Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için

16.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56037

⸱

18 Ağustos 2017

 , 
1Langone Medical Center, New York University

Bu makalede

Özet

Burada iletişim kuralları için deterjan-Alerjik homojenizasyon kültürlü memeli hücrelerinin azot kavitasyon ve sonraki sitozolik ve membran bağlı proteinler ayrılması ultrasantrifüj tarafından dayalı mevcut. Bu yöntem periferik membran proteinlerinin çözünür arasındaki bölümleme izlemek için idealdir ve membran kesirler.

Özet

Kültürlü hücrelerin periferik zar proteinleri de dahil olmak üzere proteinlerin hücre altı dağıtım eğitimi için yararlıdır. Genetik olarak kodlanmış fluorescently tagged proteinler hücre altı protein dağıtım çalışmanın devrim. Ancak, özellikle proteinler kısmen sitozolik olduğunda floresan mikroskopisi, dağılımıyla ölçmek zordur. Ayrıca, bu kez endojen proteinler çalışma önemlidir. İmmunoblots miktar protein dağıtım sonra hücre altı ayırma için altın standart kalır gibi biyokimyasal deneyleri. Sitozolik veya belirli membran kesirler ayırma amacı ticari kitleri olmakla birlikte, bu kitleri çoğunu ayıklama membranlar kolayca ayıklanır periferik membran proteinlerinin eğitim için uygun olmayan deterjanlar ile temel alır. Burada bir deterjan-Alerjik protokol hücresel homojenizasyon için azot kavitasyon ve sonraki ayrılması sitozolik ve membran bağlı proteinler tarafından ultrasantrifüj tarafından mevcut. Biz hücre altı organelleri çözünür içinde ayrılması ve Pelet kesirler farklı hücre türleri arasında onaylayın ve protein ayıklama birkaç ortak mekanik homojenizasyon deterjan tabanlı olmayan yöntemler arasında karşılaştırın. Azot birkaç avantajları arasında kavitasyon hassas organelleri en az fiziksel ve kimyasal zarar ile hücresel bozulma üstün verimliliği olduğunu. Ultrasantrifüj ile birlikte, azot kavitasyon sitozolik arasındaki periferik membran proteinlerinin kayma incelemek için mükemmel bir yöntem olduğunu ve membran kesirler.

Giriş

Hücresel proteinler iki sınıfa ayrılabilir: membranlar ve olmayanlar ile ilişkili olan o. Sigara-membran ilişkili proteinler sitozol, nucleoplasm ve endoplazmik retikulum (ER) gibi organellerin lumina bulunur. Membran ilişkili proteinler, integral ve periferik iki sınıf vardır. Bir veya daha fazla parçadan polipeptid zinciri yayıldığı için membran, genellikle bir α-helix hidrofobik amino asitleri oluşur olarak integral membran proteinlerinin transmembran proteinler da verilir. Transmembran proteinler membran onların sentezi sırasında co-translationally takılan ve onlar catabolized kadar çok yapılandırılmış kalır. Periferik membran proteinlerinin ikincil olarak membranlar, genellikle bir sonucu olarak post-translational değişiklik lipidler hidrofobik moleküllerin ile tahrik edilmektedir. İntegral membran proteinlerinin, aksine periferik membran proteinlerinin dernek hücresel membranlar ile geri alınabilir ve düzenlenmiş olması. Birçok çevresel membran proteinleri işlev sinyal yolları ve membranlar ile düzenlenmiş Derneği etkinleştirme veya inhibe bir yol için bir mekanizmadır. Periferik membran proteinidir bir sinyal molekülü küçük GTPazlar, RAS örneğidir. Bir dizi değişiklik ile farnesyl lipid içeren translasyonel modifikasyonlar sonra değiştirilmiş C-terminus olgun bir RAS protein hücre membran sitoplazmik broşürü ekler. Özellikle, plazma zarı nerede onun aşağı akım efektör RAF1 RAS yürütmektedir olduğunu. Mitojenle-aktive protein kinaz (MAPK) aktivasyonu bünye önlemek için birden çok düzeyde denetimler RAS yerdesiniz. RAS etkin olmayan GTP GSYİH hidrolize tarafından render yanı sıra, etkin RAS da plazma zarı antenler, deðiþiklikler veya amil-e doğru sinyal inhibe çözücü ile etkileşimler tarafından azat edilebilir. Floresan canlı görüntüleme hücre biyologları protein öğesini floresan periferik membran protein1hücre altı lokalizasyonu gözlemlemek için fırsat tanıyor olsa da, orada kalır membran Derneği değerlendirmek için kritik bir ihtiyaç basit biyokimyasal yaklaşımlarla yarı kantitatif endojen proteinler.

Membran ve çözünür kesirler arasında protein bölümleme doğru biyokimyasal değerlendirme eleştirel iki faktöre bağlıdır: hücresel homojenizasyon ve membran ve çözünür kesirler verimli ayrılması. En yaygın olarak kullanılan ticari kitleri dahil olmak üzere bazı iletişim kuralları üzerinde deterjan tabanlı cep homojenizasyon bağlı olsa da, bu yöntemlerin çözünür aşama2membran proteinlerinin ayıklayarak analiz karartmak. Buna göre deterjan bazlı, mekanik yöntemler hücre bozulma temiz sonuçlar sağlar. Hücre kültüründe yetiştirilen veya kan ya da organ hasat mekanik bozulma birkaç yöntem vardır. Bu Dounce Homojenizasyon, ince iğne bozulma, rulman Homojenizasyon, sonication ve azot kavitasyon içerir. Burada azot kavitasyon değerlendirmek ve diğer yöntemler için karşılaştırın. Azot kavitasyon yüksek basınç altında hücre sitoplazma içinde çözünmüş azot kullanır. Öyle ki onların coşku bir sonucu olarak hücre açık gözyaşı sitoplazmada azot kabarcıklar oluşur denge sonra hücre süspansiyon aniden atmosferik basınca maruz kalmaktadır. Basınç yeterince yüksek ise azot neşesinden çekirdeği3 bozabilir ve membran organelleri gibi organellerin4bağlı. Ancak, eğer basınç yeterince düşük tutulur, dekompresyon plazma zarı ve ER ama değil diğer organelleri böylece sitozol ve bozulmamış sitoplazmik organelleri cavitate5atanır homogenate dökülüp, bölebilir. Bu nedenle, azot kavitasyon organelleri gibi organellerin ve mitokondri izole için tercih yöntemdir.

Ancak, membran ve çözünür kesirler kolayca ayrılabilen bir homogenate hazırlama mükemmel bir şekilde de öyle. Bir tank ve bir çıkış bağlantı noktası bir Ayarlanabilir deşarj Vana ile azot gazı teslimi için bir giriş ile yüksek basınç dayanıklı kalın paslanmaz çelik kasa, kavitasyon sırasında kullanılan (bundan böyle "bomba" olarak da adlandırılır) basınç gemi oluşur.

Azot kavitasyon hücre homojenizasyon 1960'larda6beri kullanılmaktadır. 1961 yılında, avcı ve Commerfold7 memeli doku bozulması için uygun bir seçenek olarak azot kavitasyon kurdu. O zamandan beri araştırmacılar çeşitli hücre ve dokulara başarı ile tekniği adapte olması ve azot kavitasyon membran hazırlık8,9, çekirdek ve organel dahil olmak üzere birden çok uygulama bir elyaf haline gelmiştir Hazırlık10,11ve değişken biyokimyasal çıkarma. Şu anda, hücre biyologları daha sık hücre homojenizasyon diğer yöntemleri azot homojenizasyon faydaları değil yaygın olarak reklamı, azot bomba pahalıdır ve hücre nispeten büyük bir sayıdır bir yanlış anlaşılma olduğunu çünkü istihdam Gerekli. Boş hücre homogenates olduğu gibi çekirdek ile elde etmek azot kavitasyon protokollerde yayınlanmadı ve en Yayınlanan değerlendirme hücre süspansiyon, 20 mL hacimli kullanılmıştır. Küçük ölçekli örnekler ile çalışma geçerli uygun için klasik bu tekniği adapte, azot kavitasyon kültürlü hücreler için özel olarak tasarlanmış değiştirilmiş bir protokol mevcut. Azot kavitasyon sonra homogenate çözünür (S) ve membran (P) kesirler fark Santrifüjü tarafından ilk çekirdeği ve kesilen hücreleri kaldırmak için bir düşük hızlı spin ile ve sonra bir yüksek hızlı spin ile ayrılır (> 100.000 x g) ayırmak için membranlar çözünür kesir üzerinden. Biz immunoblots ile ayırma verimliliğini analiz ve azot kavitasyon diğer mekanik bozulma teknikleri ile karşılaştırın. Azot kavitasyon sırasında Ayrıca homojenizasyon arabellek ozmotik etkisini araştırmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. tampon ve ekipman ürünleri

  1. 4'te 45 mL hücre bozulma bomba, 15 mL tüpler ve ultrasantrifüj tüpler Chill ° C.
  2. Hazırla ve chill başına 2 x 10 7 hücreleri 4 ° C. Ekle bir proteaz inhibitörü tablet kullanmadan önce homojenizasyon arabellek 25 mL.
    Not: Hücre içi tuz kompozisyon NaCl daha iyi yansıtmak yerine homojenizasyon arabellekleri genellikle KCl içerir. Bu protokol için kullanılan homojenizasyon arabellek 10 mM HEPES pH 7.4, 10 mM KCl ve 1.5 mM MgCl 2 (aşağıda Hipotonik homojenizasyon arabellek anılacaktır) oluşur. Çoğu arabellekleri azot kavitasyon için adapte edilebilir (konuya bakın).
  3. Hazırla ve 6 mL 1 x 4 ° C. Ekle proteaz inhibitörü tablet kullanmadan önce yeni, örnek başına Phosphate-Buffered serum fizyolojik (PBS) arabellek chill.
    Not: Bu protokol için kullanılan PBS arabellek 10 mM Na 2 HPO 4 pH 7.4, 1.8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl ve 2.7 mM KCl oluşur.
  4. Hazırla ve chill solubilization arabellek 4 ° C. Ekle bir proteaz inhibitörü tablet kullanmadan önce örnek başına 4 mL.
    Not: Bu protokol için kullanılan Solubilization arabellek 25 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, % 0,1 SDS, % 0.5 sodyum deoxycholate ve % 1'oluşur 1 x Radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek olduğunu NP-40. 4.6 Not bkz.

2. Hücre hasat

  1. Grow 2 x 10 7 -10 x 10 9 doku kültürü hücreleri ile önerilen kültür medya hücre türü için. Genellikle, bir 15 cm çanak 2 x 10 7 DMEM içinde % 90 confluency ( şekil 1) kültürlü HEK-293 hücreleri verimleri.
  2. Vakum tarafından büyüme orta kaldırmak.
  3. Yapışık hücreleri için kültür yemekleri Buza koyun, kültür yemekleri yavaşça soğutulmuş homojenizasyon arabellek iki kez (15 cm çanak yıkama başına başına 10 mL arabellek) ile doğrudan hücrelerdeyse yıkama ve uygun bir hacmine büyük hücreli sıyırıcı ile hücre hasat homojenizasyon arabellek; Süspansiyon hücreleri, toplar ve hücre Pelet soğutulmuş homojenizasyon arabellek iki kez (50 mL kültür yıkama başına başına 10 mL arabellek) 500 x g spin 5 min için 4 ° C'de ile yıkayın ve yıkanmış hücre Pelet homojenizasyon arabellek buz üzerinde uygun bir hacmine resuspend.
    Not: birim hücre bozulma bomba içinde izin verilen en az/en büyük birim yanı sıra hedeflenen deneyler protein konsantrasyonu için gereksinimleri temel almalıdır. Genel bir kılavuz 2-10 x 10 7 hücre/mL, ya da yaklaşık 10 birim hücrenin cips. Bu iletişim kuralı homojenizasyon arabelleğinin 2 mL HEK-293 hücrelerinin üç 15 cm yemekler için optimize edilmiştir.

3. Azot kavitasyon

  1. bir heyecan transferinde hücre süspansiyon bir buz banyosu temiz ve soğutulmuş bomba için plaka.
    Dikkat: Bomba vardır yüksek basınç, düşük sıcaklık, azot gazı – uygun kişisel korumak .
  2. Bir mikro manyetik heyecan bar içinde bomba yerleştirin ve süspansiyon homojenliği korumak için heyecan plaka açın.
  3. Bir proteaz inhibitörü tablet için süspansiyon ekleyin ve üretici başına bomba yakın ' s eğitimi.
  4. Yavaş yavaş bomba bir azot gaz tank üreticisi başı ile sıkmak ' s öğretim bomba basınç göstergesi kadar 300-600 PSI okur. Bütün vanaları kapatın ve azot tankı çıkarın.
    Not: gerekli basınç ile hücre türü değişebilir. Burada HEK-293, NIH 3T3 ve Jurkat hücreler için 350-400 psi, kavitasyon gerçekleştirilen.
  5. Azot dağıtılması ve denge hücrelerindeki ulaşmak izin vermek 20 dk bekleyin.
  6. Bir bez havlu kullanarak boşaltma vanası çevresinde aşırı su kaldırın. Yavaşça homogenate dropwise bir sürümü elde etmek ve bir önceden soğutulmuş 15 mL tüp içinde toplamak için deşarj Vanayı aç.
    Not: koleksiyon sonuna yakın orada-ecek var olmak homogenate bir hamle ve gaz tıslayan ses ile ortaya çıkacak. Gaz değil emin olun daha önce toplanan neden cavitate tüp dışında ateş (1,5 mL tüpler yerine 15 mL kullanımı bu nedenle tüpler). Olağanüstü çaba başladı mı, deşarj vanayı kapat ve aniden bombayı basıncını ve kavitasyon bomba kalan hücreleri elde etmek için azot giriş Vanayı aç. Açık bombayı cavitate kurtarma ve derinlemesine temizlik.
    Not: Son cavitate üstüne köpük ile sütlü bir görünüm olması gerekir. Santrifüjü önce çökmek köpük izin vermek için bir pipet ucu ile hafifçe karıştırın.
    Not: cavitate faz kontrast mikroskobu tarafından homojenizasyon etkinliğini belirlemek için inceleyin. Bir 15 µL damla eklemek bir mikroskobu slayt ve bir coverslip ile kapak yüzeyine cavitate. 3.4-3.6 Eğer sadece çok fazla kırılmamış hücreleri bir 20 X amacı ile algılanır adımı yineleyin.
    Not: homojenizasyon arabellek EDTA veya EGTA içermiyorsa, eklemek için toplanan bu 1 mM 5 dk içinde son bir konsantrasyon deşarj sonra cavitate.

4. Cytosolic ve membran kesirler ayrılması

  1. santrifüj cavitate 500 x g 4 ° C'de kırılmamış hücreleri ve hücre çekirdeği kaldırmak için 10 dk için.
    Not: hiçbir görünür Pelet üretilen kadar aralıklarla tekrarlayın ve üstte yüzer köpük kaçınırken Post nükleer süpernatant (PNS) toplamak. Daha fazla toplamak ve PNS, birleştirmek için köpük gerekirse yeniden santrifüj kapasitesi ( şekil 1).
  2. PNS kesirler ilgi elde etmek için istediğiniz gibi işlemek. Sitozolik ayıran ve membran kesirler, amacıyla bir ultracentrifuge tüp PNS aktarmak ve ultrasantrifüj istediğiniz gibi gerçekleştirin. Bu iletişim kuralı için optimize edilmiş bir < 3,5 mL örnek bir polikarbonat ultracentrifuge tüp ve ultrasantrifüj 350.000 x g 4 1 h için de için ° C.
  3. 1 mL pipet kullanarak süpernatant (S kesir) toplamak.
  4. Dikkatli bir şekilde rahatsız etmeden Pelet 3 mL soğuk PBS ile yıkayın. PBS tarafından vakum kaldırmak.
    Not: 3 ml soğuk PBS ve re-ultracentrifuge olduğu gibi adım 4.2 Pelet membran kısmı tarafından sitozolik protein kontaminasyonu örnek kaybı daha büyük bir endişe ise, resuspend. PBS tarafından vakum kaldırmak.
  5. Pelet tam olarak uygun birimlere deterjan içeren solubilization arabellek tercih resuspend. Hücre denklik elde etmek için aynı birimin solubilization arabelleği sitozolik kesir olarak kullanın.
    Not: 1 x RIPA tampon solubilization tampon olarak verimli membran protein çıkarma için kullanmanızı öneririz. Aşağı akım yok tahlil membran kesir için gerekliyse, maksimal membran protein ayıklama için 1 x laemmli örnek arabellek kullanın.
    Not: Biz kekii ve 4 ° C maksimal membran protein çıkarılması için bir tüp rotator temiz bir tüp içinde solubilization tampon Pelet aktarılması öneririz.
    Not: Pelet (th verimli kaldırılacak çok yapışkan çok fazla lipidler) isee ultracentrifuge tüp solubilization arabelleği ek öneririz Pelet sıvı azot içinde dondurma ve ultracentrifuge tüp pelet pelet Tammy'nin önce bir mini metal spatula ile hızlı bir şekilde kekii.
    Not: Alternatif olarak, membran granül olabilir sadece resuspended ve çözündürüldükten membran vezikül süspansiyon Santrifüjü adım içinde 4,6 durumda gerekli değildir, bir P kısmını üretmek için bir deterjan içeren arabellekte değil. Böyle P kesirler membran Derneği üzerinde bağımlı enzim aktiviteleri gibi fonksiyonlar soruşturma sırasında yararlıdır.
  6. Tamamen çözündürüldükten Pelet süspansiyon adım 4.5 20.000 x g masa üstü bir santrifüj 10 dk içinde de 4'te santrifüj kapasitesi ° C. 1 mL pipet (P kesir) kullanarak süpernatant toplamak ve Pelet (çözünmez lipidler) atın.
  7. Gerçekleştirmek istenen deneyleri Batı sitozolik ve/veya membran kesirler ile kurutma gibi veya ileride kullanmak üzere-80 ° C'de kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 2 hücresel PNS çözünür sitozolik kesir (S) veya membran Pelet kesir (P) proteinler bölümleme gösterir. Biz farklı hücre türleri üç temsilcisi hücre satırlarından muayene: HEK-293 (epitel), NIH-3T3 (fibroblast) ve Jurkat (lenfosit). Rho guanin ayrılma inhibitörü (RhoGDI) ve katyon bağımsız mannoz-6-fosfat reseptör (CIMPR) için pozitif kontrol olarak kullanılan sitozolik ve membran kesirler, anılan sıraya göre. Azot kavitasyon sonra sitozol ve membran ayı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Manifold gibi diğer yöntemler üzerinde azot kavitasyon mekanik bozulma avantajları vardır. Belki de en önemli yararı yavaşça henüz verimli bir şekilde numuneler homojenize yeteneğidir. Dekompresyon cools örnekleri oluşturma Yerel Isıtma hasar yerine fiziksel prensipleri Ultrasonik gibi ve sürtünme/kesme teknikleri dayalı. Kavitasyon Ayrıca son derece plazma zarı bozan etkilidir. Azot kabarcıklar dekompresyon, kavitasyon işleminin üzerine tek tek her hücre içinde oluşturulan sınırlı olduğundan hücre boyutuyla daha az boyu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser, GM055279, CA116034 ve CA163489 tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre Bozulma Kabı (45 mL)Parr Aleti4639Azot kavitasyon Bombası
Dounce homojenizatör (2 mL)Kontes885300-0002Dounce havaneli ve tüp
U-100 İnsülin Şırıngası 28G½Becton Dickinson329461İğne
Atg12 antikoruSanta Cruz271688Fare antikoru, 1:1000 seyreltme&
beta;-aktin antikoruSanta Cruz47778'deFare antikoru, 1:1000 seyreltme&
beta;-tubulin antikoruDSHBE7-sFare antikoru, 1:5000 seyreltmede kullanım
Calnexin antikoruSanta Cruz23954Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
Calregulin antikoruSanta Cruz373863Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
Katalaz antikoruSanta Cruz271803Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
CIMPR antikoruAbcam124767Tavşan antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
EEA1 antikoruSanta Cruz137130Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede
kullanım EGFR antikoruSanta Cruz373746Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
F0-ATPaz antikoruSanta Cruz514419Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
F1-ATPase antikoruSanta Cruz55597Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
Fibrillarin antikoruSanta Cruz374022Fare antikoru, 1:200 seyreltmede kullanım
Golgin 97 antikoruSanta Cruz59820Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
HDAC1 antikoruSanta Cruz81598Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
Hekzokinaz 1 antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi2024STavşan antikoru, 1:1000 seyreltmede
kullanım Lamin A/C antikoruSanta Cruz376248Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
LAMP1 antikoruDSHBH4A3-cFare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
Na+/K+ ATPase antikoruSanta Cruz48345Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
Rab7 antikoruAbcam137029Tavşan antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
Rab9 antikorThermoMA3-067Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
RCAS1 antikoruSanta Cruz398052Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
RhoGDI antikoruSanta Cruz360Tavşan antikoru, 1:3000 seyreltmede kullanım
Ribozomal protein S6 antikoruSanta Cruz74459Fare antikoru, 1:1000 seyreltme
Sec61a antikorundaSanta Cruz12322Keçi antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım
Kalın duvar Polikarbonat ultrasantrifüj tüpüBeckman Coulter349622Ultrasantrifüjleme için numune tüpü
TLK-100.3 rotorBeckman Coulter349481ultrasantrifüjleme için rotor
Optima MAX Yüksek Kapasiteli Kişisel UltrasantrifüjBeckman Coulter364300ultrasantrifüj
cOmplete proteaz inhibitörü kokteyl tabletleriRoche11697498001proteaz inhibitörleri
25cm Saplı ve 3.0cm Bıçaklı Hücre SıyırıcılarCorning353089büyük hücreli sıyırıcı
Manyetik Karıştırma Çubuğu FisherScientific14-513-57SIXmikro karıştırma çubuğu
Seramik Üstü Manyetik KarıştırıcıFisher ScientificS504501ASmanyetik karıştırıcı
kullanım kullanın

Kaynaklar

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
  3. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
  4. Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
  5. Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
  6. Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
  7. Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
  8. Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
  9. Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
  10. Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
  11. Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
  12. Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
  13. Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
  14. Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
  15. Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
  16. Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
  17. Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
  18. Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hücresel FraksiyonlamaUltrasantrifügasyonSitozolik FraksiyonMembran FraksiyonuProtein BölümlenmesiHücre HomojenizasyonuWestern Blot Analizi
Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.