti-MEF2Santa Cruz BiotechC-21
Keçi anti-fare Alexa488ThermoFisher ScientificA11029
Keçi anti-tavşan Alexa 546ThermoFisher ScientificA11035
Fare anti insan CD56-Alexa488BD Pharmingen557699
Fare anti insan CD146-PECy7BD Pharmingen562135
Fare anti insan CD45-PE-CF594BD Pharmingen562279
Fare anti insan CD34-APCBD Pharmingen345804
Fare anti insan CD144-PEBD Pharmingen560410
Alexa Fluor 488 fare IgG1kBD Pharmingen557702
PECy7 fare IgG1kBD Pharmingen557872
PE-CF594 fare IgG1kBD Pharmingen562292
APC fare IgG1kBD Pharmingen550854
PE fare IgG1kBD Pharmingen556650
DAPISigmaD9542DİKKAT:  toksik bileşik
ParaformaldehitFluka762400
Fura-2ThermoFisher ScientificF1201
Pluronic F-127ThermoFisher ScientificP3000MP
ThapsigarginSigmaT9033DİKKAT : toksik bileşik 
Oran görüntüleme elde etme yazılımı: Metafluor 6.3Moleküler Cihaz
* : MF 20, Fischman, D.A.  tarafından DSHB'ye yatırıldı;

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  2. Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
  3. Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195(2014).
  4. Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
  5. Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
  7. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  8. Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
  9. Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
  10. Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
  11. Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
  12. Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
  13. Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
  14. Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
  15. Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
  16. Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
  17. Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805(2013).
  18. Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
  21. Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855(2016).
  22. Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
  23. Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
  24. Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ak SitometrisiFura 2 Kalsiyum G r nt lemeDoku SindirimiH cre Ay klamaKalsiyum SinyalizasyonuKas RejenerasyonuTranskripsiyon Fakt rleri

İlgili makaleler