Yöntem makalesi

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

7.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56035

⸱

1 Şubat 2018

1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Bu makalede

Özet

Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

Özet

Genom düzenleme mutant satırların yaratılması çoğu canlıda genetik analiz hızlanıyor. CRISPR/Cas9 yöntemleri Afrika pençeli kurbağası, Xenopus, uzun süredir devam eden model organizma biyomedikal araştırmalar için kullanmak için adapte edilmiştir. Homozigoz mutant hatları ile mutagenesis CRISPR/Cas9-hedef oluşturmak için geleneksel ıslah düzenleri çeşitli zaman alan ve zahmetli adımlar var. Özellikle embriyo için gerekli olan genlerin dışarı vurma ile ilişkili engelleri aşmak için mutant embriyo oluşturulması kolaylaştırmak için leapfrogging adlı yeni bir yöntem geliştirildi. Bu teknik Xenopus embriyo "kes ve Yapıştır" sağlamlık güçlendirir embriyoda yöntemleri. Leapfrogging primordial germ hücreleri (PGCs) transferini PGC-ablated wildtype kardeşler verimli bir şekilde mutagenized donör embriyo kullanır. Bu yöntem için temel gen mutasyon verimli chimeric hayvanları içeren bir mutant germline taşıyan wildtype somatik hücreler oluşturarak sağlar. Ne zaman iki F0 hayvan taşıyan "birdirbir nakli" (Yani, mutant germ hücreleri) intercrossed, böylece fenotipik verileri elde etmek için tam üretimi zamandan tasarruf homozigoz veya bileşik heterozigoz, null F1 embriyolar, ürettikleri. Leapfrogging de yeni bir yaklaşım CRISPR/Cas9 mutagenesis takip F0 fenotipik analiz için ateşe dayanıklı anne etkisi genler analiz etmek için sağlar. Bu el yazması PGC nakli başarıyla gerçekleştirmek nasıl üzerinde durularak leapfrogging yöntemi ayrıntıları.

Giriş

Nasıl kodladığını genotip fenotip yeniden keşfi beri Biyoloji Mendel'ın yasaları büyük bir soru olmuştur. Genler, onların yönetmelik ve etkileşimleri gen ağları içerisinde rolleri ve işlevleri açığa çıkarmak yeni Biyoloji ve hastalık durumlarında ameliorating araçları sağlamak için kodlanmış ürünleri vaatlerin bir anlayış. Yarım yüzyıl1için, Afrika pençeli kurbağası Xenopus, temel Biyoloji ve Biyomedikal geliştirme genetik kontrolü de dahil olmak üzere, çok çeşitli konular üzerinde çalışmalar için önde gelen bir model olmuştur. Tarihsel olarak, çoğu araştırma Xenopus allotetraploid kurbağa, X. laevis, kullandı ama son zamanlarda, onun diploidy nedeniyle X. tropicalis bir amfibi genetik model olarak geliştirilmiştir. Komple genom dizileri hem Xenopus türler2,3monte edilmiştir. "Kurbağa" Şimdi bir dönüm noktasında nerede temel genom değişiklik teknoloji eğitim gen işlevinin hemen hemen at will ruhsatı topluluktur. Programlanabilir CRISPR/Cas9 endonucleases gen mutagenesis yüksek verimli, biallelic mutasyon mümkün çoğu hücrelerde hayvan4,5,6,7ile yapmış, 8,9,10,11. Bu çalışmalar, Bhattacharya vd tarafından vurguladı 12 ve Shigeta vd. 13, birçok genlerin fonksiyonun F0 mozaik hayvanlarda mutagenesis tarafından okudu olabilir göstermiştir. Bu yaklaşım pek çok avantajı vardır; Ancak, Cas9-sgRNA-microinjected embriyo çoğunlukla nedeniyle eksik işlev (LOF) kaybı değişken fenotipleri görüntüler. Daha da önemlisi, mutant satırları bazı uygulamalar için son derece avantajlı olduğunu — bir anne mRNA katkı var genler okurken özellikle. Anne mRNA'ların ve proteinler ve onların etkileri epigenetik üzerinde uzun bir süre için erken gelişimsel katkıları pek çok gen işleme embriyogenez14,15,16, kalıcı Refrakter F0 analiz için. Bu nedenle, diğer LOF yaklaşımlar gereklidir.

Mutant satırları oluşturmak Aradığınız zaman, çeşitli engeller homozigoz LOF embriyo elde etmek için yolu vardır. Çünkü cinsel olgunluk, uygun bir çizgi üretimi ile müdahale için hayatta yetersizliğinde temel gen işlev sonuçlar biallelic mutasyonları üretmek için ilk, verimli mutagenesis dezavantajlı olabilir. Cas9-sgRNA teslim miktarı dikkatli titrasyon ortak bir çözümdür. Amaç da germline mutagenesis verimliliği en üst düzeye ölümcül azaltmak arasında bir denge elde etmek için burada. İkinci bir sorun nerede fenotipik analizleri F2 nesil kadar ertelenmiş standart üreme düzeninden doğar. Standart yaklaşım kullanarak, mutant gen germline aracılığıyla "hangi sonra cinsel olgunluğa yetiştirilmektedir F1 heterozigoz taşıyıcılar", üretmek için outcrossed iletimi F0 hayvanlar cinsel olgun. İki F1 heterozygotes sonra F2 mutant embriyo % 25 bir beklenen Mendel frekansta üretmek için intercrossed. Böylece, iki kuşak ıslahının mutant fenotipleri analizi için gereklidir. Mutant hayvanlar ya homozygotes ya da bileşik heterozygotes (F1 intercross içinde kullanılan ebeveyn hayvanların genotip bağlıdır içeren iki farklı mutant gen,Yani, döl) olabilir.

Hangi leapfrogging17adlı yeni bir yöntemi altında yatan programlanabilir nükleaz aracılı mutagenesis germ hücreleri, hapsetmesi tarafından bu engellerin üstesinden gelebilir. Leapfrogging iki ana bileşeni vardır: (1 mikroenjeksiyon Cas mRNA ile birlikte sgRNA veya nükleaz-sgRNA kompleksleri (veya, ilke, TALENs veya çinko parmak enzimler) embriyonik genom verimli bir şekilde mutagenize için tek hücreli aşamada takip (2) tarafından PGCs nakli içine wildtype kardeş embriyolar, nerede endojen PGCs çıkarıldı. Her iki adım mutant germ hücreleri ile verimli, tam germline replasmanı olduğunda elde edilebilir. Blackler 1960'ların başında Xenopus PGCs geç neurula, embriyo ve erken tailbud aşamaları18,19arasında nakledilen gösterdi. Leapfrogging için Blackler'ın yaklaşımı PGCs embriyo20,21bitkisel kutbunda yerelleştirilmiş zaman blastula aşamasında17, nakillerine gerçekleştirerek güncellenmiştir. Nakli gastrulasyon önce iki ana avantajı vardır. İlk olarak, nakli ve sonraki normal gelişim engraftment ekimi blastula aşamasında (yayınlanmamış gözlemler) gerçekleştirildiğinde daha verimli olmasını bulundu. İkinci olarak, kısa bir süre zygotic transkripsiyon başladıktan sonra blastula aşamasında nakillerine gerçekleştirerek, bir gelişimsel gen gastrulasyon veya bu bozabilir mutasyonlar, aksi halde hatalı biçimlendirilmiş geç neurulae için yol kaynaklanan ölümcül önleyebilirsiniz. PGC nakli taşıyan embriyolar ("başkanıkendini") için cinsel olgunluğa yetiştirilen ve intercrosses bu F0 hayvanlar arasında birçok durumda, F1 döl % 100'ünü (çoğu bileşik varlık LOF fenotip görüntülemesini göstermiştir heterozygotes), tam germline değiştirme ile hedeflenen mutasyonlar gösteren.

Bu leapfrogging Xenopusgenetik yaklaşımlar hızlanır bekleniyor. Anne etkisi genler (yayınlanmamış gözlemler) LOF analizi için alternatif "transfer ev sahipliği" yöntemi22 sağlar Ayrıca leapfrogging. Geçerli yayında özellikle PGC nakli üzerinde odaklama yöntemi, ayrıntılı bir açıklama X. tropicalis içinde ( X. laevisiçin küçük değişiklikler) sunulur. PGCs nakli burada Xenopusile çalışan diğer laboratuvarlar bu teknolojinin daha hızlı bir transfer kolaylaştırmak için gösterilmiştir. Bu yöntemin ilkeleri diğer kurbağalar (Örneğin, urodeles) başarılı olmalı ve metodoloji olarak organizma özel değişiklikleri uygulama verimli mutagenesis gerçekleştirilebilir birçok hayvan için izin vermelidir ve PGCs kolayca transplantable.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve University of California, Irvine kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması.

1. PGC nakli hazırlıkları

  1. Diseksiyon araçları peşin, yukarıda açıklanan23hazırlayın.
    Not: Kaş saç bıçak embriyo ameliyatları gerçekleştirirken stabilize etmek için saç döngüsü yardımı ile insizyon yapmak için kullanılır. Kaş kıllar ve saç döngüler önce bir alev içinde çizilmiştir borosilikat Pasteur Pipetler cam içine yapıştırılmış ve inceltilmiş kısmı üzerinde kırık ( şekil 1A, bkz: ok ucu) daha kısa, dar ipucu (şekil 1B) için daha fazla beceri oluşturmak için ameliyatları gerçekleştirirken.
  2. SgRNAs yordamlar yukarıda açıklanan24 kullanarak oluşturun.
    Not: Kısaca, sgRNAs için kodlama kısa DNA şablonları bir hata içermeyen, opsonins DNA polimeraz ile komplementer 5' bakteriyofaj T7 rehberleri ve "dolu" içeren örtüşen deoxyoligonucleotides kullanarak oluşturulur. Vitro sgRNA sentez reaksiyonları (kullanılan seti bağlı olarak) bir gecede birkaç saat inkübe. Tepkiler Dnaz şablonu kaldırmak için tedavi. SgRNAs fenol/kloroform çıkarma ve amonyum asetat/isopropanol bulutlu, seti üreticisinin yönergeleri24göre standart yöntemlerle saf.
  3. Kısa bir süre microinjections gerçekleştirmeden önce Cas9-sgRNA kompleksleri hazırlamak ilk denaturing ~ 250 tarafından RNAse free (diethylpyrocarbonate-tedavi) H2O 60-65 ° c 5 dk, 3 µL toplam hacmine sgRNA ng takip hızlı soğutma tarafından on Ice 5 min için. SgRNA bir kaç saniyeliğine santrifüj kapasitesi, 1 µg/µL Cas9 protein 1 µL ekleyin ve 10 dk 37 ° C'de karmaşık oluşumu teşvik etmek için kuluçkaya.
    Not: Bu kuluçka tüp buza mikroenjeksiyon için embriyo hazırlarken tutulabilir.
  4. X. Tropicalis embriyo vitro fertilizasyon standart yöntemlerle, yukarıda açıklanan25elde. 25,26 de-jöle 10 dk sonrası döllenme, embriyo.
    Not: Gübreleme zamanı kabul edilir zaman sperm süspansiyon yumurta eklenir ve çanak 1/9thX ile sular altında olduğunu sonra Marc'ın modifiye Ringers (MMR)26. X. Tropicalis25, X. laevis, aksine gerçekleştirmek için de-1/9'jellying x MMR % 3 sistein ücretsiz Bankası (değil HCl tuzu), içeren birden fazla yıkama 1/9 tarafından pH 7.8-8.0 için ayarlanmış takip x MMR. Bir özel (% 1) embriyo transferi-boyalı çanak 1/9 içeren x MMR oda sıcaklığında.
  5. Hemen içeren 1 %1 özel kaplı bir yemek için enjekte edilebilir embriyo transfer Pasteur pipet kullanarak x MMR.
  6. 1-hücre aşamada enjekte. Başvurular26,27 Xenopus mikroenjeksiyon yöntemleri ayrıntılı açıklamaları için bkz.
    1. Hayvan pole, tek bir sitede her embriyo 4 ile enjekte nL Cas9-sgRNA Kompleks (son tutar = 1 Cas9 ve sgRNA ~ 250 pg ng; bkz: tartışma)24. Enjeksiyon Makinası şifa 10-20 dakika sonra 1/9 içeren bir özel kaplı yemek için embriyo transfer x MMR ve 25 ° C'de kuluçkaya Ayrıca uninjected kardeş bir fincan greft alıcılar görev yapacak embriyo oluşturun.
  7. ~ 5 mm içeren Petri tabak (60 mm) hazırlamak-0,3 içinde yapılan % 1'özel kalın tabaka nakillerine X. tropicalisveya 1 Eğer x MMR, x MMR X. laevisiçin.
    1. Çöküntü ~ 3-4 oluşturmak mm derin bir 3 ekleyerek-x (96-şey PCR plaka kesim tarafından oluşturulan) 4-şey kalıp içine erimiş özel plakaları dökme zaman (bkz: şekil 1 c ve D). Kalıp birkaç milimetre kadar özel sertleştirilmiş bir yüzük standına bağlı bir kelepçe kullanarak Petri kabına alt yukarıda tutun.
    2. Ayrıca, bir 24-şey plaka wells ile yapılan 1/9 ' % 1'özel ince bir tabaka kaplama tarafından ev bireysel embriyolar için yapmak x MMR.
      Not: Kültür bu kuyuları için eklendi 1/9 x MMR viomisin sülfat/mL 50 µg ile desteklenmiş ortamıdır.

2. PGCs nakli

  1. Ne zaman Nieuwkoop ve Faber28 blastula aşamasında 9 (şekil 2A), ~4.5 h ulaşmak sadece embriyoların sonrası döllenme (hpf) X. tropicalisiçin 25 ° C kuluçka makinesi çıkarıp ve oda sıcaklığında ek için equilibrate izin 0,5 h.
  2. 5 nakli başlamak için hpf (şekil 2B), kullanmak Pasteur pipet (Cas9-sgRNA ile enjekte) bir PGC donör embriyo transferi (1.7. adımda oluşturduğunuz) çöküntü içinde 0,3 içeren 60 mm özel yemek için x MMR (veya 1 X. laeviskullanıyorsanız x MMR). Ayrıca bir uninjected kardeş embriyo, greft alıcıya bu çanak transfer.
    Not: Her biri bu embriyoların kimlikleri değil karışık önemlidir.
  3. El ile vitelline zarflar forseps kullanarak her embriyo kaldırmak ve böylece onların bitkisel Polonyalılar görünümünde ve ameliyat için erişilebilir her iki embriyo döndürün.
    Not: El ile de-vitellination embriyo açıklaması daha önce açıklanan26oldu.
  4. Bir kaş saç bıçak keskin ucu kullanarak, nerede blastopore işaretlemek gelecekteki şişe hücreleri oluşturacak bölge içinde alıcı embriyo bitkisel kutup bir kare şeklinde dört Sığ kesik olun. İnsizyon hemen altında yüzey ve yukarı doğru hareketleri saç döngüsü ile embriyo sabitleme Dilimleme olun embriyo içine kaş saç bıçak ucu ekleyerek olursunuz.
    Not: Yarım aralıklarla 4.5-7.0 hpf göstermek belgili tanımlık cep büyüklük ve şişe hücreleri (kesik çizgili beyaz daire) nerede oluşturacak tahmin etmek için bir kılavuz sağlamak için Şekil 2 bitkisel bir embriyo görünümlerini gösterir. Amaç kesik kesik kara kutu nerede belirtilir hale getirmektir.
  5. Bir kez kare dört tarafı kesikler tarafından belirlenen, her kesi bir derinlik, yaklaşık 1/3 1/2 mesafe blastocoel yere ulaşmak için benzer kesme hareketleri kullanarak kaş saç bıçakla derinleştirmek.
  6. Bitkisel doku explant alıcı embriyo ücretsiz (şekil 3A ve B) bir yatay (bitkisel yüzeye paralel) yaparak derin bitkisel bölgesinde cut(s).
    Not: PGC içeren bitkisel explant yaklaşık 0,4-0.45 mm yan başına ve 0,25-0.3 mm derinlemesine boyutudur. Bu bitkisel explant alıcı embriyo artık gerekli değildir ve bu nedenle bir kenara atılmak üzere ayarlanmalıdır.
  7. Hızlı bir şekilde çalışma, bu yordamı (Adım 2,4-2,6) PGC donör embriyo nakli için benzer şekilde ölçekli bitkisel doku parçası oluşturmak için yineleyin.
    Not: Bu ikinci diseksiyon onun açık yara iyileşmesi alıcı embriyo süresini en aza indirmek için küçük gecikme ile gerçekleştirmek önemlidir.
  8. Bir kez PGCs içeren doku donör embriyo kaldırılır, kaş saç bıçak ve saç döngü içine alıcı embriyo oluşturulan açılması bulunduğu bu explant taşımak için kullanın.
    Not: Alıcı embriyo iç donör greft iç yüzeyine karşı karşıya gerekir. Alıcı embriyo ile greft ventral dorsal ve sol-sağ eksen yönelimleri eşleştirmek gerekli değildir.
  9. Greft yüzeyine paralel düzenlenen kaş saç bıçak mili uzun kenarını hafifçe bastırın greft içine alıcı embriyo bitkisel yüzeyine açılış için kullanın.
  10. Greft yerleştirildi, bir hairloop veya bir kaş saç bıçak mili donör embriyo "karkas" özel yüzey üzerinde ve bir özel depresyon içine yavaşça kaydırın kılabilmesi için. Karkas açık yara toplu sıvı dönük olduğundan emin olun. Eğer değilse, bu yönlendirme ulaşmak için embriyo döndürmek için kaş saç bıçak kullanın.
  11. Yerde, bitişik bir depresyon içine şifa greft ile alıcı embriyo slayt ve aynı şekilde aşılı bitkisel pole doku toplu sıvı dönük olduğundan emin olun.
  12. Başka bir organ nakli/karkas çifti oluşturmak için başka bir çifti donör ve alıcı embriyo kullanarak bu yordamı (adımları 2.1-2.11) yineleyin; bunları boş çöküntü aktarın.
    Not: Bir karkas ve nakli taşıyan embriyolar uyumlu çiftleri izlemek için gösterimler yapar önemlidir. Donör leşleri Cas9 sgRNA bağlı mutagenesis nakli taşıyan hayvanlar cinsel olgunluğa ulaşana kadar hangi kolayca denetlesinler cant transplante PGCs içinde verimlilik için bir proxy olarak kullanılan (bkz. Adım 3.3, aşağıda ve tartışma ).
  13. Embriyo yaklaşık 6,5 yaklaşık erken gastrula etap 10, ulaşana kadar nakli yapmaya devam X. tropicalis yılında hpf (bkz. şekil 2E).

3. embriyo bakım sonrası iyileşme

Not: ~ 30 dakika içinde yerine Greftler iyileşmek ve hücre lizis embriyo (şekil 3 c) yayan yolky bazı enkazı gözlemlemek için normaldir.

  1. Sonra iyileşti, Pasteur pipet çok yavaşça transfer embriyoların çöküntü bir özel kaplamalı 24-şey plaka bireysel wells için kullanabilirsiniz. Çıktı olacak (şekil 3D) aktarım sırasında karıştırma sıvı tarafından kaldırıldı.
    1. Bunlar bitkisel kadar toplu çözüm karşı karşıya kutup yerleştirilir embriyo döndürür. Yine, donör leşleri yerleştirin ve embriyo çiftleri takip içinde yardımcı olmak için alıcılar bitişik Wells grefti; Bu bilgileri kaydeder.
  2. Gecede kültür için 25 ° C kuluçka için embriyo içeren 24-şey plaka aktarın.
    Not: Ertesi gün, embriyo tailbud aşamaları ulaşmış.
  3. Özel kaplamalı 6-şey plakaları viomisin sülfat/ml, iyi başına 1 embriyo ile 50 µg ile MMR takıma 1/9 x içeren temizlemek için greft alıcılar taşıyın. Bunlar maç donör leşleri açık bir kaydını tutmak grefti alıcılar.
  4. Mutagenesis verimliliği sıralama PCR amplicons5,17,24 ya da PCR amplicons ( tartışmabakın) kullanan diğer yöntemleri kullanarak değerlendirmek için 0.2 mL PCR şerit tüpler için bireysel leşleri taşıyın. Orta çoğunu kaldırın ve alçalarak P200 pipet kullanarak pipetting K (PK) tarafından tekrarlanan İndinavir içeren 100 µL lizis arabellek24 ' te lunaparkçı.
  5. Embriyo lizis24 PK sindirim izin vermek için bir gecede 6 h için 56 ° C'de gerçekleştirin. Bu 90-95 ° C-10 dk hızlı 4 ° C'ye soğutma tarafından takip için Isıtma tarafından PK devre dışı bırakma Lysates daha fazla temizleme adımları olmadan doğrudan Sanger DNA sıralama24için kısa amplicons elde etmek için PCR reaksiyonları tohum için kullanın. Lysates-20 ° C'de depolayın
    Not: Birkaç gün içinde Kurbağa yavrularını besleme aşamaları (yaklaşık sahne 45-46) ulaşacak ve bir süspansiyon planktonik tozu (sera Micron)-ebilmek var olmak fed.
  6. Temizlik korumak ve mikrobiyal büyüme, en aza indirmek için kültür ortamının günlük değişimleri ile ~ 1 hafta sonra damla akış ile dolaşan bir su sisteminde küçük tanklar için Kurbağa yavrularını taşımak. Sıralama veri iribaşlar Kurbağa yavrularını üzerinden son derece verimli bir şekilde mutagenized PGCs ile alt mutagenesis verimlilik ile ayırmak için kullanın. Metamorfoz tamamlandıktan sonra froglets laboratuar yetişkin su sisteminde taşıyın.
    Not: Ulusal Xenopus kaynak (deniz Biyoloji Laboratuvarı, Woods Hole, MA) tarafından geliştirilen rejimleri29 ve yetişkin kurbağa bakım30besleme kurbağa yavrusu için bir kılavuz sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ekimi, nitel CRISPR/Cas9 mutagenesis etkinliğinin belirlenmesi hayvancılık büyümek ve cinsel olgunluğa hayvanları korumak için çaba sokmaksızın önce gerçekleştirilmelidir. Birdirbir nakli taşıyan hayvan somatically wildtype ve germline doğrudan ölçülerini erişmek zordur çünkü donör embriyo mürekkep tasarrufu önemli hale gelir. Mürekkep DNA analizinden transplante germline17' oluşur mutagenesis kapsam için bir vekil olarak hizmet vermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu rapor, nakli PGCs PGCs. içeren bitkisel doku nakli için detaylı bir protokol genom düzenleme teknolojileri (Örneğin, CRISPR/Cas9) ile birlikte germline değiştirmek için kullanılır bir hayvan sağlar Neredeyse tüm onun somatik dokuların genetik olarak vahşi türü olarak sürdürmek. Leapfrogging için başarılı olmak için bir dizi performans gösteren nakillerine gerçekleştirmeden önce dikkat edilmesi gereken kritik faktör vardır.

Germline tam yedek mutant gen ile emin olmak için bir ilk s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Teşekkürler

Bu eser bir hibe desteği ile gerçekleştirilen 5R21HD080684-02, Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan gelişimi. Yazar Ken Cho onun sürekli coşku ve destek için teşekkür etmek istiyor. Yazar ayrıca değerli için Bruce Blumberg kamerasını, Rebekah Charney, el yazması ve Sean McNamara ve Marcin Wlizla Ulusal Xenopus kaynak (RRID:SCR_013731), eleştirel okuma kullanımı için kabul etmek istiyorum X. tropicalis beslenme ve hayvan bakımı rejimleri ile ilgili konuşmaları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dumont #5 forsepsGüzel Bilim Araçları11252-20 veya 11252-30
Kaş kılı bıçağıEv yapımı
Saç halkasıEv yapımı
Pasteur pipetleri, borosilikat camFisher Scientific13-678-20A
Krazy Glue (Siyanoakrilat bazlı)Elmer's Products, Inc.KG581Kaş kıllarını ve kıl halkalarını Pasteur pipetlerine yapıştırmak için diğer benzer yapıştırıcılar kullanılabilir.
Oligodeoksinükleotidler, özel siparişedilen Entegre DNA TeknolojileriÖzel siparişedilen Şablon sgRNA sentezi için oligolar, tasarım detayları için Nakayama ve diğerleri, 2014'e bakın.
Megascript T7 kitiAmbion/ThermoFisherAM1334Veya Megashortscript T7 (AM1354) kiti
kullanın Fenol, Tris tamponluHerhangi bir ticari tedarikçiden yüksek kaliteli damıtılmış fenol
KloroformHerhangi bir ticari tedarikçiden yüksek kaliteli kloroform
EtanolHerhangi bir ticari tedarikçiden
yüksek kaliteli etanolDietilpirokarbonat (DEPC)Sigma Chemical Co.D5758-50ML
Cas9 proteini, nükleer lokalizasyon sinyali ilePNA Bio, Inc.CP01Üreticinin tavsiyelerine göre DEPC ile arıtılmış su kullanılarak sulandırıldı
10X Marc'ın Modifiye Zil Sesi çözümüEv yapımı. 1X MMR (EDTA içermeyen) için tarif (ref 26) 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES'tir. Çözeltinin pH'ı 7.4'e ayarlanır.
AgarozHerhangi bir Moleküler Biyoloji sınıfı agaroz yeterlidir
60 X15 mm Petri plakalarıFalcon351007
24 kuyulu plakalarFalcon3047
L-CysteineSigma Chemical Co.C7352-100GSerbest baz, HCl tuzu
değil Proteinaz KRoche03 115 828 001
Kurbağa yavrusu yeminden ~ 20 mg / ml. Büyüme ortamında yeniden süspansiyon haline getirin. Çeşitli çevrimiçi perakendecilerden satın alınabilir
Tipik olarak Roche sera Micron sera

Kaynaklar

  1. Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
  2. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  3. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  4. Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
  5. Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  6. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  7. Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15(2015).
  8. Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
  9. Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22(2016).
  10. Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
  11. Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
  12. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  13. Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
  14. Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148(2015).
  15. Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  16. Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
  17. Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  18. Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
  19. Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
  20. Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
  21. Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
  22. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
  23. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
  24. Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
  25. Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  27. Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
  28. Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
  29. Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
  30. Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
  31. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168(2014).
  32. Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
  33. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  34. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157(2014).
  35. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
  36. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  37. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  38. Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861(2012).
  39. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587(2015).
  40. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  41. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282(2014).
  42. Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
  43. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  44. Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
  45. Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
  46. Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR Cas9 MutajeneziXenopus EmbriyolarLeapfrogging Tekni iGerm hatt letimiVejetatif Kutup CerrahisiEmbriyo GreftiF1 Mutant AnaliziDon r DNA AnaliziEsansiyel Gen Nakavt

İlgili makaleler