Vivo klonal analizi ve kader eşleme, aortik explants ve izole düz kas hücreleri ayrıntılı burada kullanarak embriyonik ve perinatal fare aort eğitim için kullanılan protokol. Bu farklı yaklaşımlar normal gelişim embriyonik ve perinatal aort ve hastalık patogenezinde morfogenez incelenmesi kolaylaştırmak.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma
Bu makalede
Özet
Özet
Aort vücuttaki en büyük arter olduğunu. Aort duvar endotel hücrelerinin bir iç tabaka, elastik lamellae ve düz kas hücreleri (SMCs) alternatif bir orta katman ve fibroblastlar ve hücre dışı matriks ki dış tabakası oluşur. Patolojik modellerinde (Örneğin, ateroskleroz) Yetişkin aort yaygın bir çalışma aksine, embriyonik ve perinatal aort hakkında daha az bilinir. Burada, SMCs üzerinde ele ve embriyonik ve perinatal aort SMCs normal gelişim ve hastalığın patogenezi ve morfogenetik analizi için iletişim kuralları sağlar. Özellikle, dahil dört protokolü şunlardır: Ben) vivo embriyonik kader haritalama ve klonal analizi; II) embriyonik aort kültür explant; III) perinatal aort SMC izolasyon; ve IV) hamile (veya gebe olmayan) farelerde subkutan ozmotik Mini pompa yerleştirme. Böylece, bu yaklaşımlar origin(s), kader ve klonal SMCs mimarisinde aort içinde vivoincelenmesi kolaylaştırmak. Onlar sürekli maruz farmakolojik embriyonik aort morfogenez rahim içinde oransal için sağlar. Buna ek olarak, izole aort dokusu explants veya aort SMCs muscularization, nükleer silahların yayılmasına karşı ve göç gibi temel süreçler sırasında belirli bir gen hedefleri rolüne anlayışlar kazanmak için kullanılabilir. Bu hipotez oluşturma deneyler izole SMCs ve explanted aort sonra vivo içinde bağlamında farmakolojik ve genetik yaklaşımlar ile tespit edilebilir.
Giriş
Hücrelere besin ve oksijen sağlamak için çok hücreli organizmalar işlevinin dolaşım sistemi bu değil dış çevre ile temas ve atık ürünlerin ve karbon dioksit bu hücrelerdeki kaldırmak için vardır. Omurgalılar, birincil dolaşım sistemi hangi pompalar kan damarlarının bir dizi sayesinde kan kalp oluşur. Atar ve toplar damarlardaki, gibi büyük kan damarlarının duvarlarında üç katmandan oluşur: Ben) intima veya iç tabaka endotel hücre; II) medya veya Orta tabaka, çepeçevre alternatif düz kas hücreleri SMCs ve elastik lamellae uzamış; ve III) adventitia veya bağ dokusu ve fibroblastlar dış tabakası. Vasküler Biyoloji çalışmalarda büyük çoğunluğu yeni endotel hücre kaplı bor....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
tüm fare protokolleri kurumsal hayvan bakım ve Yale Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanan.
1. In Vivo kader embriyonik eşleme ve klonal analizi
Not: Biz bu yaklaşımlar yaygın olarak hücreleri ve geliştirme ve hastalık modelleri klonal mimarileri kökenleri değerlendirmek için kullandık 7 , 8 , 9 , 10.
- ayarla bir CreER ile fareler ve fareler Cre muhabir ile arasında çiftleşme.
Not: Bir CreER işaretleme SMC için kullanılır; Myh11-CreERT2-A....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bir temsilci klonal analizinde SMCs içinde embriyo mutant Eln (hücre dışı matriks proteini elastin kodlama gen) için Eln(+/-), Acta2-CreERT2 fareler de taşıyan Eln(+/-) fareler için şeklindeki çok renkli ROSA26R(Rb/Rb) muhabir. 1. adımda açıklandığı gibi bujileri kontrol edildi, hamile baraj E12.5 adlı bir tek tamoxifen enjeksiyon (1.5 mg) ile indüklenen ve onlar E18.5 kurban edildi. Embriyo hasat, sabit, dondurulmuş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Fare aort ve ateroskleroz, modelleri gibi yetişkin patolojik koşullarında büyük dalları geniş araştırmalar aksine daha az morfogenez ve embriyonik ve perinatal aort patogenezi ile ilgili olarak bilinir. Burada, biz embriyonik/perinatal aorta, özellikle SMCs, odak ve aort yoluyla vivo içindedoku explant, çalışmaya iletişim kuralları sağlar ve SMC yalıtım yaklaşımlar. Bu ücretsiz yaklaşımlar embriyonik/perinatal aort çalışmaya farklı yaklaşımlarla araştırmacı sağlar.
Klonal analiz bir t.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Dean Li aort SMC yalıtım için onun laboratuvarı protokol paylaştığınız için teşekkür ederiz. Destek finansman sağlanan ulusal sağlık Enstitüleri tarafından (R21NS088854, R01HL125815 ve R01HL133016 D.M.G için), Amerikan Kalp Derneği (Grant-in-Aid 14GRNT19990019) D.M.G. için ve Yale Üniversitesi (kahverengi-Coxe Bursu için sabah ve başlangıç fonlar için D.M.G.).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Tamoksifen | Sigma | T5648 | |
| Mısır yağı | Sigma | C-8267 | Tamoksifen |
| 4-OH-tamoksifen | için araç Sigma | H7904 | aktif metaboliti |
| Tamoksifen OCT bileşiği konsantrasyonunun yarısında kullanın | |||
| Sakura dokusu tek | 4583 | ||
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | Çekirdeğin IHC boyaması, son konsantrasyon 5 mg / mL |
| Cy3 doğrudan konjuge anti-SMA antikoru | Sigma | A2547 | SMA'nın IHC boyaması, son seyreltme 1:500 |
| Anti-CD31 antikoru | BD Pharmingen | 550274 | GFP'nin IHC boyaması, son konsantrasyon 0.006 mg / mL |
| Anti-GFP antikoru | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | CD31'in IHC boyaması, son konsantrasyon 0.0016 mg / mL |
| İkincil antikor keçi anti-tavşanı, Alexa 647 | Yaşam Teknolojileri | a21244 | IHC boyama, son konsantrasyon 0.004 mg / mL |
| İkincil antikor keçi anti-tavşanı, Alexa 488 | Yaşam Teknolojileri | a11008 | IHC boyama, son konsantrasyon 0.004 mg / mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | Hücre kültürü için |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 bloke edici antikor | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9. G2, son konsantrasyon 0.02 mg / mL |
| Kollajenaz | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | Aort |
| Elastazı | sindirmek için Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | Aortu sindirmek için |
| Antibiyotik-antimikotik (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Rekombinant insan FGF | Promega | G5071 | |
| Rekombinant insan EGF | Promega | G5021 | |
| Penisilin / streptomisin (10.000 U / mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amfoterisin B | Thermo Fisher Bilimsel | 15290026 | |
| Doku kültürü plakaları | Corning | CLS430165 | |
| Alzet ozmotik mini pompa | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Dik Floresan Mikroskop | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 fareler | Jackson Laboratuvarı | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 fareleri | Dr. Pierre Chambon ve Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 farelerinin | Jackson Laboratuvarı | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) fareler | Jackson Laboratuvarı | ||
| ROSA26R(EYFP/EYFP) fareler | Jackson Laboratuvarı | 006148 | |
| ROSA26R(Konfeti/Konfeti) fareler | Jackson Laboratuvarı | 13731 | |
| . Irv Weissman'ın | ROSA26R(Rb/Rb) fare | Dr. Irv Weissman'ın |
Kaynaklar
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smoo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
