Method Article

Membran yuvası arıtma için çapraz-sunudaki eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulma

DOI:

10.3791/55949

⸱

August 21st, 2017

 ,  ,  , 
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan nerede eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili düşmesine çapraz-sunum tarafından işlenen hücresel kompartmanlarda arıtma için izin verir yeni bir vezikül yalıtım Protokolü yöntemidir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritik hücreler (DC) işleme ve MHC sınıf (MHC) üzerine içselleştirilmiş eksojen antijen sunan son derece yetenekli ben moleküller olarak da bilinen çapraz-sunum (CP). CP çalış önemli bir rol sadece saf CD8 uyarılması+ T hücreleri ve bellek CD8+ T hücreleri için bulaşıcı ve tümör bağışıklığı ama aynı zamanda kendiliğinden hareket inactivation saf T hücreleri tarafından T hücre anerji veya T hücre silme. Her ne kadar aydınlatılmamıştır için CP kritik moleküler mekanizması kalır, biriken kanıtlar eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulması ile (ERAD) klasik olmayan ihracat sonra endositik işlenir gösterir bölmeleri. Çünkü eksojen antijenlere başka hiçbir belirli moleküler işaretleri vardı yakın zamana kadar bu endositik bölmeleri karakterizasyonu sınırlıydı. Burada açıklanan endositik bu bölmeleri arıtma için izin verir yeni bir vezikül yalıtım Protokolü yöntemidir. Bu saf microsome kullanarak, biz ERAD benzeri taşıma, ubiquitination ve eksojen antijen vitro, işlenmesi Ubikuitin-proteasome sistemi ihracat bundan sonra eksojen antijen işleme düşündüren yeniden düzenlendi hücresel bölme. Bu iletişim kuralı daha fazla CP moleküler mekanizması netleştirmek için diğer hücre tipleri için uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MHC ı molekülleri ile kısa antijenik peptidler sitozol1Ubikuitin-proteasome sistemi tarafından işlenen endojen antijenleri türetilen tüm çekirdekli hücrelerin yüzeyinde ifade. İşlendikten sonra antijenik peptidler endoplazmik retikulum (ER) Lümen DOKUNUN peptid taşıyıcı tarafından taşınmaktadır. ER Lümen peptid yükleme ve doğru katlanır MHC ben karmaşık bir dizi belirli chaperones yardım. Molekülleri bu dizi acil servis merkezi a bölme için yükleme MHC ben2peptid olduğunu belirten peptid-yükleme karmaşık (PLC) denir. Yükleme, peptid MHC sonra ben moleküller hücre yüzeyine taşınır ve bir anahtar edinilmiş bağışıklık siste....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. büyüyen hücreler ve ayrıca eksojen antijenleri

bir biotin proteinli etiketleme kullanarak
  1. hazırla bOVA kit üretici takip ' s protokolü.
    Not: Normalde, ortalama 1 M OVA başına 2 M biotin bOVA içerir.
  2. RPMI-1640 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 0,1 mM gerekli olmayan amino asitler, 100 U/mL penisilin-streptomisin, 55 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) ve 5'te 37 ° C'de % 10 fetal buzağı serum (bundan sonra RPMI) ile takıma hücrelerde DC2.4 büyümek % CO 2 oksijen kuluçka (bundan sonra söz, hücreleri bu durum inkübe). DMEM % 10 fetal buzağı serum, 3.7 g/L NaHCO 3 (bundan sonra DMEM) yerine RPMI ile takı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CP moleküler mekanizması aydınlatmak için nerede eksojen antijenleri ERAD benzeri taşıma ve işleme tabi hücresel kompartmanlarda tanımlamak gereklidir. Gözlemler immünfloresan mikroskopi veya elektron mikroskobu nerede eksojen antijenleri16,17,18,19birikmiş hücresel yuvası tespit ederken, 30,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CP önceki çalışmalarda, immünfloresan mikroskobu16,30,31,32tarafından geç endosome veya ER kısıtlı alana eklenen eksojen antijenleri birikmiş. Hücresel yuvası Sükroz veya iodixanol yoğunluk gradient Santrifüjü kullanarak tanımlandığı gibi bu ERAD benzeri taşıma ve işleme eksojen antijenleri ER veya geç endosome, bu özel alanlarda yapılmaktadır olduğunu tahmin edilmektedir ubiquitinated bOVA ERA.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Takasaki Üniversitesi Sağlık ve refah tarafından desteklenir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640yaşam teknolojileri tarafından gibco11875-093
Fetal sığır serumuEquitech bioSFB30
piruvatgibco11360-070
MEM esansiyel olmayan amino asitleryaşam teknolojileri tarafından gibco11140-050
HEPES yaşam teknolojileri tarafından gibco15630-080
2-MerkaptoetanolGibco21985-023
L-glutamingibco25030-164
Penisicillin-Sreptomisingibco15140-122
DMEMgibco12100-46
OVASIGMAA5503
Biyotin-protein etiketleme kitiThermo Fisher ScientificF6347
MG-132Santa Cruz Biyoteknoloji201270
laktacystinSIGMAL6785
Dounce homojenizatörIUCHI131703
proteaz inhibitörü kokteylleriSIGMAP8340
iyodiksanolCosmo bio1114542
SA-manyetik boncuklarNew England Biolabs201270
kontrol manyetik boncuklarChemagenM-PVA012
manyetik standBD Biosciences552311
BCA protein tahlil kitiThermo Fisher Scientific23225
gümüş boyama kitleriCosmo bio423413
Retikülosit LizatPromega
Bayrak etiketli ubikitinSIGMAU5382
anti-ovalbümin (OVA, fare)Antikor DükkanıHYB 094-06
karınca-çoklu ubikitin (fare)MBLD058 & eksi;
anti-Bayrak (fare)SIGMAF3165
tripsinSIGMA85450C
Yaşam teknolojileri tarafından sodyumYaşam Teknolojileri tarafından Yaşam Teknolojileri tarafındanYaşam Teknolojileri tarafındanYaşam Teknolojileri tarafından17307143

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cross presentationEndoplasmic Reticulum associated DegradationExogenous Antigen ProcessingDendritic Cell IsolationVesicle Purification ProtocolMicrosome PreparationERAD like TransportUbiquitination AssayAntigen PresentationCellular Compartment Purification

Related Articles