Method Article

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

DOI:

10.3791/56003

⸱

November 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otolog hücre tabanlı terapiler gerçeklik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler getirilmesi ile bir adım daha var. Cenin kök hücre, amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal Kök hücre, gibi farklılaşmamış hücreleri söz doku Mühendisliği ve gelecekteki Pediatrik müdahaleler ve kök hücre Bankacılığı IPSC içine yeniden programlama için benzersiz bir tür temsil eder. Burada sunulan Protokolü ayıklamak için en iyi duruma getirilmiş bir yordam açıklanır ve birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal Kök hücre kültürü çalışmalarının ve episomal üreten tamamen kimyasal olarak tanımlanmış kültür bu hücreler pluripotent kök hücrelerden indüklenen insan rekombinant vitronectin ve E8 orta kullanan koşullar. -Akış Sitometresi, confocal görüntüleme, teratoma oluşumu ve transkripsiyon profil oluşturma – sıkı yöntemleri uygulayarak yeni satırlar karakterizasyonu ayrıca açıklanmıştır. Yeni oluşturulan satırları işaretleri embriyonik kök hücre – Oct3/4A, MicroRNAs, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4-SSEA-1 işaretçisi için negatif olurken hızlı. Kök hücre hatları teratomas scid-bej farelerde 6-8 hafta içinde oluşturmak ve teratomas doku tüm üç germ katmandan temsilcisi içerir. Transkripsiyon hatlarını profil oluşturma genel ifade Mikroarray veri bioinformatic pluripotency değerlendirme algoritması göndererek tüm satırları pluripotent sayılır ve bu nedenle, bu yaklaşım hayvan test için cazip bir alternatif. Yeni IPSC hatları kolayca ayırt etme ve doku Mühendisliği optimizasyonu içeren aşağı akım deneylerde kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) potansiyel hücre replasman tedavileri, hastalık ve gelişimsel modelleme ve uyuşturucu ve toksikolojik tarama1,2,3hakkında görülmemiș. Yedek terapiler kavramsal olarak hücre enjeksiyon tarafından elde edilebilir, In vitro doku (örneğin kalp yamalar) implantasyon ayrıştırılan veya rejenerasyon doku Mühendisliği aracılığıyla rehberlik. Amniyon sıvısı (AFSC) ve membran kök hücre (AMSC) olan hücreler bu müdahaleler için mükemmel bir kaynak ya da doğrudan4,5,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolü Etik Komitesi insan araştırma için kurumsal kuralları izler. Hastanın yazılı izni amniyotik sıvı araştırma için kullanmak için elde edildi.

Bu iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi South Alabama Üniversitesi politikaları izler.

1. izolasyon ve kültür birincil amniyotik Mezenkimal Kök hücre

  1. Amniyotik sıvı hücre kaplama
    1. En az 2.5 mL Amniyosentez sürecinde bir hekim tarafından hasat amniyotik sıvı elde edilir.
      Not: Canlı hücre ve doku tüm işlemenin bir steril doku kültürü dolapta gerçekleştirilmesi gerekir ve uygun kişisel koruyucu ekipman kulla....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bilinçli yazılı onayı için genetik test amaçlı ve araştırma için sıvı küçük bir aliquot ithaf amniyotik sıvı hasat önce hastalardan elde edildi. Plasenta tıbbi atık temsil eder gibi hiçbir onayı araştırma amniyotik membran kullanımı için gereklidir. Amniyotik sıvı ve membran kök hücreler tipik Mezenkimal özelliklerini görüntülemek, morfolojik hücrelerine seklinde ve faz parlak. Yeniden programlama, üzerine hücreler Mezenkimal-için-epitel (MET) geçiş geçmesi ve Arnavut kaldırımı benzeri mo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cenin kök hücre nesilden IPSC başlangıç aşamasında kaynak hücreleri ayıklama fetal dokularda, kültür, genişleme ve episomal programlama plazmid getirilmesi üzerine kuruludur. Bu aşama yaklaşık 14-18 gün önce ilk tam olarak programlanmış kolonileri genişletilebilir bir kültür döneme göre izlenir. Olgunlaşma IPSC klonların son aşamasıdır. Amniyotik membran kök hücre ilk çıkarma bir kombine mekanik ve Enzimatik sindirim amnion aracılığıyla elde edilir. Bulduğumuz bu hücre ile en yüksek canlılık çıkarılan en yüksek sayısı 30.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Fonds Medizinische Forschung Zürih Üniversitesi, Forschungskredit Zürih Üniversitesi, SCIEX NMSCh altında Arkadaş grupları 10.216 ve 12.176, Swiss, Kardiyoloji Derneği, İsviçre Ulusal Bilim tarafından desteklenmiştir Kuruluşu'nun altında Grant [320030-122273] ve [310030-143992], 7. çerçeve programı, hayat Vana, Grant [242008], Olga Mayenfisch Vakfı, EMDO Vakfı, Zürih Üniversitesi Hastanesi açılış hibe 2012 Avrupa Komisyonu ve iç Mitchell Kanser Enstitüsü finansman.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tümör Ayrışma Kiti, insanMiltenyi Biotec130-095-929doku ayrışma sistemi, reaktif kiti, doku ayrışma tüpleri ve doku ayrışma enzimleri içerir
gentleMACS AyrışmaMiltenyi Biotec130-093-235doku ayrışma sistemi, ayrışıcı
Thermo Scientific & Shandon ve ticaret; Tek Kullanımlık Neşter No. 10, Steril, Ayrı Sarılmış, 5.75 (14.6cm)Thermo-Fisher3120032
70 & m hücreli süzgeçlerCorning10054-456
RPMI 1640 orta boyThermo-Fisher32404014 
sallanan platformVWR40000-300
50 ml santrifüj tüpleriThermo-Fisher339652
15 ml santrifüj tüpleriThermo-Fisher339650
EBM-2 bazal ortamAFMCCC-3156bazal ortam
(E. coli olarak ifade edilir, glikosile edilmemiş)Prospec BioCYT-218bFGF, AFMC orta
EGF İnsan, PichiaProspec BioCYT-332 için ek;EGF, AFMC ortamı için takviye
LR3 İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü-1 İnsan RekombinantProspec BioCYT-022IGF, AFMC orta
Fetal Sığır Serumu, embriyonik kök hücre nitelikliThermo-Fisher10439024FBS
Antibiyotik-Antimikotik (100X)Thermo-Fisher15240062 primer AFSC / AMSC için, rutin AFSC / AMSC için gerekli olmamalıdır, transfekte edilmiş hücreler için ortamda kullanmayın!
Accutase hücre dekolmanı çözümüStemCell Technologies07920hücre dekolmanı enzimi
CryoStor ve ticaret; CS10StemCell Technologies07930tam dondurma ortamı
PBS, pH 7.4Thermo-Fisher Scientific10010023 
EndoFree Plazmid Maxi Kiti (10)Plazmit izolasyonu içinQiagen12362
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K, yeniden programlama faktörleri Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K, yeniden programlama faktörleri Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L, yeniden programlama faktörleri c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis SpektrofotometreThermo-FisherND-2000Cspektrofotometre
Neon® Transfeksiyon SistemiThermo-FisherMPK5000transfeksiyon sistemi, bileşenler: < br / > Neon pipet - transfeksiyon pipeti
Neon cihazı - transfeksiyon cihazı
Neon & reg; Transfeksiyon Sistemi 10 & mikro; NeonThermo-FisherMPK1025sarf malzemeleri kiti, şunları içerir:
Neon uç - transfeksiyon ucu
Neon tüp - transfeksiyon tüpü
tamponu R - yeniden süspansiyon tamponu < br / > tamponu E - elektrolitik tampon
Stemolekül ve ticaret; Sodyum ButiratStemGent04-0005yeniden programlanmasının küçük molekül arttırıcısı
;Kök Hücre Teknolojileri07180VTN, stok konsantrasyonu 250 & g / ml, 1 & mikro'da kaplama için kullanılır; g / cm < sup> 2 < / sup> vitronektin seyreltme (CellAdhere) tamponu
CellAdeve ticaret; Seyreltme TamponuKök Hücre Teknolojileri07183vitronektin seyreltme tamponu
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo-Fisher15575020kullanmadan önce PBS ile 0.5 mM'ye seyreltin
EVOS® FL Görüntüleme SistemiThermo-Fisher ScientificAMF4300 LCD görüntüleme mikroskop sistemi
CKX53 Ters MikroskopOlympusfaz kontrast hücre kültürü mikroskobu
Pierce & trade; %16 Formaldehit (w/h), Metanol içermeyenThermo-Fisher28908kullanmadan önce PBS ile %4'e seyreltilir, seyreltilmiş 2-8 °C'de saklanabilir; 1 hafta boyunca C
Perma Tamponu IIIBD Biosciences558050geçirgenlik tamponu, -20 ° C'ye kadar soğutun; C kullanmadan önce
Fare IgG1, κ İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 488BD Biosciences557782Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, &kappa için izotip kontrolü; İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 647BD Biosciences557783Sox2
Fare anti-insan Oct3/4 (İnsan İzoform A), Alexa Fluor® 488BD Biosciences561628
Fare anti-insan Nanog, Alexa Fluor® 488BD Biosciences560791
Fare anti-insan Sox-2, Alexa Fluor® 647BD Biosciences562139
Fare IgGM, κ İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 488BD Biosciences401617TRA-1-60
Fare IgGM, &kappa için izotip kontrolü; İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401618TRA-1-81
Fare anti-insan TRA-1-60, Alexa Fluor® 488BD Biosciences330613
Fare anti-insan TRA-1-81, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330705
Mouse IgG1, κ İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 488BD Biosciences400129SSEA-1
Fare IgG3, &kappa için izotip kontrolü; İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401321SSEA-4
Fare anti-insan SSEA-1, Alexa Fluor® 488BD Biosciences323010
Fare anti-insan SSEA-4, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330407
Affinipure F(ab')2 Parça Keçi Anti-Fare IgG + IgM, Alexa Fluor® 488Jackson İmmünoaraştırma115-606-0681:600 seyreltmede kullanın veya daha fazla optimize
edin Affinipure F(ab')2 Parça Keçi Anti-Fare IgG+IgM, Alexa Fluor® 647Jackson Immunoresearch115-546-0681:600 seyreltmede kullanın veya
DAPIThermo-Fisher ScientificD21490stok çözeltisini 10 mM optimize edin, çalışan bir çözelti için 1:12.000'e kadar seyreltin
Corning® Matrigel® Büyüme Faktörü Azaltılmış, Fenol Kırmızısı İçermeyenCorning356231bazal membran matrisi (BMM)
scid-bej fareler, dişiTaconicCBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)Qiagen74134RNA izolasyon kiti
T-25 şişeleri, doku kültürü ile muamele edilmişThermo-Fisher156367
T-75 şişeleri, doku kültürü ile muamele edilmişThermo-Fisher
Nunc™ doku kültürü kabıThermo-Fisher12-567-650 10 cm doku kültürü kabı
6 oyuklu plakalar, doku kültürü ile muamele edilmişThermo-Fisher140675
Neubauer sayma odası (hemasitometre)VWR15170-173
Mr. Frosty™ Dondurma kabıThermo-Fisher5100-0001 dondurma kabı
FACS tüpleri, Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, 5mlCorning3520585 ml polistiren tüpler
Eppendorf tüpleri, 1.5 mlThermo-Fisher05-402-961.5 ml mikrosantrifüj tüpleri
PCR tüpleri, 200 ve mikro; lThermo-Fisher14-222-262
pipet uçları, 100 ila 1250 &mikro; lThermo-Fisher02-707-407dar delikli 1 mL uçlu
pipet uçları, 5 ila 300 & mikro; lThermo-Fisher02-707-410
pipet uçları, 0,1 ila 10 & lThermo-Fisher02-707-437
geniş çaplı pipet uçları, 1000 & lVWR89049-166geniş delikli 1 mL uçlu
cam Pasteur pipetleriThermo-Fisher13-678-20A
etanol, 200 geçirmezThermo-Fisher04-355-451
vorteks karıştırıcıVWR10153-842
odacıklı kapak camı, 8 kuyulu, 1,5 mm borosilikat camThermo-Fisher155409cam tabanlı konfokal dereceli kültür gereçleri
22G iğnelerVWR82002-366
insülin şırıngalarıThermo-Fisher22-253-260
Formalin çözeltisi, nötr tamponlu,% 10Sigma-AldrichHT501128-4Leksplante edilmiş teratomların fiksasyonu
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChipIlluminaBD-103-0204ekspresyon mikrodizisi, PluriTest tarafından desteklenen, üretici tarafından durduruldu
PrimeView İnsan Genomu U219 Dizi PlakasıThermo-Fisher901605ekspresyon mikrodizisi (eski adıyla Affymetrix markası), yakında PluriTest
GeneChip&trade tarafından desteklenecek; İnsan Genomu U133 Plus 2.0 ArrayThermo-Fisher902482ekspresyon mikrodizisi, CellNet tarafından desteklenen, yakında PluriTest tarafından desteklenecek
PluriTest®Pluripotentliğin biyoinformatik değerlendirmesi için ücretsiz hizmet olan Coriell Institute www.pluritest.org, mikrodizi verilerini kabul eder - HT-12 v4 platformundan *.idat dosyaları, yakında U133, U219 mikrodizi ve RNA dizileme verilerini destekleyecek
Verileri sıralama
ortamı FGF 2 İnsan için Lonza Transfeksiyon Sistemi için L Kit TeSR-E8 Kök Hücre Teknolojileri 05940 E8 ortamı Vitronektin XF ve ticaretin 156499 CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu, U133 mikrodizi verilerine dayalı plütipotent kök hücreler de dahil olmak üzere hücre tipinin biyoinformatik tanımlanması için ücretsiz hizmet - *.cel dosyaları, yakında RNA'yı destekleyecek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Amniotic Fluid CellsMembrane Mesenchymal Stem CellsEpisomal ReprogrammingChemically Defined ConditionsHuman Recombinant VitronectinE8 MediumFlow CytometryConfocal ImagingTeratoma FormationTranscriptional Profiling

Related Articles