Method Article

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

DOI:

10.3791/56010

⸱

July 31st, 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tam hücre yama kelepçesi, tekli hücrelerin elektriksel özelliklerini ölçmek için altın standart yöntemdir. Bununla birlikte, in vitro yama kelepçesi, karmaşıklığı ve kullanıcı operasyonu ve kontrolüne yüksek bağımlılığı nedeniyle zorlu ve düşük üretim tekniği kalmaktadır. Bu el yazması, akut beyin dilimlerinde in vitro tüm hücre yaması klemp deneyleri için görüntü yönlendirmeli bir otomatik tutma kelepçesi sistemini göstermektedir. Sistemimiz, floresan etiketli hücreleri algılamak ve bir mikromanipülatör ve dahili pipet basınç kontrolü kullanarak tam otomatik yama için onları hedeflemek için bir bilgisayar görme tabanlı algoritma uygular. Bütün süreç, insan müdahalesi için asgari gereklilikler ile son derece otomatiktir. Elektrik direnci ve dahili pipet basıncı da dahil olmak üzere gerçek zamanlı deney bilgileri gelecekteki analizler ve farklı hücre tiplerine göre optimizasyon için elektronik olarak belgelenmiştir. Sistemimiz akut beyin bağlamında tanımlansa daN dilim kayıtlarında, aynı zamanda ayrışmış nöronların, organotipik dilim kültürlerinin ve diğer nöronal olmayan hücre tiplerinin otomatik görüntü yönlendirmeli yama kelepçesine de uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yama kenetleme tekniği ilk uyarılabilir membranların 1 iyonik kanal incelemek için 1970'lerde Neher ve Sakmann tarafından geliştirilmiştir. O zamandan beri, yama sıkıştırma, nöronlar, kardiyomiyositler, Xenopus oositleri ve yapay lipozomlar dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde hücresel, sinaptik ve devre seviyesinde - hem in vitro hem de in vivo - birçok farklı çalışmada uygulanmıştır 2 . Bu süreç, bir hücrenin doğru tanımlanması ve hedeflenmesi, hücreye yakın yama pipetini taşımak için karmaşık mikromanipülatör kontrolü, sıkı bir gigaseal yama oluşturmak için uygun zamanda pipete pozitif ve negatif basınç uygulanmasını, Ve tam hücreli bir yama konfigürasyonu oluşturmak için bir kırılma. Mandal sıkıştırma genellikle manuel olarak yapılır ve ustalık için kapsamlı eğitim gerektirir. Yama ile deneyimli bir araştırmacı için bileKelepçe, başarı oranı nispeten düşüktür. Daha yakın zamanda, patch-clamp deneylerini otomatikleştirmek için çeşitli girişimler yapılmıştır. Otomasyonu başarmak için iki temel strateji geliştirildi: yama sürecinin otomatik kontrolü ve yeni ekipmanların ve tekniğin baştan tasarlanmasını sağlamak için standart patch clamp ekipmanının güçlendirilmesi. Eski strateji, mevcut donanıma uyarlanabilir ve in vivo kör yama kelepçesi 3 , 4 , 5 , akut beyin dilimleri, organotipik dilim kültürlerinin in vitro yama kelepçesi ve kültürlenmiş ayrışmış nöronlar da dahil olmak üzere çeşitli yama kelepçesi uygulamalarında kullanılabilir 6 . Aynı anda birden çok mikromanipülatör kullanarak kompleks yerel devrelerin sorgulanmasını sağlar 7 . Düzlemsel yama yöntemi, yüksek verimli eşzamanlı p elde edebilen yeni kalkınma stratejisinin bir örneğidirİlaç tarama amaçları için askıdaki hücrelerin atch kelepçesi 8 . Bununla birlikte, düzlemsel yama yöntemi, özellikle uzun proseslere sahip nöronlar veya kapsamlı bağlantılar içeren sağlam devreler olmak üzere tüm hücre tipleri için geçerli değildir. Bu, geleneksel patch clamp teknolojisinin önemli bir avantajı olan sinir sisteminin karmaşık devre haritalarına uygulanmasını sınırlar.

Standart yama kelepçesi donanımını güçlendirerek elle yama klemp prosesini in vitro otomatik hale getiren bir sistem geliştirdik. Autopatcher IG sistemimiz, otomatik pipet kalibrasyonu, floresan hücre hedef belirleme, pipet hareketinin otomatik kontrolü, otomatik tam hücre yamalama ve veri günlüğü sağlar. Sistem, otomatik olarak farklı derinliklerde birden fazla beyin dilimi imgesi edinebilir; Bilgisayar vizyonu ile analiz edebilecek; Ve floresan etiketli hücrelerin koordinatları da dahil olmak üzere bilgi çıkarmak. Bu bilgiler daha sonraIlgilenilen hücreleri hedeflemek ve otomatik olarak düzeltmek için kullanılır. Yazılım, birkaç açık kaynak kütüphanesi kullanarak, özgür, açık kaynaklı bir programlama dili olan Python'da yazılmıştır. Bu, diğer araştırmacılara erişebilmesini sağlar ve elektrofizyoloji deneylerinin tekrarlanabilirlik ve titizliğini geliştirir. Sistem, modüler bir tasarıma sahiptir; böylece ek donanım, burada gösterilen mevcut sistemle kolayca arayüz oluşturabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sistem Kurulumu

  1. Basınç kontrol ünitesini oluşturun.
    1. Basınç kontrol ünitesini devre haritasına göre monte edin ( Şekil 1 ). Gerekli parçaları, elektrik devre şemasına göre üretilen Baskılı Devre Kartı (PCB) üzerine lehimleyin ( Şekil 1b ). Standart rezistörler, LED'ler, Metal Oksit Yarıiletken Alan Efekti Transistörleri (MOSFET'ler), kondansatörler ve konektörleri kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). PCB üzerine lehim solenoid valfleri. Hava pompası ve hava basınç sensörünü elektrik kablosuyla PCB'ye bağlayın.
      NOT: Basýnç kontrol ünitesini oluþturmak için gerekli bütün parçalarýn hazýrlanmasý yaklaýk 2 saat sürecektir.
  2. İkincil veri toplama (DAQ) kartını bağlayın.
    1. Tablo 1'den sonra baskılı devre kartındaki veri çıkışlarını DAQ kartına bağlayın.
      NOT: DAQ panosu"Tek uçlu mod" ta çalışıyordum. Bağlantı noktası haritasını kullanım kılavuzunda bulabilirsiniz (bkz . Malzeme Tablosu ).
    2. "AIn Pr S" yi analog giriş (AI) kanallarından birine ve "R-Gr" yi sekonder DAQ panosundaki analog zeminlerden birine bağlayın.
    3. Amplifikatörden birincil çıkışı AI kanallarından birine ve toprağa sekonder DAQ kartının analog topraklarına bağlayın.
      NOT: Amplifikatörden birincil çıkışı bağlamak için standart bir BNC kablosu kullanılabilir.
    4. Diğer ucunu soyun ve pozitif sinyali ( yani bakır damar) AI kanalına ve toprağa ( yani , damar etrafındaki ince tel) analog toprağa bağlayın. Birden fazla yama kanalı kullanılıyorsa, bu adımı ikinci bir kanal için tekrarlayın.
      NOT: DAQ kartına analog giriş sonraki adımlarda yapılandırılacaktır.
    5. Gücü, ikincil DAQ kartının güç çıkışına bağlayın. Ayrı bir 12 V güç kullanın;Pompa için teşvik edin.
  3. Boruyu bağlayın.
    1. Hava pompasını ve iki valfı Tablo 2'ye göre bağlayın. Son adımda valf 2 üstteki port, basınç sensörü ve pipet tutucusundan yumuşak boruyu bağlamak için 3 yönlü bir konnektör kullanın.
    2. İki pipet kullanılıyorsa, pipet tutucusuna bağlanan boruya başka bir 3-yollu konektör ekleyin. Yama yaparken kullandığınız valfleri ve pipetleri manuel olarak değiştirin.
  4. Autopatcher IG'yi yükleyin.
    NOT: Sistem gereksinimi: Autopatcher IG yalnızca Windows 7 çalıştıran bir bilgisayarda test edilmiştir. Diğer işletim sistemleri için onaylanmamıştır. Açıklanan prosedür, özellikle Malzeme Masasında listelenen donanım için geçerlidir.
    1. Autopatcher-IG'yi GitHub'dan indirin (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
    2. Python'u kurun (sürüm ve karşıdan yükleme adresi için Malzeme Tablosuna bakın).
    3. PyQt4'ü kaldırKomut satırı terminalinde "pip kaldırma PyQt4" yazarak bir arşiv.
      Not: Sistem Qwt ve Opencv kitaplıkları ile uyumluluk sağlamak için PyQt4 kitaplığının daha eski bir sürümünü kullanır.
    4. Tarihi tekerlek dosyalarından Python kütüphanelerini yükleyin (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Aşağıdaki dosyaları bulun: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) ve Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Tekerlek dosyalarını yüklemek için, dosyaların kaydedildiği dizine gidin ve "pip install *** wheelfilename ***. Whl" yazın. "*** wheelfilename ***" dosyasını dosyanın gerçek adıyla değiştirin.
        NOT: tekerlek dosya adındaki "cp27", Python 2.7'yi ve "win32" Windows 32-biti belirtmektedir. "Win32" çalışmazsa, "win64" i deneyin.
    5. CCD kamerayı kontrol etmek için yükleyiciyi indirin ve yükleyin64-bit (https://www.qimaging.com/support/software/). Ardından kamerayı Python'da kontrol etmek için MicroManager for 64-bit'i indirin (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release).
    6. Manipülatörleri ve mikroskop sahnesini kontrol etmek için, üretici tarafından sağlanan kontrol yazılımını yükleyin.
      NOT: Bunu yaparak, manipülatörleri kontrol etmek için gerekli olan sürücü de yüklenir. Yükleme paketi genelde bir CD-ROM'da sağlanır.
    7. İkincil DAQ kartını kontrol etmek için Evrensel Kitaplığı DAQ kartının satın alınmasıyla birlikte verilen CD-ROM'dan yükleyin.
  5. Autopatcher IG için donanımı yapılandırın.
    1. Mikroskop sahne ve manipülatör kontrolörlerini USB bağlantı noktaları üzerinden bilgisayara bağlayın.
    2. "Yapılandırma" klasöründeki "ports.csv" yapılandırma dosyasında COM port numaralarını ünite 0: mikroskop sahne, ünite 1: sol manipülatör ve ünite 2: sağ manipülatör sırasına atayın. LPorts.csv dosyasındaki diğer parametreleri ( yani "SCI" ​​ve "1") değiştirmeden bırakın.
      NOT: COM bağlantı noktası numarası bilgileri, üretici tarafından sağlanan manipülatör yapılandırma yazılımını çalıştırarak bulunabilir. "Ayarlar" sekmesine gidin, "ayarlar" ı ve "Hareket" sayfasını seçin ve üstteki her sekmenin etiketlerini okuyun. Alternatif olarak, bu bilgi PC Aygıt Yöneticisi'nde bulunabilir.
    3. Bir basınç sensörü ve patch kanalı 1 ve 2 (ünite 1 ve 2'ye karşılık gelir) için analog giriş kanalı numaralarını DAQ kartına atayın. "Configuration" klasöründeki "DAQchannels.csv" dosyasına kanal numarasını girin.
      NOT: Değişiklikleri kaydederken bilgileri değiştirebileceğinden, .csv dosyalarını bir elektronik tablo yerine Not Defteri uygulamasıyla açmanız önerilir.
  6. Autopatcher IG'yi çalıştırın.
    1. Amfi, mikroskop kontrol cihazı ve manipülatör kontrol cihazını açın. ensuAmplifikatör yazılımının çalışıyor olması.
    2. Autopatcher IG'yi Python ile bir komut satırı terminalinden aşağıdaki gibi çalıştırın: önce, Autopatcher IG'nin kurulu bulunduğu dizini değiştirin (komut "cd"), komut satırı terminalinde "python Autopatcher_IG.pyw" yazın ve "Giriş anahtarı.
      NOT: Autopatcher IG'yi çalıştırmadan önce manipülatör kontrol yazılımını çalıştırmayın; çünkü Autopatcher IG'nin donanım bulamamasına neden olan mikroskop sahne ve manipülatörü işgal edecektir. Manipülatör kontrol yazılımı, kontrol edilmesi gereken ilave modüller ( örn. Hat içi ısıtıcı) varsa, Autopatcher IG tamamen başlatıldıktan sonra çalıştırılabilir.
  7. Birincil pipeti kalibre edin.
    1. Daha önce açıklandığı gibi yama pipetleri çekin 9 . Çekilmiş bir cam pipeti iç çözeltiyle doldurun ve kafa aşamasına yükleyin.
      NOT: Boş cam pipetlerin altında farklı kontrastlar vardır.Ve mikroskopta hatalı kalibrasyona neden olabilir.
    2. Mikroskop görüntü alanına pipet ucu taşıyın ve odak haline getirmek. Tuş takımı manipüle edicileri ve / veya mikroskop sahnesini hareket ettirmek için kullanılıyorsa, klavyedeki "z" ye basarak koordinatlarını güncelleyin.
      NOT: Bu işlem, klavye (mikroskop kademesi: A / D - x ekseni, W / S - y ekseni, R / F - z ekseni; manipülatörler: H / K - x ekseni, U / J - y ekseni, O / L - z ekseni, 1/2 birim numarası) hareketleri kontrol etmek için kullanılır, çünkü koordinatlar gerçek zamanlı olarak güncellenecektir.
    3. Peteğin yüklendiği ilgili birim için ana Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI) üzerindeki "Kalibrasyona Başla" düğmesine tıklayın ( Şekil 2 ).
      NOT: Kalibrasyon tamamlandığında bir pop-up pencere açılacaktır.
      NOT: Kalibrasyon otomatik olarak gerçekleştirilecektir; yaklaşık 3,5 dakika sürecektir. Aynı düğmeyi tıklamak (şu an "kalibrasyonu iptal et" afTer başlatma kalibrasyonu) kalibrasyon denemesini iptal edecektir.
    4. Ana GUI'nin alt kısmındaki "kalibrasyonu kaydet" i (mevcut kalibrasyonu hem manipülatörler için kaydeder hem de gelecekte yüklenebilir) tıklayarak kalibrasyonu kaydedin.
      NOT: Düzgün çalışabilmesi için, düşük (4 veya 10X) ve yüksek (40X) büyütme alanı, ikincil kalibrasyon için hizalanmalıdır. Lütfen hizalama prosedürleri için kullanılan optik sistemin kullanım kılavuzuna bakın.

2. Otomatik Yama Sıkıştırma Prosedürü

  1. Daha önce tarif edildiği gibi akut beyin dilimleri hazırlayın 10 .
  2. Düzeltme kelepçesi için cam pipet hazırlayın.
  3. Bir beyin dilimini kayıt odasının merkezine yerleştirin. Dilimi bir dilim tutma veya "arp" ile dengeleyin.
  4. Floresan hücresi tespit edin.
    1. 4X lens altında ilgi alanını bulun. Cli'yi açarak mikroskop sahnesini hareket ettirinCk-to-move ("CTM") modunda gezinin ve ilgilenilen bölgenin merkezine tıklayın. Alternatif olarak, mikroskop aşamasını (A / D - x ekseni, W / S - y ekseni, R / F - z ekseni) taşımak için tuş takımını kullanın.
    2. Yüksek büyütme lensine geçin ve tuş takımındaki R / F tuşunu kullanarak mikroskopu z ekseninde hareket ettirerek odaklamayı ayarlayın.
      NOT: Düşük ve yüksek büyütmeli merceklerin altındaki odak düzleminin z ekseni ile aynı veya benzer olacağı şekilde su banyosu seviyesini ayarlaması önerilir.
    3. Ana GUI sütununda "Birim 0" adresindeki "Hücre Algıla" düğmesini tıklayın. Kurulumun LED veya lazer ışığı kaynağı TTL sinyaliyle kontrol edilemiyorsa, LED / lazeri elle açın; Hücre tespiti tamamlandığında bir pop-up penceresi belirecektir.
      1. Gerekirse LED / lazeri kapatın; "Bellek konumları" GUI'sinde hücre koordinatlarının bir listesi görünür. Koordinatların yanındaki "X" düğmesini tıklatarak listeden istenmeyen hücreleri kaldırın.
      2. Alternatif olarak, hedef hücreler flüoresan etiketli değilse, ana GUI'de "Fare modu" nu tıklayın. İlgilenilen hücrenin üzerine tıklayın; Bir sayı olan sarı bir nokta hücrede görünür ve hücrenin koordinatları "Bellek konumları" GUI'sinde görünür.
  5. İkincil pipeti ayarla.
    1. İç çözeltiyle 1/3 cam pipet doldurun. Pipeti kafa aşamasına bağlı pipet tutucusuna yerleştirin.
    2. Düşük büyütmeli mercek kullanın. Peti görsel alana getirin ve tuş takımını kullanarak odağı ayarlayın (H / K - x ekseni, U / J - y ekseni, O / L - z ekseni). Ünite 1 ile ünite 2 arasında geçiş yapmak için "1" ve "2" kullanın.
    3. "Kalibrasyonu yükle" yi tıklayarak birincil kalibrasyonu yükleyin. Kullanılan birim altındaki ana GUI'de "İkincil kalibrasyon" düğmesini tıklayın. Örneğin, ünite 2 kullanılırsa, "Ünite 2" bölümündeki "İkincil kalibrasyon" düğmesine tıklayınlumn. Yüksek büyütme lensine geçmek için açılır pencere yönergelerini izleyin.
  6. Hedefi hücreleyin.
    1. "MultiClamp" ( yani amplifikatör) yazılımının çalıştığından emin olun. "Patch control" GUI'sini açmak için "Patch control" düğmesine tıklayın; Bu GUI'yi açmak birkaç dakikanızı alabilir.
    2. Ana GUI "Birim 0" sütununda "40X" işaretleyerek 40X büyütme lensini kullanın. "Bellek konumu" GUI'sindeki koordinat listesindeki ilgi hücresinin yanındaki "git" düğmesine tıklayın; Mikroskop hücreye geçecektir.
    3. Bir fare tıklamasını takiben hareketi etkinleştirmek için ana GUI'de kullanılan ünitenin CTM düğmesine tıklayın. İlgilenilen hücrenin üzerine tıklayın; Pipet ucu hücrenin hareket edecektir.
    4. "Patch control" GUI'sindeki "Patch" düğmesine tıklayın.
      NOT: Otomatik yama başlayacak ve basınç ve direnç üzerinde izlenebilecektir."Patch control" GUI.
      1. Giriş sinyalini iki ünite arasında değiştirmek için "Birim 1 seçildi" düğmesini kullanın.
        NOT: Sistem hedef hücreye yaklaşır, negatif basınç uygular, hücre zarı potansiyeliyle eşleşir ve basınç ve direnç eşikleri ve mantığı serisine dayanan gigaseal oluşumunu tespit eder.
      2. "Yama kontrolü" GUI'sindeki ilgili düğmelere tıklayarak otomatik işlemi her noktada yönetin. Örneğin, düzeltme denemesini iptal etmek için tekrar "Düzeltme" düğmesine tıklayın ve eşiğe bakılmaksızın, yama sürecini bir sonraki aşamaya ilerletmek için "Sonraki aşamaya" tıklayın.
        NOT: Bir gigazal oluştuğunda bir pop-up pencere kullanıcıyı bilgilendirir ve zap'ı büyük negatif basınç ile birlikte uygulama seçeneği sunulur.
    5. Birleştirilen zap ve emme ile içeri girmek için "Evet" i seçin. Alternatif olarak, yalnızca emme ile girmek için "Hayır" ı seçin.
      NOT: Başarılı bir tüm hücre yaması tamamlandığında, kullanıcıya deneme düzeltme günlüğünü kaydetmek için bir pop-up pencere hatırlatacaktır.
    6. Deneme düzeltme günlüğünü kaydedin.
      NOT: Bir yama denemesi başarısız olursa, kullanıcıya bir açılır pencere bildirilir ve yama işlemi sıfırlanır.
    7. Adım 2.4'e dönün ve adımları farklı bir hücreyle tekrarlayın.
  7. Düzeltme eşikleri (isteğe bağlı).
    NOT: İlk pipet direnç aralığı, pozitif ve negatif basınç, devasa direnç vs için eşik değerler. Bir yapılandırma dosyasından değiştirilebilir.
    1. Sistemin kurulduğu yerde "Configuration" klasöründeki "PatchControlConfiguration.csv" dosyasını açın. Her bir eşik değerine karşılık gelen sayıları değiştirin. Değerlerin adlarını değiştirmeyin; Bu, sistemde tanınmayan girdilere neden olacaktır.
    2. Yeni eşik değerlerini hemen "Ct'ye basarak uygulayınRl + L "olarak ayarlandığında, programın yeniden başlatılması dosyadaki en yeni eşik değerini uygulayacaktır.

3. Kayıt Yapma

NOT: Bilgisayar kontrollü mikroelektrod amplifikatöründeki mod otomatik patcher yazılımı ile başarılı bir yama sağlandıktan sonra Current Clamp ("IC") konumuna getirilir. Tam hücre yama kelepçesi kayıtları, seçilen kayıt yazılımı kullanılarak yapılabilir (bu sistem bir kayıt fonksiyonu içermez). Birden fazla hedef hücre tanımlandıysa, bir kayıt bittikten sonra adım 2.4'e gidin ve başka bir hücre deneyin.

  1. Bir picospritzer (isteğe bağlı) kullanarak otomatik lokal ilaç uygulama deneyleri yapın.
    NOT: Burada, TTL sinyalleriyle harici donanımı kontrol etmek için ek "Komut Sıra" fonksiyonunun nasıl kullanılacağını açıklamak için bir örnek olarak bir yerel ilaç uygulaması denemesi kullanılır.
    1. Bağlantı noktası A cha0 ve sekonder DAQ kartı üzerindeki zemini, basamaksız bir BNC kablosu kullanarak basamaklayıcı üzerindeki başlatma tetik girişine (adım 1.2.3'te açıklandığı gibi) kesin. Sayısallaştırıcıdaki bir dijital çıkış kanalını pikspiztör üzerindeki harici tetikleyiciye bağlayın.
    2. Kullanıcı el kitabına göre pikspit yazıcının hazırlanması. Bir mikromanipülatöre bağlı olan ilaç püskürtmeli pipet tutacağı pikspritzer hava çıkışını bağlayın.
    3. Seçilen bir ilaçla dolu bir pipet yükleyin. Pipet tutucusuna takın. Adım 1.7'de açıklandığı gibi pipeti kalibre edin.
    4. Adım 2.6'da açıklandığı gibi bir hücrenin eklenmesinden sonra, "fare modu" altında kamera görünümü GUI'sini (ana GUI'den anahtarlamalı olarak) fare ile tıklayarak ilaç dağıtımında istediğiniz yeri seçin. Alternatif olarak, ızgaradaki her piksel hedef konumlardan biri olarak bir ızgarayı tasarlamak için "Izgara" GUI'yi kullanın.
      NOT: Izgara, fare ile sürükleyerek kamera görüntüsü GUI'de manipüle edilebilir.
    5. "Komuta Sırası" ndaEnce "GUI'de, ilaç pipetinin takılı olduğu manipülatör birimini seçin. İlaç dağıtımı için tüm koordinatları içe aktarmak için" fare noktalarını yükle "veya" şebeke noktalarını yükle "yi tıklayın.
      1. Sağ sütundaki belirli komut TTL sinyalini düzenlemek için her koordinat girişini tıklayın. İlk komut girdisinde, en sağdaki basamağı tıklayarak "0" dan "1" e çevirin ve + 5 V TTL sinyal gönderin. Saati (T) istediğiniz TTL sinyal süresine, ms cinsinden ayarlayın.
      2. İkinci komut girişinde, tüm basamakları "0" olarak ayarlayın ve T'yi denemenin kayıt uzunluğunun süresine ayarlayın. Tüm koordinat girdileri için komutları düzenleyin. Birden fazla TTL sinyali gerekiyorsa "+" işaretini tıklatarak komut girdileri ekleyin.
        NOT: 8 basamaklı bitler, gerekirse, ikincil DAQ'da (portlar 1 - 3 pompayla ve iki valf tarafından işgal edilir) 0 - 7 numaralı A kanallarını gösterir.
    6. Veri toplama modülünde bir kayıt protokolü oluşturun böyleceBir taramanın başlangıcı harici başlatma tetikleyicisi tarafından tetiklenir. İlacın istenilen zamanda verilmesi için protokolü düzenleyin.
    7. "Komut Dizisi" GUI'sinde, tüm koordinatları çalıştırmak için soldaki "Çalıştır" ı tıklayın. Alternatif olarak, yalnızca seçilen diziyi çalıştırmak için sağdaki "Çalıştır" ı tıklayın.
      NOT: Pipet, her bir koordinatta hareket edecek ve kayıt süpürme işlemini başlatmak için TTL sinyalini tanımlandığı şekilde yürütülecektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistemimiz akut beyin dilimleri, fare ile uyarılmış Pluripotent Kök Hücreler (iPSC'ler) nöronlara ayırdıklarında hücreleri düzeltme yeteneği ve yapay olarak ilgi kanallarını ifade eden HEK 293 hücreleri üzerinde test edilmiştir. Şekil 3 , görsel kortekste floresan olarak etiketlenmiş tabaka 5 piramidal nöronları hedefleyen Thy1-ChR2-YFP transgenik farelerini (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) kullanan bir deney göstermektedir. Hedef hücre, otomatik ola...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, in vitro olarak otomatik görüntü yönlendirmeli yama tutma kayıtları için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu işlemin ana adımları aşağıda özetlenmiştir. Birincisi, bilgisayarla görme, mikroskop kullanılarak elde edilen bir dizi görüntü kullanarak pipetin ucunu otomatik olarak tanımak için kullanılır. Bu bilgi daha sonra mikroskop ile manipülatör koordinat sistemleri arasındaki koordinat dönüşüm fonksiyonunu hesaplamak için kullanılır. Bilgisayarla görme, flüoresan etiketli hücreleri otomatik olarak algılamak...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçici olmayan patent başvurusu "SİSTEMLER VE YÖNTEMLER OTOMATİK GÖRÜNTÜ YÖNLENDİRİLMİŞ YARIM-KPLAMP ELEKTROFİZYOLOJİSİNE VİTRO," ABD Seri No: 15 / 353,719, 16 Kasım 2016, Ref. No: PRF 67270-02.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Whitehall Vakfı'ndan maddi destek için minnettarız. Değerli yorumları için Samuel T. Kissinger'e teşekkür etmek istiyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CCD KameraQImagingRolera Bolt
Elektrofizyoloji teçhizatıScientificaSliceScope Pro 2000Mikroskop ve manipülatörleri içerir. Bu el yazmasında gösterilen üretici tarafından sağlanan manipülatör kontrol yazılımı " Linlab2 ".
AmplifikatörMoleküler CihazlarMultiClamp 700Bbilgisayar kontrollü mikroelektrot amplifikatörü
SayısallaştırıcıMoleküler CihazlarAxon Digidata 1550
LED ışık kaynağıSoğuk LEDpE-100488 nm dalga boyu
Veri toplama kartıÖlçüm HesaplamaUSB1208-FSİkincil DAQ.
Şu kılavuza bakın: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valflerLee Co.
Hava pompasıSanal endüstriVMP1625MX-12-90-CH
Hava basıncı sensörüFreescale yarı iletkenMPXV7025G
Dilim tutmaWarner instruments64-1415 (SHD-40/2)Dilim Ankraj Kiti, RC-40 için Düz Odacık, 2,0 mm, 19,7 mm
PythonAnacondasürüm 2.7 (Windows için 32 bit)https://www.continuum.io/downloads
Vidalı TerminallerSparkfunPRT - 08084Vidalı Terminaller 3,5 mm Aralık (2 Pimli)
(2 Pimli)
N-Kanal MOSFET 60 V 30 ASparkfunCOM - 10213
DIP Soketler Lehim Kuyruğu - 8 PimliSparkfunPRT-07937
LED - Temel Kırmızı 5 mmSparkfunCOM-09590
LED - Temel Yeşil 5mmSparkfunCOM-09592
DC Namlu Güç Jakı/Konektörü (SMD)SparkfunPRT-12748
Duvar Adaptörü Güç Kaynağı - 12 V DC 600 mASparkfunTOL-09442
Bağlantı Kablosu - Çeşitler (Katı Çekirdek, 22 AWG)SparkfunPRT-11367
Kilitleme Erkek x Dişi x Dişi MuslukARK-PLASRCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Esnek BorularFisher scientific14-171-129Dış Çap: 1/8 inç
İç Çap: 1/16 inç.
BNC erkek - BNC erkek koaksiyel kabloBelkin BileşenleriF3K101-06-E
560 Ohm Direnç (% 5 tolerans)Radioshack2711116
PicospritzerGenel VanaPicospritzer II
LHDA0531115H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  2. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  3. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
  4. Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
  5. Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
  6. Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
  7. Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630(2013).
  8. Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
  10. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
  11. Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
  12. Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Automated Patch ClampImage Guided Patch ClampWhole Cell Patch ClampAcute Brain SlicesComputer Vision AlgorithmFluorescent Cell DetectionMicromanipulator ControlInternal Pipette PressureElectrical Resistance MonitoringGigaseal Formation

Related Articles