Burada, siyanobakteriyel hücrelerdeki glikojen içeriğini ölçmek için güvenilir ve kolay bir test sunuyoruz. İşlem, çökeltme, seçilebilir depolimerizasyon ve glikoz artıklarının belirlenmesini gerektirir. Bu yöntem hem vahşi hem de genetik mühendisliği yapılmış suşlar için uygundur ve siyanobakterilerin metabolik mühendisliğini kolaylaştırabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Siyanobakteriler, fotosentez sırasında ana hücre içi karbon ve enerji depolaması olarak glikojen biriktirir. Araştırmalardaki son gelişmeler, biyosentezin ve katabolizma döngüsü, redoks düzenlemesi ve kodlamayan RNA'nın dahil edilmesi gibi kompleks mekanizmaları vurgulamıştır. Aynı zamanda, ürün verimi artırmak için, karbonu glikojenden genetik olarak tasarlanmış siyanobakterilerdeki istenen ürünlere yönlendirmek için çaba sarf edilmektedir. Değişken doğruluk ve teknik karmaşıklıkla, siyanobakterilerdeki glikojen içeriğini belirlemek için çeşitli yöntemler kullanılır. Burada, standart yaşam bilimi laboratuarında yapılabilen siyanobakterlerdeki glikojen içeriğini güvenilir şekilde belirlemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, hücre lisatından glikojenin seçici olarak çökeltilmesini ve bir glikoz öküzü tarafından saptanan glikoz monomerlerinin üretilmesi için glikojenin enzimatik depololimerizasyonunu gerektirirIdase-peroksidaz (GOD-POD) enzim bağlı testi. Yöntem, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002, metabolik mühendislikte yaygın olarak kullanılan iki model siyanobakteriyel tür. Üstelik, yöntem, düzenleyici elemanlarda veya glikojen biyosentetik genlerde bozuk olan vahşi tip ve mutantlar arasındaki glikojen içeriğinde başarılı bir şekilde farklılık sergiledi.
Giriş
Siyanobakteriler, fotosentez yoluyla ışığa sabitlenmiş CO 2'den gelen karbonun başlıca karbonhidrat deposu olarak glikojen biriktirir. Glikojen, α-1,6-bağlantılı glukosil bağlantıları ile yaratılan dalları olan doğrusal α-1,4-bağlı glukandan oluşan bir glıkan. Siyanobakterlerdeki glikojen biyosentezi, fosfoglukomütaz ve ADP-glikoz pirofosforilazın ardışık eylemi yoluyla glikoz-6-fosfatın ADP-glükoza dönüştürülmesiyle başlar. ADP-glikozdaki glukoz kısmı, bir veya daha fazla glikojen sentezleyicisi (GlgA) ile glikojen α-1,4-glukan omurgasının indirgeyici olmayan ucuna aktarılır. Daha sonra, dallanmış bir enzim, glikojen parçacığını üretmek için daha da g....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hazırlık
- Siyanobakteri kültürleri
- Synechocystis sp. PCC 6803,% 1 (v / v) CO 2 ile takviye edilmiş sabit bir hava kaynağı ile 30 ° C'de sıvı BG11 ortamı 8'de karıştırılır . Kültürleri 50 umol foton / m 2 / s'lik bir fotosentetik foton akı yoğunluğunda sürekli olarak ışıkla aydınlatın.
- Synechococcus sp. % 1 (v / v) CO 2 ile takviye edilmiş sabit bir hava kaynağı ile, sıvı A + ortam 23'te (BG11 ortam da kullanılabilir) PCC 7002'yi. Sıcaklık 37 ° C olmalıdır. Kültürleri 150 μmol foton / m 2 / s....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
10 mL vahşi tipli Synechocystis sp. PCC 6803 , OD 730nm değeri yaklaşık 0.8'e ulaşana kadar foto- ototrofik koşullar altında yetiştirildi. Hücreler hasat edilmiş ve 50 mM Tris-HC1, pH 8 içinde yeniden süspanse edilmiştir. OD 730 nm değeri 2-3'e ayarlanmıştır. Glikojen içeriği, yukarıda tarif edilen protokolü izleyerek analiz edildi. OD 730nm başına glikojen içeriği 13 ± 1.8 μg / mL / OD 730nm ( N .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokolün kritik adımları glikojen çökmesi ve yeniden süspansiyon. Etanol çökeltisini takiben santrifüjden sonra, glikojen, gevşek şekilde mikrosantrifüj tüplerinin duvarlarına yapışan yarı saydam bir pelet oluşturur. Bu nedenle, yüzer maddenin çıkarılması sırasında, pelletin çıkarılmaması için özel dikkat gösterilmelidir. Glikojen pelleti yapışkandır ve kuruyorsa çözündürme zor olabilir. Glikojen pelletinin tamamen çözündürülmesinin önem taşıdığına dikkat edin, çünkü eksik çözünürlük verimsiz enzimatik sindirime yol a.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar, Nordic Energy Research (AquaFEED, proje no. 24), Danimarka Yenilikçiliği (Pant Gücü, proje No: 12-131844) ve Villum Fonden (proje no: 13363)
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| QSonica Sonikatörler Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Mikroplaka Okuyucu ve nbsp; | Moleküler Cihazlar | NA | Eliza plaka okuyucu |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Boncuk çırpıcı |
| Ultrospec 3100 pro UV/Görünür Spektrofotometre | Amersham Biosciences | NA | Spektrofotometre |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Tampon |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH ayarı |
| Sodyum asetat | Sigma-Aldrich | 32319 | Tampon |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Glikojen depolimerizasyonu için | Megazyme | E-AMGPU |
| &alfa;-Amilaz, termostabil (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Glikojen depolimerizasyonu için enzim |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Glikoz tahlili için standart |
| Pierce BCA Protein tahlil kiti | Thermo Fisher scientific | 23225 | Protein konsantrasyonlarının belirlenmesi için |
| Alüminyum kurutma tepsileri, tek kullanımlık | VWR | 611-1362 | Hücre kuru ağırlıklarının belirlenmesi için |
| D-Glikoz test kiti (GODPOD formatı) | Megazyme | K-GLUC | Glikoz konsantrasyonlarının belirlenmesi için |
| Zirkonyum oksit ekmekler, 0,15 mm | Sonraki İlerleme | ZrOB015 | Hücre lizisi için boncuklar Bullet Blendar Storm |
| RINO tüpleri | Next Advance | NA | Tüpleri Bullet Blendar Storm'da hücre lizisi için |
Kaynaklar
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3)....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
