Yöntem makalesi

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

DOI:

10.3791/55932

⸱

10 Ekim 2017

 ,  , 
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması tau hyperphosphorylation, tau bağlama mikrotübüller ve hücre içi tau ilaç tedavileri takip yerelleştirilmesini ölçme ölçmek için standart iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller sürekli uyuşturucu ya da tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama hedef diğer bileşikler eleme için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrotubul ilişkili protein tau çoğunlukla akson yerelleştirir nöronal bir proteindir. Genellikle tau Mikrotubul derleme ve sabitleme yer çünkü normal nöronal işleyişi için gereklidir. Nöronlar yanı sıra, tau insan meme, prostat, mide, kolorektal ve nerede neredeyse benzer yapısını gösterir ve benzer işlevleri nöronal tau giderek artan pankreas kanserleri ile ifade edilir. Tau ve onun fosforilasyon miktarı onun işlevini mikrotübüller sabitleyici değiştirin ve Alzheimer hastalığı gibi farklı nörodejeneratif hastalıklarda eşleştirilmiş Helisel filamentler gelişmesine yol. Tau ve Mikrotubul bağlama özellikleri fosforilasyon durumunu belirlemek önemlidir. Buna ek olarak, tau hücre içi lokalizasyonu inceleyerek farklı hastalıklarda önemlidir. Tau fosforilasyon ve mikrotübüller kolorektal kanser hücreleri veya curcumin ve LiCl tedavi olmadan içinde tau bağlama ölçmek için bu el yazması detayları standart iletişim kuralları. Bu tedaviler kanser hücre çoğalması ve geliştirme durdurmak için kullanılabilir. Hücre içi tau yerelleştirilmesini immünhistokimya ve confocal mikroskobu antikorlar düşük miktarda kullanırken kullanarak incelenir. Bu deneyleri hkr tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama etkileyen bileşikler eleme için kullanılabilir. Roman therapeutics için farklı tauopathies kullanılan veya bu iletişim kurallarını kullanarak ilgili antikanser ajanların potansiyel olarak karakterize edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau aslında tübülin1ile birlikte saf bir ısı-kararlı Mikrotubul ilişkili protein olarak tespit edilmiştir. Tau sadece daha yüksek Ökaryotlar2,3,4' te ifade edilir. Tau ana fonksiyonu Mikrotubul derleme1,5,6kontrol etmektir. Ayrıca mikrotübüller7, aksonal transport8, aksonlar çapı9değişimler, nöroma polarite ve ateş10polimerizasyon için katkıda bulunur. Tau da bazı sinyal yolları kontrol etmek için bir protein iskele davranır. Sıçan beyin çalışmalar önermek o tau nöron özel ve akson11' öncelikle yerelleştirir. Tau Mikrotubul polimerizasyon ve nöronal gelişim için gerekli olduğundan, tau merkezi sinir sistemi aksonal gelişiminde önemli bir rol oynamaya onaylanmadığına karar; Bu hipotez sonraki vitro ve in vivo deneyler tarafından doğrulanmadı. Nöronlar yanı sıra, karaciğer, böbrek ve kas hücreleri12,13de dahil olmak üzere farklı nöronal olmayan hücrelerde, tau ifade edilir. Tau da insan meme, prostat, kolorektal, mide ve pankreas kanseri hücre satırları ve dokular14,15,16,17,18, ifade edilir 19. tau da dahil organları20bükülmüş tubulofilaments olarak dahil-vücut miyozit içinde bulundu.

Tau birkaç translasyonel modifikasyonlar taşıyabilir. Tüm translasyonel modifikasyonlar fosforilasyon yaygın olarak kullanılır. Artan tau fosforilasyon mikrotübüller, nihayet sitoiskeleti istikrarsızlaştırıcı için onun ilgi azalır. Seksen beş fosforilasyon siteleri insan Alzheimer hastalığı beyin dokulardan izole tau protein tarif edilmistir. Bu siteleri, serin, % 41 treonin ve sadece % 6 tirozin kalıntıları21,22,%2353 teşkil etmektedir. Tau fosforilasyon onun yerelleştirme, fonksiyon, bağlama, çözünürlük ve diğer translasyonel modifikasyonlar, duyarlılık etkiler. Ayrıca tau fosforilasyon normal ölçüde daha (veya fosfat grupları ile tam doygun) Alzheimer hastalığı24yapısal ve işlevsel özellikleri çoğaltır hyperphosphorylation bilinir. Tau aksonal mikrotübüller düzgün tutar ve normal nöronal fizyolojik koşullar altında çalışmasını sağlar. Ancak, hyperphosphorylated tau Mikrotubul sökme nedeniyle nöronal kaybına neden bir iyi organize edilmiş Mikrotubul bağlama korumak başarısız olur. Tau fosforilasyon normal düzeyde uygun tau işleyişi için gereklidir, ancak tau karakteristik fosforilasyon seviyesine bir değişiklik yapıldığında ve hyperphosphorylated25ise normal işlevine başarısız olur. Alzheimer hastalığı ve bazı diğer yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıklar, tau hyperphosphorylated olur ve eşleştirilmiş Helisel filamentler ve neurofibrillary tangles26,27oluşturur. Böylece, tau fosforilasyon ve Mikrotubul bağlama belirlemek için önemli yöntemlerdir.

Kolorektal kanser, bir yaşlanma ilişkili kanser üçüncü en sık kanser ve ölümüne neden olan üçüncü önde gelen kanser hem erkek hem de kadınlar için28tanısı var. Kolorektal kanser Batı dünyasının29ana ölümüne neden olan kanser biridir. Kolorektal kanser ve Alzheimer hastalığı yaşlanma ile ilişkili olan ve her ikisi de nerede insanlar benzer beslenme alışkanlıkları zevk gelişmiş ülkelerde özellikle oldu çünkü iki hastalık bir şekilde ilişkili. Buna ek olarak, tau-pozitif ve negatif tau kanser hücrelerinin farklı yanıt kemoterapötik ajanlar, örneğin, Paklitaksel16için.

Curcumin Curcuma longa, Hint baharat zerdeçal30ana türevleri biridir. Yüzyıllar boyunca, Güney Asya nüfus zerdeçal günlük olarak besinlerinde tüketilen sahip. Curcumin kolorektal kanser, Alzheimer hastalığı, şeker hastalığı, Kistik fibrozis, inflamatuvar barsak hastalığı, artrit, hiperlipidemi, ateroskleroz ve iskemik kalp hastalığı31, de dahil olmak üzere farklı hastalıkları tedavi etmek için kullanılır 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lityum veya kolorektal kanser hücrelerini öldürmek de onların nükleer silahların yayılmasına karşı39önlemek. Lityum de tau toplama azalır ve onun hyperphosphorylation bir transgenik fare modeli41,42,43gözlemlediği gibi engeller olarak Alzheimer hastalığı40 tedavi etmek için kullanılabilir, 44.

Bu el yazması amaçlamaktadır: 1) ölçü toplam tau ve fosfo-tau ifade seviyelerinde işlem görmüş hücreleri; 2) genel tau fosforilasyon ölçmek için bir fosfataz tahlil tarif; 3) tau Mikrotubul bağlama incelemek; ve 4) kolorektal kanser hücre çizgiler curcumin veya LiCl ile tedavi confocal mikroskobu tarafından tau yerelleştirilmesine. Sonuçları curcumin ile hücre tedavi, hangi kolon kanseri için sözde iyi bir kemoterapötik Ajan ve tedavi LiCl ile her iki toplam tau ifade azaltabilir ve tau kolorektal kanser hücre hatlarında fosforile olduğunu ortaya koyuyor. Bu tedaviler de tau nükleer translocation neden olabilir. Ancak, beklenmedik bir şekilde, curcumin tau mikrotübüller için bağlama geliştirmek başarısız olur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. reaktifler hazırlık

  1. Ekle 10 µL (1 mM) phenylmethylsulfonyl florür çözüm, 10 µL (1 x 100 x stoktan) proteaz inhibitörü kokteyl çözüm ve 10 µL (1 x 100 x stoktan) fosfataz inhibitörü kokteyl çözüm 1 x radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabelleği tam RIPA lizis arabellek hazırlamak için 1 ml.
  2. Hazırla 10 x genel tübülin arabellek (PEM) arabellek.
    1. Ekle 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic asit, 10 mM (95,1 mg) etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic asit, 10 mM (51 mg) MgCl 2 ve 1.25 M (10 M 3 mL) NaOH bir 50 mL tüp , mix 15 mL distile su ile ve bir girdap kullanarak geçiyoruz. (6,9 olmalıdır) pH kontrol edin. Eğer pH > 6,9, arabellek atmak ve taze çok remake.
      Not: NaOH bu pH 6,9 aşma değil emin olmak için 1.25 M olmalıdır. HCl pH ayarlama için kullanmak için tavsiye değil > 6,9.
    2. Dropwise pH 6,9 olana Ekle NaOH. 10 X PEM arabellek ilâ 25 mL distile su ekleyin. Son olarak, bir şırınga ve 0.2 µm şırınga filtre kullanarak filtre uygulama. Bu arabellek aliquots 1,5 mL tüpler içine bölmek ve depolamak saat 4'te ° C.
  3. Hazırla 5 örnek arabellek indirgeyici ve boya ile x.
    1. Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-5 mL 5 x SDS örnek arabellek de makyaj HCl (pH 6.8), 2.5 mL (% 25) % 50 gliserol, % 10 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), 1.2 mL distile su ve 1 mL (% 2). Mağaza − 20 ° c
      Not: gliserol viskoz olduğu için ölçüm 1,25 mL gliserol zordur. Bir mL % 100 gliserol 1.26 g ağırlığında. Böylece, % 100 gliserol 1,575 g tartmak (hangi eşittir %100 1,25 mL veya 2.5 mL % 50 gliserol) bir 15 mL tüp ilk; Mix de diğer bileşenlerle.

2. Hücre kültürü, Curcumin tedavisi veya LiCl tedavi ve muayene Protein ifade

  1. Ekle ~ 1 10 6 HCT 116 hücreleri x 100 mm içine doku kültürü yemekleri ile % 10 fetal sığır takıma en az temel medya (MEM) içeren Serum (FBS) ve % 1 penisilin-streptomisin. Kültür bir gün sonra hücrelerin % 60-70 izdiham ulaşacaktır.
    Not: Aşağıda açıklanan tedaviler Sayısı Tabaklar gerekli sayısını bağlıdır.
    2. Hücreleri (mikroskopi kullanarak yaklaşık olarak) ~ %65 izdiham ulaşmak, takıma MEM orta kaldırıp serum ücretsiz MEM 5 mikron, ile 10 µM ve 30 µM curcumin veya 25 mM, 50 mM, 100 mM LiCl eklediğinizde
  2. . Oksijen bir atmosferde % 5 CO 2 içeren 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. 24 saat sonra tedavi, 1 mL buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) hücrelerle yıkama ve hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazımak. Alıntı hücrelerin içine 1,5 mL tüpler santrifüj kapasitesi ve santrifüj kapasitesi 1.800 x g 4 ° C'de hücre granül elde etmek için de 4 dk için transfer.
  4. Düzenli olarak tüpler dokunarak süre içinde tam RIPA arabelleği için 20 dk 4 ° C'de 100 µL granül askıya tarafından hücreleri parçalayıcı. Kısaca örnekleri solüsyon içeren temizleyicide.
  5. Hücre homogenates 22,570 x g de benchtop santrifüj 20 dakika içinde 4'te santrifüj kapasitesi ° C. Transfer supernatants bir pipet kullanarak etiketli diğer tüpler.
  6. Supernatants protein konsantrasyonu ticari protein-tahlil Kitleri kullanarak Bradford tahlil 45 tarafından tedbir.
  7. Hazırlama örnekleri eşit protein konsantrasyonu (10 µg protein/13 µL örnek) hücre lysates ile 4 X SDS jel-yükleme arabellek. 4 x SDS jel-yükleme arabellek 400 mM dithiothreitol (DTT) içeren taze hazırlanan.
    Not: Bu aşamada, örnekleri, saklanabilecek olan − 20 ° C gerekirse.
  8. Örnekleri 5 dakika süreyle 100 ° C'de ısı blokta bir girdap kullanarak örnekleri Mix ve onları ~ 10-15 için soğumasını bekleyin Incubate dk.
  9. Araya bir Elektroforez Sistemi.
    1. Yük 10 µg protein (13 µL örnek) başına % 10 SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) için iyi. Molekül ağırlıklı merdiveni tek şeritli jöleye üzerine yük.
      Not: Elektroforez başlatılırken, protein merdiven belirgin moleküler ağırlık protein grupları çözümler. Moleküler ağırlık bilinmeyen protein gruplarından tahmin etmek için bu bantları kullanın.
    2. Örnekleri yükledikten sonra pozitif ve negatif elektrotlar Elektroforez Sistemi sabit voltaj korumak için bir güç kaynağına bağlayın. Başlangıçta, 70 V 20 dk için protein örnekleri yığın jel çözme jel taşımak başlangıç. Örnekleri ve protein merdiven jel sonuna ulaşana kadar sonra 125 V yaklaşık 70-120 min için voltajı yükseltin.
    3. Islak electroblotting sistemini kullanarak polivinilidin difluoride (PVDF) membran Jel Elektroforez tamamlanmasından sonra transfer. ~ 100 dk 100 blok V. için 25 90 dakika oda sıcaklığında %4 sığır serum albumin (BSA) engelleme arabellekte membran aktarım ° C.
  10. Leke molekül ağırlıklı merdiven yanında keserek işaretleyin. Şeffaf plastik levha ve keskin kesici leke kesim için kullanın. İlköğretim-antikor Çözümleri (1:5, 000 Anti-tau; anti-fosfo-tau 1:4, 000) hazırlamak ve bu çözüm 4 ° C'de blot gecede kuluçkaya.
  11. Gecede kuluçka sonra leke 7 min için dört kez fosfat tamponlu tuz-ara-20 (PBST) çözümde yıkayın.
  12. İlgili ikincil-antikor Çözümleri (keçi Anti-tavşan ya da anti-fare IgG 1:5, 000) hazırlamak ve leke dört kez, 7 dk PBST yaklaşık 25 ° C. makinaya 90 dakika oda sıcaklığında Bu çözümde kuluçkaya.
  13. Geliştirmek üreticiye göre bir Kemiluminesan kit kullanarak leke ' s öneriler. Şeffaf plastik wrap kullanarak leke kapsar. Görüntüleri görüntüleme sistemi ile ilgili yazılım Kemiluminesan için bir Kemiluminesan tarafından elde.

3. Fosfataz tahlil

  1. (Kimden adım 2.5) hücre lysates ile alkalen fosfataz alkalen fosfataz arabellekte tedavisi.
    1. İçeren 20 µg toplam protein hem de kontrol ve tedavi örnekleri, 20 µL hazırlamak için örnekler. Ardından 2 µL alkalen fosfataz arabellek ve 10 µL alkalen fosfataz 20 µg toplam protein içeren hücre lysates hacmi ekleyin. Kadar 20 µL distile su ekle.
  2. 1 h. durdurmak 50 mM son bir konsantrasyon ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyerek veya sodyum orthovanadate (Na 3 VO 4) 10 mM son bir konsantrasyon ekleme için tepki örnekleri 37 ° C'de kuluçkaya. Tepki de Isıtma 75 ° c 5 dakika süreyle tarafından durduruldu
  3. Fosfataz örnekleriyle kuluçka bitirmeden önce aynı toplama örnekleri fosfataz fosfataz tedavi örnekleri ile karşılaştırma için eklemeden hazırlayın.
  4. Ekle taze hazırlanmış 4 X SDS jel-yükleme arabellek içeren 400 mM DTT.
  5. Bir girdap kullanarak örnekleri örnekleri 5 dk. Mix için 100 ° C'de ısı blokta kuluçkaya. Serin için oda sıcaklığında ~ 10-15 dk.
  6. % 10 polyacrylamide jel SDS-PAGE tarafından çalıştırmak için bir Elektroforez Sistemi montajı.
    1. % 10 polyacry iyi başına yük 10 µg protein (13 µL örnek)lamide jel. Molekül ağırlıklı merdiveni yük.
    2. Örnek yükledikten sonra pozitif ve negatif elektrotlar Elektroforez Sistemi sabit voltaj korumak için bir güç kaynağına bağlayın. Başlangıçta, 70 V 20 dk için protein örnekleri yığın jel çözme jel taşımak başlangıç. Daha sonra 125 V gerilim artırmak ve örnekleri ve protein merdiven jel sonuna ulaşana kadar yaklaşık 70-120 dakika için jel çalıştırın.
    3. Islak electroblotting sistemini kullanarak PVDF membran üzerine Jel Elektroforez tamamlanmasından sonra transfer. Aktarım için ~ 100 dk 100 V.
    4. Leke küçük molekül ağırlıklı merdiven üstünde belgili tanımlık yan kesim yaparak mark. Leke kesim için şeffaf plastik levha ve keskin kesici kullanın.
  7. % 4 BSA engelleme arabelleği 90 dakika oda sıcaklığında membran engellemek.
  8. Gecede İlköğretim-antikor çözümü (1:5, 000 Anti-tau) 4 ° C'de blot kuluçkaya. Leke PBST içinde dört kez, 7 dk her yıkayın.
  9. İlgili ikincil-antikor çözüm (keçi Anti-fare IgG 1:5, 000) hazırlamak ve 90 dakika oda sıcaklığında leke kuluçkaya. PBST içinde dört kez, 7 dk her yıkayın.
  10. Geliştirmek üreticiye göre bir Kemiluminesan kit kullanarak leke ' s öneriler. Leke içinde şeffaf plastik bir şal örtmek. Görüntüleri görüntüleme sistemi ile ilgili yazılım Kemiluminesan için bir Kemiluminesan tarafından elde.

4. Mikrotubul bağlama tahlil

  1. Mikrotubul bağlama tahlil için adımları yineleyin 2.1-2.6.
  2. Hazırla 1 X 10 X PEM arabellek (2 mL) PEM arabelleğinden 4 ° C'de 20 µM (40 µL) Paklitaksel ve 1 mM (20 µL) GTP ekleyerek saklı. Mikrotubul üzerinden (MT) hisse senedi almak − 80 ° C dondurucu ve E. coli tau çalışma stoktan − 20 ° C dondurucu.
  3. Hazırlamak örnekleri göre Tablo 1.
  4. 37 ° C'de 30 dk. Ultracentrifuge 60 dk az 100.000 x g için 25 ° c için kuluçkaya.
  5. İçeren supernatants transfer 120 µL tau temizlemek için ilişkisiz ve tüpler etiketli.
  6. 5 X 120 eklemek µL (aynı birim olarak süpernatant) ilişkili tau içeren Pelet arabelleğe örnek ve iyice karıştırın. Etiketli tüpler temiz ve iyice karıştırın çözüm transfer.
  7. Ölçmek protein konsantrasyonu (bkz. Adım 2.6).
    Not: örnekleri hazırlarken, çözüm (Adım 4.6) hacmi Pelet hem süpernatant örnekleri hazırlamak için kullanın.
  8. Hazırlamak eşdeğer protein konsantrasyonu örnekleri ve taze hazırlanmış 4 x SDS jel-yükleme arabellek DTT (400 mM) içeren ekleyin.
    Not:-Ebilmek var olmak stok örnekleri, −, bu aşamada 20 ° C.
  9. 3.5-3.10 adımlarını yineleyin.
< td colspan = " 2">
örnek adı gerekli mikrotubul ana Protein gerekli PEM-GTP-PTX
1 HCT 116-kontrol (6.21 μg/μl) 2 μl 9.66 μl (60 μg) 108.34 μl
2 HCT 116-Curcumin 10 mikron (4,81 μg/μl) 2 μl 16.63 μl (80 μg) 101.37 μl
3 HCT 116-Curcumin 20 mikron (3.28 μg/μl) 2 μl 30.49 μl (100 μg) 87.51 μl
4 HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) 2 μl 18.42 μl (100 μg) 99.58 μl
5 E. coli tau 2 μl 1 μl Tau-352 117 μl
6 MT sadece 2 μl X 118 μl
120 μl

Tablo 1: örnek Mikrotubul bağlama tahlil için hazırlık.

5. Yerelleştirme ve ifade Tau Curcumin içeren hücreleri tedavi sonra

  1. % 70 etanol kullanarak bir coverslip temiz ve kuru bir laboratuvar doku kullanarak. Bir tek coverslip etiketli 6-iyi doku kültürü plaka her kuyuya yerleştirin. Plaka biyolojik bir emniyeti dolap yerleştirin ve UV ışığı en az 3 h. geçiş
  2. Alt kültür hücreleri ve onları 2. 5 x 10 5 hücreleri/iyi önerilen kültür ortamında, 6-şey plaka ilgili kuyu tohum.
  3. ~ 24 h sonra hücresel morfolojik değişiklikleri denetlemek için X 10 ve 40 X hedefleri kullanarak ters bir mikroskop kullanarak hücreleri incelemek. Gerekirse kaydetmek fotoğraf.
  4. İki kez PBS kullanarak hücreleri durulayın. % 3.7 formaldehit 37 ° C kuluçka karanlık hücrelerde düzeltmek.
    Not: Fiksasyon formaldehit oda sıcaklığında tarafından çok iyi çalışıyor. Formaldehit işleme uygun kişisel koruyucu ekipman giyerler.
  5. PBS hücrelerde yıkayın. Buz gibi metanol hücreleri tamir − 15 dakika süreyle 20 ° C Permeabilize hücreleri % 0,1 ile % 3 BSA kuluçka tarafından PBS 10 dakika süreyle buzda Triton X-100 yıkama PBS hücrelerle.
  6. Kuluçkaya engelleme arabellek hücrelerde (% 3 BSA ve % 0.1 ara-20 PBS çözümünde) oda sıcaklığında 1 h için.
    Not: Kuluçka 4 ° C'de 2 h için iyi, çok çalışıyor.
  7. % 3 BSA ve % 0.1 İlköğretim-antikor (1: 200, Anti-tau) çözüm hazırlamak ara-20 PBS (örneğin, 2 µL tau-13 antikor 0.4 mL arabelleği).
  8. Bir PVDF küçük parçalar koparıp membran parçaları düzgün 6-şey plaka; her şey içinde uygun böylece emmek onları suda 5 dk. yer her şey içinde kesik PVDF.
  9. Ekleyin 60 µL kesme için birincil antikor çözümün PVDF parçalar halinde her şey. Öyle ki hücreleri İlköğretim-antikor çözüm dokunabilir miyim coverslips yerleştirin. Karanlık, nemli odasında 4 ° C'de gecede kuluçkaya. PBS içinde dört kez yıkayın.
  10. % 3 BSA ve % 0.1 ikincil-antikor çözüm (fluoresein Birleşik 594 Anti-fare IgG 1: 400) hazırlamak ara-20 PBS.
  11. Parçaları düzgün 6-şey plaka her şey içinde uygun ve her şey içinde kesik PVDF suda 5 dk. yer onları emmek PVDF membran küçük parçalar koparıp.
  12. Ekleyin 80 µL ikincil-antikor çözüm her 6-şey plaka PVDF parçaları için. Öyle ki hücreleri ikincil-antikor çözüm dokunabilir miyim coverslip yerleştirin. 2 h. PBS ile yıkama için oda sıcaklığında karanlık, nemli bir odasında dört kez kuluçkaya.
  13. Mount örnekleri 4 montaj orta ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve düzeltme coverslips cam slaytlara. Cam slaytlara DAPI ile montaj orta
    1. Ekle bir damla. Coverslips her kuyudan çıkarın ve onları DAPI ile montaj orta içeren cam slaytlara yerleştirin. Yarış lekeli hücreleri içeren her coverslip yüzeyine dokunduğundan emin olunTing orta karşılık gelen cam slaytta.
    2. Uygula tüm her coverslip mühür ve bunları düzeltmek için çevresinde hava geçirmez Cam slaytlara cilası. Gerekirse, iki kez bu adımı yapmak.
  14. Incubate 1,5 saat karanlık bir oda oda sıcaklığında için.
  15. Coverslip karanlık bir odada daldırma yağ kullanarak confocal bir mikroskop kullanarak slaytları inceleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toplam tau ve fosfo-tau ifadesi curcumin veya LiCl (şekil 1) farklı konsantrasyonları hücrelerle tedavi sonra incelenmiştir. Hücre tedavisi curcumin üç farklı konsantrasyonları ile tau ifade seviyeleri azalma; Ancak, fosfo-tau ifade curcumin düşük konsantrasyon ile tedavi üzerine artmış ama daha yüksek curcumin konsantrasyonları hücrelerle tedavi üzerine düşmüştür. Anti-fosfo-tau (Ser396) fosfo-tau tespiti için kullanıldı. LiCl (şekil 1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması toplam tau algılamak için farklı yordam koşullar kurulmuş ve tau curcumin ve LiCl ile tedavi kolorektal kanser hücrelerinde fosforile. Tau protein örneklerinde genel fosforilasyon durumunu değerlendirmek için fosfataz tahlil tanımlanmıştır. Bu tahlil herhangi bir protein fosforilasyon durumunu incelemek için kullanılabilir.

Bu tahlil protein hamle sigara fosforile durumuna yavaş fosforile ilkesine dayanır. Alkalen fosfataz ve alkalen fosfataz arabellek bu protokol için kullanılır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar ifşa birşey yok bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projenin bir parçası 'Kalkınma ve sanayileşme yüksek değer kozmetik hammadde deniz mikroalg' başlıklı, okyanuslar Bakanlığı ve balıkçılık, Kore tarafından finanse edilen ve intramural grant (2Z04930) tarafından desteklenen bu araştırma gerçekleştirildi Doğal ürünlerin KIST nin Gangneung Enstitüsü '.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HCT 116 hücreliATCCCCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Fetal Sığır Serumu (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044-20 ° C'de saklayın; C
penisilin-streptomisinHipklonSV30010
Tripsin-EDTA çözeltisiWelGeneLS 015-01
100 mm çanakCorning430161
6 kuyulu plakaCorningCoster 3516
Anti-Tau 13 antikorabcamab19030
Ditiyotreitol (DTT)Roche10 708 984 001Depolama Sıcaklığı 2– 8 & derece; C
Mikrolitre SantrifüjlerHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaklitakselSigma-AldrichT1912Depolama Sıcaklığı 2– 8 & derece; C
CurcuminSigma-Aldrich (Fluka)78246Depolama Sıcaklığı 2– 8 & derece; C
Mikrotübüller (MT)Hücre iskeletiMT0014 > C (kurutulmuş)
Vector LaboratoriesH-1200ile Montaj Ortamı4 > Karanlıkta C
Sodyum hidroksitSigma72068
Magnezyum KlorürSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877-20 ° C'de saklayın; C
DPBSWelGeneLB 001-02
Sonik AyırıcıFisher ScientificModel 500
UltrasantrifüjBeckman CoulterOptima L-100 XP
BORULARSigmaP1851
Sığır serum Albümini (BSA)SigmaA7906
Moleküler GörüntüleyiciBio-RadChemiDoc XRS +4 & derecede saklayın; C
Protein tahlili boya reaktifiBio-Rad500-0006
&alfa;-tubulin (11H10) Tavşan mAbHücre sinyali2125
GAPDH (14C10) Tavşan mAbHücre sinyali2118
Anti-Tau (fosfo S396) antikoruabcamab109390
EGTASigmaE3889Oda sıcaklığında saklayın
FastAP Isıya Duyarlı Alkalin FosfatazThermo ScientificEF0651-20 ° C'de saklayın; C
PMSFSigmaP7626Oda sıcaklığında saklayın
Fosfataz İnhibitörü KokteylHücresi Sinyalizasyonu5870° C'de saklayın; C
Proteaz İnhibitörü KokteylHücresi Sinyalizasyonu58714 &°C'de saklayın; C
RIPA TamponSigmaR 0278Depolama Sıcaklığı 2– 8 & derece; C
Tau-352 insanSigmaT 9950Mağaza -20 &°C'de; C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Mağaza yaklaşık 25 > C
PVDF membranBio-Rad162-0177
Keçi anti-fare IgG İkincil AntikorThermoFisherA-110054 &°C'de saklayın; Karanlıkta C
Konfokal MikroskopiLeicaMikrosistem Leica TCS SP5
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)Affymetrix75819
Protein TestiBio-Rad500-00064 & derecede saklayın; Ç
DAPI 4

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526(2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
  29. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  30. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  31. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  32. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  33. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  34. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  35. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  36. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  37. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  38. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  39. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864(2014).
  40. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  41. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  42. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  43. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  44. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  45. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  47. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  48. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  49. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  50. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9(2016).
  51. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tau FosforilasyonuTau LokalizasyonuKonfokal MikroskopiWestern BlotFosfataz Analizimm nohistokimyaKurkumin TedavisiLityum Klor r

İlgili makaleler