Yöntem makalesi

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

DOI:

10.3791/56039

⸱

12 Eylül 2017

 ,  ,  ,  , 
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vivo klonal analizi ve kader eşleme, aortik explants ve izole düz kas hücreleri ayrıntılı burada kullanarak embriyonik ve perinatal fare aort eğitim için kullanılan protokol. Bu farklı yaklaşımlar normal gelişim embriyonik ve perinatal aort ve hastalık patogenezinde morfogenez incelenmesi kolaylaştırmak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aort vücuttaki en büyük arter olduğunu. Aort duvar endotel hücrelerinin bir iç tabaka, elastik lamellae ve düz kas hücreleri (SMCs) alternatif bir orta katman ve fibroblastlar ve hücre dışı matriks ki dış tabakası oluşur. Patolojik modellerinde (Örneğin, ateroskleroz) Yetişkin aort yaygın bir çalışma aksine, embriyonik ve perinatal aort hakkında daha az bilinir. Burada, SMCs üzerinde ele ve embriyonik ve perinatal aort SMCs normal gelişim ve hastalığın patogenezi ve morfogenetik analizi için iletişim kuralları sağlar. Özellikle, dahil dört protokolü şunlardır: Ben) vivo embriyonik kader haritalama ve klonal analizi; II) embriyonik aort kültür explant; III) perinatal aort SMC izolasyon; ve IV) hamile (veya gebe olmayan) farelerde subkutan ozmotik Mini pompa yerleştirme. Böylece, bu yaklaşımlar origin(s), kader ve klonal SMCs mimarisinde aort içinde vivoincelenmesi kolaylaştırmak. Onlar sürekli maruz farmakolojik embriyonik aort morfogenez rahim içinde oransal için sağlar. Buna ek olarak, izole aort dokusu explants veya aort SMCs muscularization, nükleer silahların yayılmasına karşı ve göç gibi temel süreçler sırasında belirli bir gen hedefleri rolüne anlayışlar kazanmak için kullanılabilir. Bu hipotez oluşturma deneyler izole SMCs ve explanted aort sonra vivo içinde bağlamında farmakolojik ve genetik yaklaşımlar ile tespit edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelere besin ve oksijen sağlamak için çok hücreli organizmalar işlevinin dolaşım sistemi bu değil dış çevre ile temas ve atık ürünlerin ve karbon dioksit bu hücrelerdeki kaldırmak için vardır. Omurgalılar, birincil dolaşım sistemi hangi pompalar kan damarlarının bir dizi sayesinde kan kalp oluşur. Atar ve toplar damarlardaki, gibi büyük kan damarlarının duvarlarında üç katmandan oluşur: Ben) intima veya iç tabaka endotel hücre; II) medya veya Orta tabaka, çepeçevre alternatif düz kas hücreleri SMCs ve elastik lamellae uzamış; ve III) adventitia veya bağ dokusu ve fibroblastlar dış tabakası. Vasküler Biyoloji çalışmalarda büyük çoğunluğu yeni endotel hücre kaplı borular aracılığıyla angiogenez oluşumu soruşturma endotel hücreleri üzerinde odaklanın. Buna karşılık, nispeten az ilgi SMCs alırsınız. Ancak, SMCs normal Arteryel duvar inşası ve vasküler patolojiler kritik hücre tipi vardır.

Aort vücuttaki kalp sol ventrikül kardiyak çıkış alma en büyük kalibreli arter olduğunu. Ateroskleroz, anevrizma ve diseksiyona dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıkları dertli. Yetişkin canlılar arasında aorta ve büyük dalları yoğun damar hastalığı modellerinde incelenmektedir. Örneğin, düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör veya apolipoprotein E, kodlama gen için boş olan fareler beslenen yüksek yağlı diyet geliştirmek ateroskleroz ve kader eşleme çalışmalar gösterir önceden varolan SMCs birden fazla hücre türü için neden olmaktadır aterosklerotik plak1. Aort Anevrizmalarının patolojik değişiklikler SMC Apoptozis ve hücre dışı matriks2,3remodeling içerir.

Önemli ölçüde daha az embriyonik ve perinatal dönemlerinde SMC morfogenez ve patogenezi ile ilgili olarak bilinir. Burada, embriyonik ve perinatal aort SMCs vivo içindedoku explants ve izole hücreler eğitimi için protokolleri sağlamak. Örneğin, protokol ilk bölümünü kader haritalama ve embriyonik farelerde klonal analiz delineates. Cre recombinase bir hücre özgü organizatörü kontrolü altında ifade belirli hücreleri işaretleme ve onların döl4,5,6kolaylaştırır; Ancak, farelerde embriyonik gelişim sırasında cep özel etiketleme zamansal kontrol zor olabilir. Bu bağlamda, bir organizatörü SMCs (e.g.,Myh11 veya Acta2) ve Cre muhabir etkin altında koşullu CreER ifade embriyo ile biz tamoxifen veya onun aktif metaboliti 4-OH-tamoxifen hamile barajlar içinde enjekte için yöntemleri sağlar ve embriyo veya postnatal çoluk çocuk etiketli hücreleri analiz etmek için. Ayrıca, hangi çoğunlukla Cre gazetecilere bir tek gazeteci fluorophore1,7ile kullanmak, kader Haritalama çalışmaları aksine, klonal analiz önemli ölçüde çok renkli Cre gazetecilere ile zenginleştirilmiştir.

İletişim kuralı ikinci ve üçüncü bölümlerde izole edip embriyonik aort explants ve gelen ventilasyon, aortik SMCs sırasıyla kültür yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yaklaşımlar sinyal yollar, özellikle aort explants veya SMCs, manipülasyon ve farmakolojik ajanların doğrudan etkileri analiz etmek için izin verir. Böylece, faiz dokusunun belirli genlerin rol farelerde geleneksel genetik manipülasyon yoluyla çok daha hızlı bir biçimde tarandı. Buna ek olarak, izole SMC çalışmalar hücre göç çözümlemesini kolaylaştıran ve teknik olarak yapışma içinde vivosınırlı.

Son olarak, dördüncü protokol bölümünde subkutan ozmotik Mini pompa hamile (veya gebe olmayan) farelerde farmakolojik ajanlar ile yüklenen yerleşimini delineates. Bu yöntem embriyonik gelişme hızlı metabolizma nedeniyle sürekli infüzyon gerektiren ajanlar nedeniyle üzerindeki etkisinin analizi kolaylaştırır. Sık iğne alternatif birçok ajanlar için pratik değildir ve o hamile baraj önemli rahatsızlık neden olabilir, kaçınılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

tüm fare protokolleri kurumsal hayvan bakım ve Yale Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanan.

1. In Vivo kader embriyonik eşleme ve klonal analizi

Not: Biz bu yaklaşımlar yaygın olarak hücreleri ve geliştirme ve hastalık modelleri klonal mimarileri kökenleri değerlendirmek için kullandık 7 , 8 , 9 , 10.

  1. ayarla bir CreER ile fareler ve fareler Cre muhabir ile arasında çiftleşme.
    Not: Bir CreER işaretleme SMC için kullanılır; Myh11-CreERT2-Acta2-CreERT2 fareler 11 , 12 yaygın olarak bu amaç için kullanılır. ROSA26R-CreERT2 fareler 13 geniş embriyonik doku işaretlemek için kullandık.
    1. Klonal analizi, bir çok renkli Cre muhabir (Örneğin, konfeti veya Rainbow [Rb] fareler) 8 , 14 , 15 kullanın ve kader eşleme için bir tek renkli Cre muhabir (Örneğin, ROSA26R-YFP fareler 16) veya çift renkli Cre muhabir ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
      Not: Bu üreme düzeni 2-6 ay yaşlı (genellikle ~ 30 g) ve bir CreER ve Cre muhabir ile embriyo üretecektir yetişkin fareler kullanır.
  2. Kontrol için sabahları bir metal kullanarak vajinal prizler yoklama ve fiş algılama embriyonik gün (E) 0.5 olarak gün öğlen vakti düşünün.
  3. Bir fiş algılandığında erkek erkeğe ait ayırın.
  4. Hazırla 4-OH-Tamoksifen ve Tamoksifen çalışma çözümleri.
    1. 5 mg 50 µL % 100 etanol, 2 dk için girdap içine 4-OH-tamoxifen için dağıtılması ve sonra mısır yağı 450 µL ekleyin. Buz üzerinde örnek soğuduktan kadar döngüleri arasında dinlenme ile 10 s döngüleri için 2 çıktı düzeyinde solüsyon içeren temizleyicide. Örnek tamamen çözülmüş sonra (genellikle ~ sonication döngüleri 4-5), sonicated çözüm 200 µL almak ve mısır yağı final çalışma çözüm (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL) yapmak için 1.800 µL içinde erimesi.
    2. Kadar bu çözülür tamoxifen için 50 mg/ml % 100 etanol ve girdap oranında seyreltin. Mısır yağı final çalışma çözüm (tamoxifen, 10 mg/mL) yapmak ve 45 ° C tamamen çözülmüş emin olmak için heyecan içinde seyreltik.
  5. Erken embriyonik indüksiyon için 4-OH-Tamoksifen intraperitoneally hamile bir baraj enjekte.
    1. 4-OH-tamoxifen enjeksiyonları (~ 150 µg hamile fare veya kabaca 5 mg/kg vücut ağırlığı başına) kullanmak E5.5 ve bundan sonra onlar uygun Barajı, embriyo ve pups verim.
    2. Kullanım tamoxifen dozda 0,5 - 1,5 mg (veya 17-50 mg/kg) için barajlar embriyo ile hamile ~ E9 ve bundan sonra. Tüm enjeksiyonlar için 30 G iğne kullanın.
      Not: 0,22 µm filtre aracılığıyla filtreleme genellikle enjeksiyon öncesinde tüm karışımları sterilize etmek için kullanılır.
  6. 4-OH-tamoxifen (örneğin, 5 mg/kg) veya tamoxifen (örneğin, 50 mg/kg) birden çok hücre işaretlemek için yüksek dozda mayi enjeksiyonlari klonal analizi için kullanın.
      Tek tek hücreler mark, faiz (Yani, aorta) doku içinde hemen hemen tüm embriyoların (aşağıda bu bölümün sonunda açıklandığı gibi) analiz hiçbir etiketli hücreleri veya yalnızca hücreleri sahip olduğunu 4-OH-tamoxifen veya tamoxifen doz titre için
    1. tek bir rengi; Bu eşik doz ise.
  7. Orta-geç gebelik döneminde hücreleri işaretlemek ve onların kaderi ya da doğum sonrası Mouse, clonality izlemek için progesteron hamile Barajı mayi boşluğuna kullanılazlar ile tamoxifen bir 1:2 (progesteron: tamoxifen) enjekte doz oranı.
    Not: Tamoxifen dozlarda 17-50 mg/kg ve progesteron dozlarda 8.5-25 mg/kg (Yani, Tamoksifen dozlarda yarısı). Progesteron enjeksiyon emek ~ 1-2 gün gecikme olabilir.
  8. Euthanize Baraj Baraj pamuk veya gazlı bez içeren bir receptacle yerleştirildiği bir açık bırak yöntemini kullanarak istenen bir yaş embriyo ile hamile ile su katılmamış isoflurane batırılmış. Pnömotoraks ikna etmek için göğüs boşluğu açarak, hayati organları kaldırarak, ve/veya servikal çıkığı yaparak ölüm onaylayın.
  9. Karın % 70 etanol ile temiz. Makas karın kesip açmak ve rahim incelemek için kullanın. Embriyoların rahim kaldır ve dikkatle embriyo plasenta ve sarısı sac forseps kullanarak ayrı.
  10. Servikal yerinden çıkması veya Cerrahi makas ile işten çıkarma veya keskin bir bıçak gerçekleştirerek embriyo E15 veya büyük ötenazi.
    Not: Ötenazi anne ve/veya anneden embriyo kaldırılmasını takiben embriyo E15 genç hızla öldü.
  11. Buz gibi PBS embriyo yerleştirin ve kuyruk CreER ve Cre muhabiri genotip için makas kullanarak küçük bir parça kesti.
  12. Embriyo üç kez PBS 2 h. yıkama için 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde embriyo düzeltmek ve PBS içinde % 30 Sükroz 15 mL tüpler hangi-ebilmek almak ilâ iki gün onlar kadar beklemeniz, embriyo kuluçkaya.
    13. Buz gibi
  13. dolgu plastik 2/3 maksimum seviyede en iyi kesim ısı (OCT) bileşik kalıplar. Her embriyo Ekim Incubate kabarcıklar en aza indirmek için (RT) oda sıcaklığında 10 dakika tamamen sular altında kalıp, dikey olarak yerleştirin.
  14. Doku bloklar bir kuru buzun içinde donmak % 70 etanol banyo dik dondurma yer. -80 sokak depolamak ° C.
  15. -22 ° C-cryostat sıcaklığı ayarlamak ve blok aracılığıyla tüm aort, 10-20 µm kalınlığında transvers bölümler oluşturmak için kesti. RT, slaytlar 30 dk önce bunları-80 saklamak için Kuru ° C.
  16. RT, fluorophores ağartma önlemek için ışıktan korunan, slaytlar çözülme. PBS-Tween20 ile slaytlar % 0,1 yıkayın.
    1. İçin klonal analizi, çekirdeği (DAPI, 5 mg/mL) slaytlarını leke ve doğrudan diğer fluorophores gökkuşağı Cre muhabir olarak görüntü (gök mavisi: 433-nm uyarma max, 475-nm emisyon max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
      1. Fluorophores ile dik bir floresan mikroskop saptamak için aşağıdaki filtreleri kullanın: DAPI (uyarma max/bant genişliği 350/50 nm, emisyon max/bant genişliği 460/50 nm), Cerulean (uyarma 436/20 nm, emisyon 480/40 nm), Teksas kırmızı (uyarma 560 / 40 nm, emisyon 630/75 nm) ve mCherry (uyarma 577/10 nm, emisyon 630/50 nm) mOrange ayırmak için özel filtre.
    2. MTmG Cre reporter ile kader eşleme için GFP tespit (484 nm, 510 nm), doğrudan görüntüleme veya immunostaining kullanarak. GFP filtre (uyarma 470/40 nm, emisyon 525/50 nm) dik bir floresan mikroskobu ile görüntülemede kullanılmak.
    3. İmmunostaining için birincil antikorlar gecede 4 ° C'de bölümlerle kuluçkaya, PBS Triton X-100 %0,1 ile yıkayın ve 1 h. kullanım anti-CD31 için ikincil antikorlar ile kuluçkaya (son konsantrasyon 0.0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) ve Cy3-doğrudan konjuge anti-SMA (1:500 son seyreltme) birincil antikorlar ve kullanım ikincil antibodie(bkz: Malzemeler tablo) fluorophores (1:500 son seyreltme) doğrudan Birleşik s.
  17. Görüntü slaytlar ile dik bir floresan mikroskobu (büyütme: 4 X - 20 X) veya confocal mikroskop (10 X-63 X). Yüksek büyütme için bir confocal görüntüleme 63 petrol amaç x 1.4-0,6 sayısal bir diyafram ve bir çerçeve boyutu 1024 x 1024 piksel kullanın.

2. Embriyonik aort kültür explant

Not: Bu yaklaşım daha önce explanted, stenoz integrin beta3 rolü değerlendirmek için kullanılan Eln (- / -) embriyonik aort 9 , 18.

  1. E15.5 zaman aşımına uğradı-hamile bir barajın başı olarak adım 1.8, aşırı isoflurane Solunduğunda yukarıda ötenazi.
  2. Hasat ve yukarıdaki adımları 1.9-1.10, göre embriyo ötenazi.
  3. Embriyo supinely konumlandırın ve genişletilmiş bacaklarda diseksiyon kurulu pin. Diseksiyon stereoscope ile görselleştirin ve karın ile göğüs kemiği üzerinden bir dikey kesi üst Toraks için kesmek için makas kullanın. Uzak teşrih timus, nefes borusu, akciğerler, yemek borusu, karaciğer ve bağırsak.
  4. Yavaşça ventrally forseps kullanarak kalp çekin ve aort damarı torasik ve abdominal boşluklar dorsal yönünü uzak incelemek için makas kullanın. Aort serbest bırakmak için proksimal kök ve distal karın pozisyonlar kesmek.
  5. Buz gibi steril PBS bir hücre kültür başlıklı aort yerleştirin. Aort 24-şey plakasına aktarmak ve %0,5 ile DMEM içinde kültür FBS için en fazla 24 saat 37 ° c
    Not: Kültür orta bir engelleme antikor (Örneğin, anti-integrin αvβ3 antikor 0,02 mg/mL 9; bkz: Malzemeler tablo) veya farmakolojik ajan ile takıma girebilir.
  6. İki kez PBS ile aort yıkama ve sonra 20 dakika süreyle %4 paraformaldehyde ile tamir
    7. PBS içinde
  7. yıkama üç kez ile PBS ve transfer 1.5 mL tüp % 30 ile aort Sükroz. Aort lavabo sonra donmuş doku blokları, kesim bölümler ve immunostain, adımları 1,13-1.15, yukarıda açıklandığı gibi olun.

3. Perinatal aort SMC izolasyon

Not: Bu yaklaşım aort SMCs Eln (- / -) ve wildtype perinatal fareler izole Biyoloji karşılaştırmak için kullanılmakta olan.

  1. Bir fare kuçu kuçu postnatal gününde (P) 0.5, servikal yerinden çıkması veya Cerrahi makas ile işten çıkarma veya adım 1.10, açıklandığı gibi keskin bir bıçak yukarıda Euthanize.
  2. Adım 2.3 gerçekleştirmek ve daha sonra göğüs ve karında açtıktan sonra sol ventrikül ile 23 G iğne ponksiyon. PBS yerçekimi tarafından sol ventrikül akması için PBS içeren steril enjektör iğne bağlanmak için plastik boru kullanım dikey olarak yükseltilmiş bir konumda düzenlenen. Karaciğer blanches dek steril PBS infüzyonu sol ventrikül içine izin veremeyiz.
    1. Aort dışındaki adventitial dokuyu ve aort 2.4 adımda anlatıldığı gibi incelemek için forseps kullanın.
  3. DMEM tek bir çözüm içinde aort sindirmek (500 µL) takıma 225 U/mL collagenase, 2.25 U/mL elastase ve 1 x antibiyotik-antimycotic 45 dk az 37 ° c el sallamak için tüp her 5-10 dakika
  4. Steril hücre kültür Hood, titurate yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon oluşturmak için 200-µL pipet ile pipetting tarafından sindirilmiş doku. Tek hücreli süspansiyon 15 mL tüp transfer DMEM 2 mL ekleyin ve santrifüj kapasitesi 920 x g 25 5 min için de ° C.
  5. Süpernatant atmak. Hücre Pelet SMC kültür ortamının (1 µg/mL rhFGF, 10 µg/mL rhEGF, 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 2,5 µg/mL Amfoterisin B ile FBS takıma % 10 içeren DMEM) 3 ml resuspend. Aktarım için 35-mm kültür plaka.
    Not: ilk yalıtım tek bir P0.5 wildtype aort ~ 400.000 hücre elde edilir; ~ 300.000 bu hücrelerin çoğu SMCs.
  6. 37 ° C'de hücreler kültür ve her 3 günde taze SMC kültür Orta olarak değiştirin. Tripsin ile standart yöntemlerle, hücreleri konfluent ne zaman geçiş. Deneyler için pasajlar 3-7 hücrelerden kullanın.

4. Subkutan ozmotik Mini pompa yerleştirme hamile (veya sigara hamile) fareler

Not: Bu yaklaşım daha önce sürekli farmakolojik ajan (Örneğin, integrin β3 ve β5 inhibitörü teslim etmek için kullanılan cilengitide) embriyo rahimde 9. Pompa E13.5 hamile barajın takılı ve doğum kadar saklanır.

  1. Anestezi ile oksijen (debisi 1 L/dak) indüksiyon ve bakım için 1-%3 2-%5 isoflurane fareler. Toe-çimdik refleks anestezi düzeyini izlemeniz için kullanın ve anestezik Ajan gerektiği gibi ayarlayın. Subkutan buprenorfin (0,05 - 0,1 mg/kg) analjezi için yönetmek.
  2. Alt sırt makasları ile tıraş. Steril örtüler, eldiven ve aletleri kullanmak ve ameliyat sırasında fareler Isıtma cerrahi tabakta korumak.
  3. Yer her fare yüzükoyun sígara ve arka izopropil alkol tarafından takip betadin ile fırçalayın. Yaklaşık 3-5 cm alt sırt, kuyruk tabanına rostral bir yatay cilt kesi 0.5 - 1.0 cm uzunluğunda temel kas ağır yaralı olmadan yapmak için bir neşter kullanın.
  4. Bir hemostat belgili tanımlık kesme takıp subkutan bir cep rostrally pompa implantasyon için açılış ve kapanış hemostat jaws oluşturabilirsiniz.
  5. Doldurmak bir ozmotik Mini pompa seçim, üretici göre Ajan ile ' s yönergeleri (bkz: Malzemeler tablo). Dolu pompa cep içine yerleştirin ve belgili tanımlık kesme klipleri veya 6-0 absorbe olmayan dikiş ile kapatın. Toplam cerrahi saat 10 dk. daha az olduğundan emin
    6. Sternal recumbency ele geçirdiler kadar
  6. post-operatively, fareler her 15dk izlemek. Subkutan buprenorfin (0,05 - 0,1 mg/kg) her 6-12 h 48 h için yönetmek. Fareler genel anestezi tamamen iyileşti, onları her gün izlemek. Küçük resimleri kaldırmak veya 7-10 gün ameliyat sonrası tasarlamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir temsilci klonal analizinde SMCs içinde embriyo mutant Eln (hücre dışı matriks proteini elastin kodlama gen) için Eln(+/-), Acta2-CreERT2 fareler de taşıyan Eln(+/-) fareler için şeklindeki çok renkli ROSA26R(Rb/Rb) muhabir. 1. adımda açıklandığı gibi bujileri kontrol edildi, hamile baraj E12.5 adlı bir tek tamoxifen enjeksiyon (1.5 mg) ile indüklenen ve onlar E18.5 kurban edildi. Embriyo hasat, sabit, dondurulmuş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare aort ve ateroskleroz, modelleri gibi yetişkin patolojik koşullarında büyük dalları geniş araştırmalar aksine daha az morfogenez ve embriyonik ve perinatal aort patogenezi ile ilgili olarak bilinir. Burada, biz embriyonik/perinatal aorta, özellikle SMCs, odak ve aort yoluyla vivo içindedoku explant, çalışmaya iletişim kuralları sağlar ve SMC yalıtım yaklaşımlar. Bu ücretsiz yaklaşımlar embriyonik/perinatal aort çalışmaya farklı yaklaşımlarla araştırmacı sağlar.

Klonal analiz bir t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dean Li aort SMC yalıtım için onun laboratuvarı protokol paylaştığınız için teşekkür ederiz. Destek finansman sağlanan ulusal sağlık Enstitüleri tarafından (R21NS088854, R01HL125815 ve R01HL133016 D.M.G için), Amerikan Kalp Derneği (Grant-in-Aid 14GRNT19990019) D.M.G. için ve Yale Üniversitesi (kahverengi-Coxe Bursu için sabah ve başlangıç fonlar için D.M.G.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
TamoksifenSigmaT5648
Mısır yağıSigmaC-8267Tamoksifen
4-OH-tamoksifeniçin araç SigmaH7904aktif metaboliti
Tamoksifen OCT bileşiği konsantrasyonunun yarısında kullanın
Sakura dokusu tek4583
CryomoldsPolysciences inc18986
DAPISigmaD9542Çekirdeğin IHC boyaması, son konsantrasyon 5 mg / mL
Cy3 doğrudan konjuge anti-SMA antikoruSigmaA2547SMA'nın IHC boyaması, son seyreltme 1:500
Anti-CD31 antikoruBD Pharmingen550274GFP'nin IHC boyaması, son konsantrasyon 0.006 mg / mL
Anti-GFP antikoruThermo Fisher ScientificA-11121CD31'in IHC boyaması, son konsantrasyon 0.0016 mg / mL
İkincil antikor keçi anti-tavşanı, Alexa 647Yaşam Teknolojileria21244IHC boyama, son konsantrasyon 0.004 mg / mL
İkincil antikor keçi anti-tavşanı, Alexa 488Yaşam Teknolojileria11008IHC boyama, son konsantrasyon 0.004 mg / mL
DMEMThermo Fisher Scientific10567-014Hücre kültürü için
FBSThermo Fisher Scientific10437028
Anti-integrin beta3 bloke edici antikorBD Biosciences553343Clone 2C9. G2, son konsantrasyon 0.02 mg / mL
KollajenazWorthington Biochemical Corp44H14977AAort
Elastazısindirmek için Worthington Biochemical Corp34K15139Aortu sindirmek için
Antibiyotik-antimikotik (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
Rekombinant insan FGFPromegaG5071
Rekombinant insan EGFPromegaG5021
Penisilin / streptomisin (10.000 U / mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Amfoterisin BThermo Fisher Bilimsel15290026
Doku kültürü plakalarıCorningCLS430165
Alzet ozmotik mini pompaDurect Corporation2001
ECLIPSE 80i Dik Floresan MikroskopNikon 
  TCS  SP5Leica
Branson Sonifier 450VWR
Myh11-CreERT2 farelerJackson Laboratuvarı 19079
Acta2-CreERT2 fareleriDr. Pierre Chambon ve Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 farelerininJackson Laboratuvarı 8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) farelerJackson Laboratuvarı  
ROSA26R(EYFP/EYFP) farelerJackson Laboratuvarı   006148 
ROSA26R(Konfeti/Konfeti) farelerJackson Laboratuvarı 13731
. Irv Weissman'ınROSA26R(Rb/Rb) fareDr. Irv Weissman'ın
Tamoksifen Progesteron Sigma P8783-5G'nin Kriyobloklar yapmak için laboratuvarından elde edildi 026862Dr Laboratuvarı laboratuvarından alındı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
  3. Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
  4. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
  5. Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
  6. Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
  7. Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
  8. Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
  9. Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
  10. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
  11. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
  12. Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
  13. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  15. Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810(2014).
  16. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4(2001).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  18. Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
  19. Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
  20. Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
  21. Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
  22. Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
  23. Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
  24. Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
  25. Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
  26. Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
  27. Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
  28. Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
  29. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  30. Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Embriyonik AortD z Kas H creleriIn Vivo Kader HaritalamaEksplant Aort K lt rD z Kas H cresi zolasyonuOzmotik Mini PompaKlonal AnalizDoku Kesit almaFloresan Mikroskopi

İlgili makaleler