Yöntem makalesi

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

DOI:

10.3791/56003

⸱

27 Kasım 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otolog hücre tabanlı terapiler gerçeklik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler getirilmesi ile bir adım daha var. Cenin kök hücre, amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal Kök hücre, gibi farklılaşmamış hücreleri söz doku Mühendisliği ve gelecekteki Pediatrik müdahaleler ve kök hücre Bankacılığı IPSC içine yeniden programlama için benzersiz bir tür temsil eder. Burada sunulan Protokolü ayıklamak için en iyi duruma getirilmiş bir yordam açıklanır ve birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal Kök hücre kültürü çalışmalarının ve episomal üreten tamamen kimyasal olarak tanımlanmış kültür bu hücreler pluripotent kök hücrelerden indüklenen insan rekombinant vitronectin ve E8 orta kullanan koşullar. -Akış Sitometresi, confocal görüntüleme, teratoma oluşumu ve transkripsiyon profil oluşturma – sıkı yöntemleri uygulayarak yeni satırlar karakterizasyonu ayrıca açıklanmıştır. Yeni oluşturulan satırları işaretleri embriyonik kök hücre – Oct3/4A, MicroRNAs, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4-SSEA-1 işaretçisi için negatif olurken hızlı. Kök hücre hatları teratomas scid-bej farelerde 6-8 hafta içinde oluşturmak ve teratomas doku tüm üç germ katmandan temsilcisi içerir. Transkripsiyon hatlarını profil oluşturma genel ifade Mikroarray veri bioinformatic pluripotency değerlendirme algoritması göndererek tüm satırları pluripotent sayılır ve bu nedenle, bu yaklaşım hayvan test için cazip bir alternatif. Yeni IPSC hatları kolayca ayırt etme ve doku Mühendisliği optimizasyonu içeren aşağı akım deneylerde kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) potansiyel hücre replasman tedavileri, hastalık ve gelişimsel modelleme ve uyuşturucu ve toksikolojik tarama1,2,3hakkında görülmemiș. Yedek terapiler kavramsal olarak hücre enjeksiyon tarafından elde edilebilir, In vitro doku (örneğin kalp yamalar) implantasyon ayrıştırılan veya rejenerasyon doku Mühendisliği aracılığıyla rehberlik. Amniyon sıvısı (AFSC) ve membran kök hücre (AMSC) olan hücreler bu müdahaleler için mükemmel bir kaynak ya da doğrudan4,5,6,7 veya yeniden programlama için başlangıç bir hücre nüfus olarak Pluripotent8,9,10,11,12.

Erken yaklaşımlar kullanılan tanımsız kültür sistemleri veya gerektirecektir genomik entegrasyonu gerektiren yöntemleri yeniden programlama yapıları9,10,11,12. Düz-se bile daha az tanımlanmış membran ek matris (BMM), IPSC amniyotik sıvı epitel hücreleri oluşturmak için kullanılan daha yeni yapılan bir çalışmada xeno-Alerjik orta istihdam. Ancak, teratoma oluşumu tahlil In vitro ve moleküler verileri zenginliği ile birlikte çalışmaya dahil değildi. Amniyotik sıvı epitel hücreleri yenidoğan fibroblastlar13ile karşılaştırıldığında bir kabaca 8-fold daha yüksek programlama verimliliği için bulunamadı. Başka bir çalışmada, amniyotik sıvı Mezenkimal kök hücrelerden de bir çok daha yüksek verimlilik ile12IPSC içine yeniden programlanan bulunmuştur.

Pluripotent kök hücre tüm 3 germ tabakalarının doku temsilcisi ayrıştırılan ve böylece geniş bir potansiyele sahip. Pediatrik hastalarda hasat, yeniden programlama ve onların Otolog amniyotik sıvı kök hücre doku Mühendisliği prenatally faydalı olacağını ve amniyotik membran kök hücreleri perinatally. Ayrıca, fetal kök hücreleri (erişkin kök hücreleri14,15düşük) farklılaşma nispeten düşük düzeyde teorik olarak IPSC16kaynak hücrelerden epigenetik önyargı gözlenen tutma ele yardımcı olabilir.

Burada amniyotik sıvı yeniden programlama için bir iletişim kuralı mevcut ve membran kök hücre içinde pluripotency için kimyasal olarak E8 orta xeno-Alerjik episomal plazmid18kullanılarak rekombinant vitronectin17 tarihinde (VTN) tanımlanan.. En büyük avantajı amniyotik sıvı ve membran hücre hücre yeniden programlama için bir kaynak olarak kullanılabilirliklerini öncesi yatıyor ve perinatally ve bu nedenle bu yaklaşım esas olarak Pediatrik doku Mühendisliği içine araştırma yararlanacak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolü Etik Komitesi insan araştırma için kurumsal kuralları izler. Hastanın yazılı izni amniyotik sıvı araştırma için kullanmak için elde edildi.

Bu iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi South Alabama Üniversitesi politikaları izler.

1. izolasyon ve kültür birincil amniyotik Mezenkimal Kök hücre

  1. Amniyotik sıvı hücre kaplama
    1. En az 2.5 mL Amniyosentez sürecinde bir hekim tarafından hasat amniyotik sıvı elde edilir.
      Not: Canlı hücre ve doku tüm işlemenin bir steril doku kültürü dolapta gerçekleştirilmesi gerekir ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır. Temel hücre kültürü ve steril tekniği bilgisi gereklidir.
    2. Amniyotik sıvı ve membran hücre (AFMC) kültür ortamı hazırlamak: EBM-2 Bazal orta, % 15 fetal sığır serum (FBS), bFGF 20 ng/mL, EGF, IGF 10 ng/mL 25 ng/mL. Birincil amniyotik sıvı gibi amniyotik membran kök hücre kültürü için orta ile antibiyotik antimycotic çözüm takıma.
    3. 0 gün, amniyotik sıvı 2.5 mL AFMC kültür orta ve plaka ile 3,5 mL T25 şişesi karıştırın. 37 ° C ve % 5 CO2 en az 48 saat kolonileri varlığı için kontrol etmeden önce rahatsız edilmeden için kuluçkaya.
    4. 5 günde kolonileri yapisan hücrelerinin bulunması gerekir. Yavaşça yaptım tam olarak alt ve enkaz için uygun ve vakum-Pasteur pipet kullanarak harcanan orta/amniyotik sıvı karışımı aspiratı hücreleri çıkarmak için balonun rock. Taze AFMC orta 5 mL ile değiştirin.
    5. Başka bir 5 gün boyunca kültür. Orta 1.1.4. adımda açıklandığı gibi her gün değiştirin.
  2. Yalıtım insan amnion birincil Mezenkimal Kök hücre
    1. En kısa zamanda doğum, hücresel bütünlüğü en üst düzeye çıkarmak için en geç 24 saat içinde takip plasenta edinin. Amnion 9 cm2 parçası kesilmiş, kan pıhtıları kaldırmak ve 50 mL santrifüj tüpü ile antibiyotik antimycotic çözüm takıma PBS 30 mL ile yıkayın.
    2. Adet steril 10 cm doku kültürü tabak içinde ince ayar yapmak için neşter bir çift kullanarak membranlar kıyma. Membranlar sindirim ve hücreleri ayıklama bir doku ayrılma sistemi kullanarak elde. Üreticinin iletişim kuralı izleyin.
      Not: yüksekse kıyma sonra doku parçaları, yüksek hücre sayıları sindirim sonra kurtarıldı.
    3. Neşter bıçakları kullanarak bir doku ayrılma tüp içine kıyılmış membran doku kütle transferi ve RPMI 1640 orta 4.7 mL ile karıştırın. (Bkz. Tablo reçetesi) ayrılma enzimler içinde karıştırın.
    4. Tüpler doku dissociator üzerine monte ve programı "h_tumor_01" çalıştırın. Tüpler 37 ° c 30 dk için sallanan bir platform üzerinde kuluçkaya.
    5. Daha fazla RPMI 1640 35 mL ile süspansiyonlar sulandırmak ve 50 mL koleksiyonu santrifüj tüpü üzerinde bir 70 µm süzgeç uygulanır.
    6. Santrifüj 200 x g oda sıcaklığında, atma süpernatant de 5 dk 5 mL RPMI 1640 Pelet resuspend, bir hemacytometer kullanarak hücreleri saymak ve 10.000 hücre/cm2 bir yoğunluk doku kültürü tedavi gemi ile içine, taze plaka için hazırlanan AFMC orta antibiyotik antimycotic çözüm ile desteklenmiştir.
      Not: eksik sindirim durumunda doku parçaları mevcut olacak ve tek hücre kıt olacak. Spin aşağı tekrar ve bir T75 şişesi bütün Pelet plakası.
  3. Birincil AFSC ve AMSC kültür
    1. AFSC/AMSC geçit kolonileri vakum alıyorum tarafından orta Pasteur pipet kullanma ve hücre dekolmanı enzim 2 mL şişe ekleme geçirdi. 5-8 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. Dokunun hücreleri çıkarmak ve süspansiyon AFMC orta eşit bir hacmi ile karıştırmak için balonun üzerinde (antibiyotik antimycotic ek olmamalıdır bu andan itibaren gerekli). 200 gr 4-5 dk. Kaldır ya da bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatant veya sadece tüp ters çevirme ve atık bir konteyner içine boşalma yoluyla, santrifüj kapasitesi.
    3. Bir tek hücre süspansiyon içinde kalan damla sıvı içine Pelet kıracak ve AFMC orta için kaplama ile karıştırın santrifüj tüpü dibine hafifçe vur. Bir yoğunluk arasında 2.500 ve 5. 000 hücre/cm2plaka T-şişeler içine.
    4. Değişim orta her geçen gün. Hücre hatları geçiş 6 ötesinde kültür değil. Amacıyla yeniden programlama için düşük bir geçiş mümkün olduğunca kullanın.
    5. AFSC ve AMSC dondurulmuş hisse senetleri gibi back-up donma orta kullanarak hazırlamak. Bir hücre dekolmanı enzim, 200 g, santrifüj 4 ° c 5 min için kullanarak kültürler hasat.
    6. Pasteur pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve Pelet hücrelerde singularize tüpü dibine hafifçe vur. 1 × 106/mL ve aliquot yoğunluğu cryovials içine de tam dondurucu ortamda resuspend. -80 ° C'de gecede dondurucu bir kapta saklayın Sonra için sıvı azot uzun süreli depolama için hareket.

2. yeniden programlama Pluripotency

  1. Programlama plazmid elde
    1. Bir kar amacı gütmeyen plazmid depo ile programlama plazmid satın. Bir malzeme Transfer sözleşmesi gerek yoktur.
    2. Plazmid E. Coli yetkili hücrelere dönüşümü ve ticari plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak plazmid yalıtır. Üreticinin yönergeleri izleyin.
    3. Plazmid DNA bir Spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçmek. Yüksek bir elde edilen konsantrasyon, örnek seyreltme sırasında transfection önlemek için ideal olarak yaklaşık 1 µg/µL plazmid nişan al.
    4. Bir UV Spektrofotometre ve aliquot kullanarak bireysel plazmid konsantrasyonları ölçmek onları tek tek.
    5. Birlikte 3 µg, 3 µg ve Plazmidler, EN2K, ET2K ve M2L 2 µg sırasıyla karıştırın. Programlama plazmid çözüm bu. Plazmid çözüm miktarı 1 x 106 hücre transfect için yeterli. Birkaç böyle aliquots hazırlayın.
    6. Tüm aliquots-80 ° C'de depolayın
  2. Hedef kültür tabak hazırlamak
    1. Bir 6-şey plaka vitronectin ile kat-1 mL vitronectin seyreltme arabelleği her kuyuya ve VTN stok çözeltisi (1 µg/cm2) 40 µL içinde karıştırın. Bırakın, oda sıcaklığında (RT) ya da 37 ° C'de kuluçka 1 h için.
    2. Vakum-Pasteur pipet kullanarak çözüm aspiratı ve 2 mL her iyi AFMC orta yerine. Hücreleri kaplama için olana 37 ° C'de depolayın.
      Not: Önemli: Bu adımda kullanılan AFMC orta değil herhangi bir antibiyotik veya antimycotic çözümleri içermesi gerektiğini.
  3. Kültürlü birincil AFSC/AMSC hasat
    Not: Düşük geçiş donmuş stokları kılmaktadır ve yeniden programlama için bir T-75 şişesi ayırmanız kültür AFSC/AMSC'nı genişletin. Olabildiğince az gibi beri 100.000 bir deney, hasat, amacı hücreleri yaklaşık 500.000 kayıplarını telafi etmek için ve eğer genişliğini transfection parametreleri veya farklı kültür koşulları test edilmesi için yeterli hücrelerdir.
    1. 1.3.1-1.3.2. adımda açıklandığı gibi hücre dekolmanı enzim karışımı kullanarak AFSC/AMSC düşük bir geçit, en kısa zamanda hasat. Hücreleri centrifuged sonra sonraki adıma geçin.
    2. Resuspend 1 ml Pelet PBS ve mix iyi serum bileşenleri yıkamak için. Bir hemacytometer kullanarak hücreleri saymak. 100.000/ml PBS ve aliquot hücre yoğunluğu 1,5 mL microcentrifuge tüpler içine ayarlayın. Bu sadece çok az kişi vakit arasındaki hücreleri ve transfection için kullanılan arabellek sağlar.
    3. Microcentrifuge tüp 5 mL polistren tüpler üzerine yerleştirin (adaptörler, bir normal salıncak rotor Santrifüjü sağlayacak) ve 200 x g, santrifüj, oda sıcaklığında 4 dk için. Tüpler ters çevir ve süpernatant atık konteyner içine atın. Sabit açılı rotor kullanmayın.
    4. 3 dakika oda sıcaklığında 200 x g adlı bir ek Santrifüjü adımı gerçekleştirin. Bu kalan sağlayacak en altında toplamak için boru duvarlarından sıvı. Dikkatlice hepsini 200 µL pipet kullanarak Aspire edin.
  4. Plazmid yeniden programlama ile transfection
    1. Deneyler yeniden programlama için bir transfection sistemi ( Tablo malzemelerigörmek) programlama plazmid hücrelere sunmak için kullanılır. Transfection ipuçları, transfection tüpleri, resuspension arabellek ve elektrolitik arabellek doku kültürü kabinin yerleştirin. Onlar açana kadar o zaman onlar 4 ° C'de depolanan kiti reaktifler RT tutulur
      Not: Biz seti 10 µL sürümünü kullanın.
    2. Transfection aygıtı kapatmak böylece onun Metro İstasyonu'na doğrudan dolap yerleştirilebilir taşıyın. Bir transfection tüp elektrolitik arabellek 3 mL ile doldurulması ve sonuna kadar yuvanın iterek istasyona tüp bağlama.
    3. Programlama plazmid adım 2.1.5-80 ° C depodan hazırlanan çözüm aliquots al ve RT kültür kabine çözülme izin.
    4. Transfection cihaz aşağıdaki transfection parametreleri seçin: 950 V, 40 ms ve 1 darbe.
    5. 10 µL resuspension arabellek 100.000 hücreleri içeren Pelet resuspend. Hızlı bir şekilde bu noktadan itibaren resuspension arabellek biraz zehirli olduğu için ve bir artan pozlama süresi içinde belirgin bir şekilde düşük bir hücre canlılık sonuç iş üstünde.
    6. 1/10 (çözüm aliquot 1 x 106 hücre toplam için hazırlanmıştır) programlama plazmid çözüm mix.
    7. Transfection bahşiş transfection pipet üzerine monte.
    8. Hücre süspansiyon transfection ucunu dikkatle, hava kabarcıklarının oluşumunu önleme Aspire edin. Kabarcıklar gözlenir, süspansiyon sınırdışı ve aspirasyon yineleyin. Hava kabarcıkları transfection engel.
    9. Transfection pipet transfection tüp içine yerleştirin ve transfection cihazın ekranında "Başlat" düğmesine basın. Transfection başarı hakkında bilgilendirilmesi perde haber bekleyin ve pipet tüp sizden hemen kaldırın.
    10. İçine 1 de 2.2 bölümünde hazır hedef 6-şey plaka süspansiyon sınırdışı. Bir de komşu gelen orta mix ve süspansiyon eşit (elde edilen hücre yoğunluğu 50.000/iyi olacak) her iki kuyu dağıtmak.
    11. Transfection tek tek AFSC/AMSC içeren tüm microcentrifuge tüpler için yineleyin. Plaka da kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2yerleştirin.
  5. Kültür transfected AFSC/AMSC
    1. Transfected hücreleri 2-5 gün için kültür. Sonra günde 3 sodyum bütrat 100 µM ile desteklenmiş E8 oluşan programlama ortamına geçin.
      Not: Kaynak AFSC/AMSC büyüme önlemek için ikincil geçiş yapılabilir. Ancak, passaging bu parametre Eğer programlama verimliliği doğru olarak hesaplamak için seçeneği devre dışı bırakır.
    2. Programlama orta 10 gün boyunca her gün için her gün değiştirin. Orta gün 10 her gün değiştirin.
  6. Tam olarak reprogramed kolonileri klonal genişleme için el ile malzeme çekme
    1. Tam olarak programlanmış kolonileri 14 gün yanında görünür. Koloniler boyutu genişletin ve kompakt hale sağlar. Onlar el ile aldım ve taze tabakaları bana gün 15-16 gibi erken transfer.
    2. malzeme çekme işlemi önce 1 h 24-şey pilakalar ve VTN 8 µL vitronectin seyreltme arabelleği iyi (1 µg/cm2) başına 300 µL içinde kat ve RT veya 37 ° c kuluçkaya Çözüm olmadan sodyum bütrat E8 orta yerine.
    3. Koloniler, yeterli boyuta (çapı ideal 400 µm) steril kültür kabine seçin. Faz kontrast mikroskop ya da bir stereomicroscope kullanılabilir.
    4. Onun monitör TemizlikFleksibl ortadan kaldırır bu yana malzeme çekme için kabine yerleştirilmiş bir LCD görüntüleme mikroskobu kullanılacaktır. % 70 etanol ile mikroskop sahne sterilize.
    5. Normal faz kontrast hücre kültür mikroskop kullanarak seçin, mark ve çekilecek kolonileri sayısını not edin. Bu zaman için bu işlem sırasında gerçek malzeme çekme boşa değil emin olmak önemlidir.
    6. PBS içinde 30 µL 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ile çekilmek üzere kolonileri sayısından büyük veya eşit bir sayı PCR tüpleri doldurun. Koloniler kaplama önce kısmi ayrılma için bu tüpler içine yerleştirilir.
    7. 5 almaya planı kolonileri tabak 2 µL. için ayarla 10 µL pipet kullanarak aynı anda koloni kenarında bir açıyla pipet ucu tutun ve dikkatli ve yavaş yavaş tüm koloni yüzey kapalı kazımak. Hemen tüm koloni pipet ucu Aspire edin ve hazırlanan PCR tüpleri EDTA ile birinin içine aktarın.
    8. Kalan 4 koloniler ile yineleyin. RT 4-6 dk için kuluçkaya.
    9. Damlalıklı yukarı ve aşağı yavaşça daha küçük kümeleri koloni yıkmak için daha büyük bir pipet ucu kullanarak süspansiyon. Bir tek hücre süspansiyon oluşturmaktan kaçının.
    10. Doğrudan bir hedef de 2.6.2 adımda hazırlanan 24-şey plaka süspansiyon plaka. Kalan koloniler ile yineleyin.
    11. 5'ten fazla kolonileri çekilecek ama 5'ten fazla kolonileri teker teker seçme 2.6.6 2.6.10 aracılığıyla yineleyin. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.
  7. Klonal genişleme ve IPSC olgunlaşma
    1. Koloniler büyümek ve kompakt olmasına izin. 3-6 gün yeterlidir. Kültür orta her gün değiştirin. 400 µL ve hücre yoğunluğu dayalı E8 orta 1 mL arasında kullanın.
    2. 24-şey plaka yeterli bir koloni yoğunluğu ile kuyu 6-şey kalıplara genişletilecektir. passaging önce 1 h VTN 6-şey pilakalar (aynı derecede içinde adım 2.2.1) kat. O zaman iyi çözüm E8 orta iyi başına 2 mL ile değiştirin.
    3. 1 mL pipet kullanarak kaynak kuyulardan harcanan orta Aspire edin ve 0,5 mM EDTA yıkamak için 300 µL ile değiştirin. Hemen aynı pipet ucu kullanarak Aspire edin ve 0,5 mM EDTA 300 µL ile tekrar yerine, sonra 5 dk. Aspire için 1 mL pipet kullanarak tüm sıvı RT kuluçkaya.
    4. 1 mL pipet kapasitesini ayarla, 1 mL wide-geçişli bahşiş üzerine monte ve hedef E8 orta uç de Aspire edin. Kaynak IPSC kültür orta bir akışı ile yıkayın.
    5. Süspansiyon hedef iyi ve damlalıklı kolonileri 20-50 hücre kümeleri içine bölmek için birkaç kez yukarı ve aşağı içine aktarın. Onlar eşit kuyuda hafif sallanan ve plaka sallayarak tarafından dağıtılan ve 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya emin olun.
    6. Günlük Orta ve geçiş her 3-4 gün değiştirin. Herhangi bir farklılaştırıcı kolonileri faz kontrast mikroskop altında işaretlenebilir ve kültürde dolabında bir pipet ucu kullanarak kaldırıldı. Bu yüksek kaliteli saf IPSC kültür seçmeli yayılmasını sağlar.
    7. passaging önce 1 h kat VTN 6-şey plakalı olduğu gibi adım 2.2.1 kuyu. Daha sonra çözüm E8 orta iyi başına 2 ml ile değiştirin.
    8. Rutin passaging ilk yapılan 0,5 mM EDTA (Adım 2.7.2 2.7.5) kullanarak passaging için benzer. 6-şey plaka bir iyi harcanan orta yıkama ve atmak için EDTA 1 mL ile değiştirin.
    9. 1 mL EDTA ekleyin ve 5-7 dk kısmi ayrılma için RT kuluçkaya. Kuluçka süresi optimize etmek gerekli, bir süspansiyon emin 20-50-hücrenin etrafında kümeleri üretilen eğer. Ayrılma tek hücreye kaçının.
    10. EDTA çözüm atın ve 1 mL 1 mL pipet hedef de wide-geçişli pipet bahşiş kullanarak E8 orta Aspire edin.
    11. İstenen bir kısmı yüzeyden serbest kadar art arda kapalı kaynak IPSC kültür akışı E8 orta yıkama ve hedef haline de aktarmak. Bu bölümü split oranı temsil eder (örneğin, 1/8 kültür transfer 1:8 oranı için.)
    12. Geçit her 3-4 gün. Onları en az 15 pasajlar için aşağı akım deneylerde kullanmadan önce tarafından kültür olgun IPSC satırlarının izin

3. karakterizasyonu ve Pluripotency onayı

Not: ayrıntılı bilgi için ek dosyaları Akış Sitometresi ve confocal mikroskobu bakın.

  1. Teratoma oluşumu tahlil
    1. Dokuların tüm üç germ katmandan temsilcisi teratoma oluşumu tahlil tarafından ayırt etmek için IPSC kapasitesini belirlemek için hayvan bakımı ve kullanımı, öncesinde uygun iletişim kuralını dosyalama için zaman tanımak planlama ile ilgili Kurumsal politikalar takip belgeleri. Farelerde teratoma oluşumu arasında 6-10 hafta sürecek.
    2. 6-şey plaka IPSC satır başına 4 kuyu 4 gün boyunca kültür. Bir fare bir kanat enjekte hücre sayısı yaklaşık 0,5-1 x 106 hücreleri olduğunu. İsteğe bağlı: ekstra bir de tek hücre ayrılma bir hücre dekolmanı enzim aracılığıyla bir iyi bir temsilcisi cep numarasını belirleme ve sayım için ayrılmış olması.
    3. IPSC kümeleri içinde askıya E8/BMM karışımı hacmi hesaplamak: bir fare her iki yanları enjekte, her biri 150 µL yığın süspansiyon. Üç fareler bir IPSC satır oluşumu teratoma test etmek yeterli değildir. Ölü hacim kaybı telafi etmek için elde edilen toplu iğne başı bir ekstra 150 µL içerir. fare başına 1 iğne kullanılır. Bu nedenle toplam birimdir 3 * (150 µL * 2 + 150 µL) = 1350 µL
    4. Onlar pasajlı için açıklanan adımlardaki 2.7.8-2.7.10 gibi sanki kısmen IPSC kolonileri EDTA ile ayırmak. Bu kolonilerin kümeleri ayrışmış ve tek hücrelere ayrılmış değil önemlidir.
    5. Yıkama IPSC kolonileri E8 orta (yarım adım 3.3.3 hesaplanan hacmi), 675 µL ile kapalı bir geniş-geçişli ucu kullanarak. Yığın süspansiyon 5 mL polistren tüp içine aktarın. Buza koyun.
    6. BMM 675 µL ile birleştirin. Buz üzerinde elde edilen süspansiyon enjeksiyon kadar tutun.
    7. Onları hareketsiz fareler anestezi isoflurane kullanarak. Bu gerçekleştirilen veya vivaryum yetenekli personeli tarafından destekli.
    8. Girdap 5 mL polistiren kısaca tüp ve yığın süspansiyon (fare başına 450 µL) 22 G iğne ile donatılmış bir insülin şırınga içine Aspire edin. Hücre süspansiyon 150 µL subkutan enjekte et. Bu birim (bkz. Adım 3.1.2) yaklaşık 1 x 106 hücreler içerir.
    9. 3 fare IPSC satır başına enjekte. Uygun hayvan bakımı uygulama için tüm yordamları izleyin.
    10. Fareler sağlığını her gün izlemek.
    11. Teratomas bir son nokta çapı 1,5-2 cm ulaştığınızda, fareler ötenazi, teratomas explant ve onları formalin çözüm için doku fiksasyon 24 h için saklayın.
    12. Hematoksilen Eozin (H & E) boyama için bir Histoloji çekirdek tesise sabit teratomas getir. Bir patolog doku tüm üç germ tabakalarının varlığı sınıf.
      Karyotyping için Not: canlı IPSC kültürler sevk İhtisas karyotip bütünlüğünü sınamak için sitogenetik laboratuarları. Bu sınamanın gerçekleştirilmesini tavsiye edilir her 5 pasajlar.
  2. Transkripsiyon profil oluşturma
    1. 6-şey plaka bir RNA örnek almak 3-4 gündür 2 kuyu kültür. Hücreleri ayırt ile küçük kirlenme damlalıklı ipucu kullanarak kazıma ele alınması, sadece yüksek kaliteli kültürler kullanın.
    2. RNA üreticinin protokol sonrası piyasada bulunan bir seti kullanarak IPSC kültürler yalıtmak. Örnek bir özel genomik çekirdek tesise gemi.
    3. Microarrays ( Tablo malzemeler için desteklenen seçenekleri görmek) veya RNA sıralama kullanarak IPSC satırlarının genel transkripsiyon profilleri elde edilir.
    4. "*.İdat" dosya bioinformatic değerlendirmesi pluripotency Coriell Enstitüsü'nde online bir arayüz üzerinden gönderin. Alternatif olarak, gönderin "* .cel" dosyaları pluripotent kök hücreler, Johns Hopkins Üniversitesi'nde online bir arayüz üzerinden de dahil olmak üzere hücre tipinin kimliği bioinformatic için. Malzemeler tablo bireysel bioinformatic deneyleri kabul veri türleri hakkında ayrıntılı bilgi için bkz:.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bilinçli yazılı onayı için genetik test amaçlı ve araştırma için sıvı küçük bir aliquot ithaf amniyotik sıvı hasat önce hastalardan elde edildi. Plasenta tıbbi atık temsil eder gibi hiçbir onayı araştırma amniyotik membran kullanımı için gereklidir. Amniyotik sıvı ve membran kök hücreler tipik Mezenkimal özelliklerini görüntülemek, morfolojik hücrelerine seklinde ve faz parlak. Yeniden programlama, üzerine hücreler Mezenkimal-için-epitel (MET) geçiş geçmesi ve Arnavut kaldırımı benzeri mo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cenin kök hücre nesilden IPSC başlangıç aşamasında kaynak hücreleri ayıklama fetal dokularda, kültür, genişleme ve episomal programlama plazmid getirilmesi üzerine kuruludur. Bu aşama yaklaşık 14-18 gün önce ilk tam olarak programlanmış kolonileri genişletilebilir bir kültür döneme göre izlenir. Olgunlaşma IPSC klonların son aşamasıdır. Amniyotik membran kök hücre ilk çıkarma bir kombine mekanik ve Enzimatik sindirim amnion aracılığıyla elde edilir. Bulduğumuz bu hücre ile en yüksek canlılık çıkarılan en yüksek sayısı 30...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Fonds Medizinische Forschung Zürih Üniversitesi, Forschungskredit Zürih Üniversitesi, SCIEX NMSCh altında Arkadaş grupları 10.216 ve 12.176, Swiss, Kardiyoloji Derneği, İsviçre Ulusal Bilim tarafından desteklenmiştir Kuruluşu'nun altında Grant [320030-122273] ve [310030-143992], 7. çerçeve programı, hayat Vana, Grant [242008], Olga Mayenfisch Vakfı, EMDO Vakfı, Zürih Üniversitesi Hastanesi açılış hibe 2012 Avrupa Komisyonu ve iç Mitchell Kanser Enstitüsü finansman.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tümör Ayrışma Kiti, insanMiltenyi Biotec130-095-929doku ayrışma sistemi, reaktif kiti, doku ayrışma tüpleri ve doku ayrışma enzimleri içerir
gentleMACS AyrışmaMiltenyi Biotec130-093-235doku ayrışma sistemi, ayrışıcı
Thermo Scientific & Shandon ve ticaret; Tek Kullanımlık Neşter No. 10, Steril, Ayrı Sarılmış, 5.75 (14.6cm)Thermo-Fisher3120032
70 & m hücreli süzgeçlerCorning10054-456
RPMI 1640 orta boyThermo-Fisher32404014 
sallanan platformVWR40000-300
50 ml santrifüj tüpleriThermo-Fisher339652
15 ml santrifüj tüpleriThermo-Fisher339650
EBM-2 bazal ortamAFMCCC-3156bazal ortam
(E. coli olarak ifade edilir, glikosile edilmemiş)Prospec BioCYT-218bFGF, AFMC orta
EGF İnsan, PichiaProspec BioCYT-332 için ek;EGF, AFMC ortamı için takviye
LR3 İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü-1 İnsan RekombinantProspec BioCYT-022IGF, AFMC orta
Fetal Sığır Serumu, embriyonik kök hücre nitelikliThermo-Fisher10439024FBS
Antibiyotik-Antimikotik (100X)Thermo-Fisher15240062 primer AFSC / AMSC için, rutin AFSC / AMSC için gerekli olmamalıdır, transfekte edilmiş hücreler için ortamda kullanmayın!
Accutase hücre dekolmanı çözümüStemCell Technologies07920hücre dekolmanı enzimi
CryoStor ve ticaret; CS10StemCell Technologies07930tam dondurma ortamı
PBS, pH 7.4Thermo-Fisher Scientific10010023 
EndoFree Plazmid Maxi Kiti (10)Plazmit izolasyonu içinQiagen12362
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K, yeniden programlama faktörleri Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K, yeniden programlama faktörleri Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L, yeniden programlama faktörleri c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis SpektrofotometreThermo-FisherND-2000Cspektrofotometre
Neon® Transfeksiyon SistemiThermo-FisherMPK5000transfeksiyon sistemi, bileşenler: < br / > Neon pipet - transfeksiyon pipeti
Neon cihazı - transfeksiyon cihazı
Neon & reg; Transfeksiyon Sistemi 10 & mikro; NeonThermo-FisherMPK1025sarf malzemeleri kiti, şunları içerir:
Neon uç - transfeksiyon ucu
Neon tüp - transfeksiyon tüpü
tamponu R - yeniden süspansiyon tamponu < br / > tamponu E - elektrolitik tampon
Stemolekül ve ticaret; Sodyum ButiratStemGent04-0005yeniden programlanmasının küçük molekül arttırıcısı
;Kök Hücre Teknolojileri07180VTN, stok konsantrasyonu 250 & g / ml, 1 & mikro'da kaplama için kullanılır; g / cm < sup> 2 < / sup> vitronektin seyreltme (CellAdhere) tamponu
CellAdeve ticaret; Seyreltme TamponuKök Hücre Teknolojileri07183vitronektin seyreltme tamponu
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo-Fisher15575020kullanmadan önce PBS ile 0.5 mM'ye seyreltin
EVOS® FL Görüntüleme SistemiThermo-Fisher ScientificAMF4300 LCD görüntüleme mikroskop sistemi
CKX53 Ters MikroskopOlympusfaz kontrast hücre kültürü mikroskobu
Pierce & trade; %16 Formaldehit (w/h), Metanol içermeyenThermo-Fisher28908kullanmadan önce PBS ile %4'e seyreltilir, seyreltilmiş 2-8 °C'de saklanabilir; 1 hafta boyunca C
Perma Tamponu IIIBD Biosciences558050geçirgenlik tamponu, -20 ° C'ye kadar soğutun; C kullanmadan önce
Fare IgG1, κ İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 488BD Biosciences557782Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, &kappa için izotip kontrolü; İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 647BD Biosciences557783Sox2
Fare anti-insan Oct3/4 (İnsan İzoform A), Alexa Fluor® 488BD Biosciences561628
Fare anti-insan Nanog, Alexa Fluor® 488BD Biosciences560791
Fare anti-insan Sox-2, Alexa Fluor® 647BD Biosciences562139
Fare IgGM, κ İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 488BD Biosciences401617TRA-1-60
Fare IgGM, &kappa için izotip kontrolü; İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401618TRA-1-81
Fare anti-insan TRA-1-60, Alexa Fluor® 488BD Biosciences330613
Fare anti-insan TRA-1-81, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330705
Mouse IgG1, κ İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 488BD Biosciences400129SSEA-1
Fare IgG3, &kappa için izotip kontrolü; İzotip Kontrolü, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401321SSEA-4
Fare anti-insan SSEA-1, Alexa Fluor® 488BD Biosciences323010
Fare anti-insan SSEA-4, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330407
Affinipure F(ab')2 Parça Keçi Anti-Fare IgG + IgM, Alexa Fluor® 488Jackson İmmünoaraştırma115-606-0681:600 seyreltmede kullanın veya daha fazla optimize
edin Affinipure F(ab')2 Parça Keçi Anti-Fare IgG+IgM, Alexa Fluor® 647Jackson Immunoresearch115-546-0681:600 seyreltmede kullanın veya
DAPIThermo-Fisher ScientificD21490stok çözeltisini 10 mM optimize edin, çalışan bir çözelti için 1:12.000'e kadar seyreltin
Corning® Matrigel® Büyüme Faktörü Azaltılmış, Fenol Kırmızısı İçermeyenCorning356231bazal membran matrisi (BMM)
scid-bej fareler, dişiTaconicCBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)Qiagen74134RNA izolasyon kiti
T-25 şişeleri, doku kültürü ile muamele edilmişThermo-Fisher156367
T-75 şişeleri, doku kültürü ile muamele edilmişThermo-Fisher
Nunc™ doku kültürü kabıThermo-Fisher12-567-650 10 cm doku kültürü kabı
6 oyuklu plakalar, doku kültürü ile muamele edilmişThermo-Fisher140675
Neubauer sayma odası (hemasitometre)VWR15170-173
Mr. Frosty™ Dondurma kabıThermo-Fisher5100-0001 dondurma kabı
FACS tüpleri, Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, 5mlCorning3520585 ml polistiren tüpler
Eppendorf tüpleri, 1.5 mlThermo-Fisher05-402-961.5 ml mikrosantrifüj tüpleri
PCR tüpleri, 200 ve mikro; lThermo-Fisher14-222-262
pipet uçları, 100 ila 1250 &mikro; lThermo-Fisher02-707-407dar delikli 1 mL uçlu
pipet uçları, 5 ila 300 & mikro; lThermo-Fisher02-707-410
pipet uçları, 0,1 ila 10 & lThermo-Fisher02-707-437
geniş çaplı pipet uçları, 1000 & lVWR89049-166geniş delikli 1 mL uçlu
cam Pasteur pipetleriThermo-Fisher13-678-20A
etanol, 200 geçirmezThermo-Fisher04-355-451
vorteks karıştırıcıVWR10153-842
odacıklı kapak camı, 8 kuyulu, 1,5 mm borosilikat camThermo-Fisher155409cam tabanlı konfokal dereceli kültür gereçleri
22G iğnelerVWR82002-366
insülin şırıngalarıThermo-Fisher22-253-260
Formalin çözeltisi, nötr tamponlu,% 10Sigma-AldrichHT501128-4Leksplante edilmiş teratomların fiksasyonu
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChipIlluminaBD-103-0204ekspresyon mikrodizisi, PluriTest tarafından desteklenen, üretici tarafından durduruldu
PrimeView İnsan Genomu U219 Dizi PlakasıThermo-Fisher901605ekspresyon mikrodizisi (eski adıyla Affymetrix markası), yakında PluriTest
GeneChip&trade tarafından desteklenecek; İnsan Genomu U133 Plus 2.0 ArrayThermo-Fisher902482ekspresyon mikrodizisi, CellNet tarafından desteklenen, yakında PluriTest tarafından desteklenecek
PluriTest®Pluripotentliğin biyoinformatik değerlendirmesi için ücretsiz hizmet olan Coriell Institute www.pluritest.org, mikrodizi verilerini kabul eder - HT-12 v4 platformundan *.idat dosyaları, yakında U133, U219 mikrodizi ve RNA dizileme verilerini destekleyecek
Verileri sıralama
ortamı FGF 2 İnsan için Lonza Transfeksiyon Sistemi için L Kit TeSR-E8 Kök Hücre Teknolojileri 05940 E8 ortamı Vitronektin XF ve ticaretin 156499 CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu, U133 mikrodizi verilerine dayalı plütipotent kök hücreler de dahil olmak üzere hücre tipinin biyoinformatik tanımlanması için ücretsiz hizmet - *.cel dosyaları, yakında RNA'yı destekleyecek

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
  14. Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Amniyotik S v H creleriMembran Mezenkimal K k H creleriEpisomal ReprogramlamaKimyasal Olarak Tan mlanm Ko ullarnsan Rekombinant VitronektinE8 MedyumuAk SitometrisiKonfokal G r nt lemeTeratoma Olu umuTranskripsiyonel Profilleme

İlgili makaleler