Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre yüzey proteinleri çok çeşitli fonksiyonlara aracılık eder. Çoğu durumda, faaliyetleri plazma membranındaki seviyelerini modüle eden endositik işlemlerle düzenlenir. Burada, bu süreçlerin çalışmasını kolaylaştıran 2 yöntem için ayrıntılı protokoller sunuyoruz, her ikisi de hücre yüzeyi proteinlerinin biyotinleştirilmesi ilkesine dayanmaktadır. İlki hücre yüzeyinde belirli bir proteinin göreli düzeylerinin yarı niceliksel olarak belirlenmesine izin vermek için tasarlanmıştır. İçinde hücrelerin plazma membran proteinlerinin lisin artıkları önce bir biotin kısmı ile etiketlenir. Hücreler ayrıldıktan sonra, bu proteinler daha sonra agarozla hareketsiz hale getirilen streptavidin kullanımı ile biyotin için ikinci afinitenin doğal afinitesini istifade ederek spesifik olarak çöktürülebilir. Böyle bir şekilde izole edilen proteinler daha sonra standart bir western blotlama yaklaşımı ile analiz edilebilir. İkinci yöntem, bir partikülün endositik hızını belirleme aracı sağlarAr hücre yüzeyi hedefinin belirli bir zaman süresi boyunca. Hücre yüzey proteinleri, ilk olarak, bölünebilir bir disülfid bağı içeren bir biyotin türevi ile modifiye edilir. Hücreler daha sonra biyotinlenmiş proteinlerin bir kısmının endositik alımına neden olan normal kültür koşullarına geri kaydırılır. Daha sonra, içe geçmemiş biyotin gruplarının disülfür bağları, membrana geçirimsiz redüksiyon maddesi glutatyon kullanılarak indirgenir. Bu yaklaşım vasıtasıyla, endositize proteinler izole edilebilir ve yüksek bir özgüllük derecesi ile nicelleştirilebilir.
Giriş
Hücrenin yüzeyindeki proteinler, hücre işlevini sürdürmek için merkezi rol oynarlar. Birçok durumda, bunların aktiviteleri, onları geçici olarak hücre içi bölgede tutan ya da bozunma yolları 1 , 2 , 3 , 4 , 5'e yönlendiren endositik süreçlere bağlıdır veya modüle edilir. Burada, kullanıcıya, plazma zarında eksprese edilen proteinleri ve yeni içselleştirilen proteinleri özel olarak etiketlemek ve izole etmek için tasarlanmış 2 biyotinilasyon temelli yaklaşımları vurguluyoruz. Bu yöntemlerle, ilgili herh....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Astrositlerdeki Bağıl Hücre-Yüzey Protein Ekspresyonunun Biyotinleme ile Saptanması
NOT: Burada, bu biyotinleme tekniğinin hücre geçirgen matris molekülünün laminin'in su geçirgen kanal aquaporin-4'ün (AQP4) hücre yüzeyi lokalizasyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine uygulanışını göstermektedir. Bu deney için gereken uzmanlık gerektiren materyaller arasında sülfo-NHS-LC-biyotin ve streptavidin-agaroz reçinesi bulunur (bkz . Malzeme Tablosu ).
- Noel ve ark. 12 , tahlilden yaklaşık 2 hafta önce kortikal astrositler kültürleri hazırlayın ve bunları 75 cm2 havaleli kültü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Astrositlerdeki AQP4'ün plazma membran ekspresyonunu değerlendirmek için hücre yüzeyi biotinilasyonunun kullanılması
Laminin ile muamele edilmiş astrosit kültürleri ve muamele edilmemiş kontrol hücreleri tarif edilen yöntemler kullanılarak hücre yüzeyi biotinilasyonuna tabi tutuldu. Biyotinlenmiş proteinler, agaroz-konjuge streptavidin ile çöktürüldü ve daha sonra SDS-PAGE vasıtasıyla ayrıldı. Hücre yüzeyi fraksiyonları AQP4 ve β-distroglikan (β-DG) için bir h.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Değişiklikler:
Bu yöntemler yapışık hücrelerle birlikte kullanılmak üzere tasarlandığından, 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve
Yıkama basamakları için ve hücrelerin kültür yüzeyine yapışmış olmasını ve hücre-hücresi bağlantılarının bozulmamasını sağlamak için belirli tamponların tabanı olarak, 100 mg / L CaCI2 (CM-PBS). Bununla birlikte, protokoller, hücreler prosedürünün her bir adımı arasında pelet yapılıyorsa, yapışkan olmayan hücre tiplerine de uygulanabilir. Bu gibi duru.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
Bu proje, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü PG # 20R47867 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Amonyum klorür (NH < alt > 4 < / alt > Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromofenol mavisi | Bio-Rad | # 1610404 | |
| tam proteaz inhibitörü kokteyli | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodyum Etilendiamintetraasetat dihidrat ( EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Gibco / Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Gliserol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glisin | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| İyodoasetamid | Bio-Rad | # 163-2109 | |
| Engelbreth-Holm-Swarm murin sarkomu bazal membrandan | laminin Sigma-Aldrich | L2020 | Buz üzerinde çözülme. |
| L-glutamin | Gibco / Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Fare monoklonal anti-β-aktin antikoru (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Fare monoklonal anti-β-distroglikan antikoru (43DAG1 / 8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penisilin / streptomisin | Gibco / Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroksidaz AffiniSaf Eşek anti-Fare IgG (H + L) | Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları | 715-035-150 | |
| Peroksidaz AffiniSaf Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) | Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları | 111-035-045 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Gibco / Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Azaltılmış glutatyon | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodyum klorür (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 ve nbsp; | |
| Sodyum hidroksit (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agaroz reçinesi | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Tavşan poliklonal anti-AQP4 antikoru | Alomone | AQP-004 | |
| Tris tabanı (Trizma tabanı) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Bilimsel | BP151-500 |
Kaynaklar
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
