Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

10.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56083

⸱

18 Eylül 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

Bu makalede

Özet

Burada, prelabelled Mezenkimal hücrelerin sıçan aort kaynaklı endotel ağları ile birlikte kültürlü nerede aort yüzük testin yeni bir uygulama mevcut. Bu roman yöntemi görselleştirme Mezenkimal Stromal hücre (MSCs) posta ve endotel ağları ile entegrasyon, miktar ağ özellikleri ve MSC immunophenotypes ve gen ifade değerlendirme sağlar.

Özet

Anjiogenez bir karmaşık, yüksek düzenlenmiş sağlayan ve yeterli doku perfüzyon sürdürmek sorumlu işlemidir. Aşırı bol vasküler geliştirme kanser ve enflamatuar bozuklukları ile ilişkili olmakla birlikte yetersiz damarlara bakım ve patolojik malformasyonlar ağır iskemik hastalıklar, neden olabilir. Pro-anjiogenik tedavi bir umut verici yeni damarlara geliştirmek için düzenleyici faktörler de fiziksel destek sağlayabilir anjiogenik hücre kaynaklarının biçimidir.

Mezenkimal Stromal hücre (MSCs) algılamak ve iskemik veya iltihaplı dokulara ev için kapsamlı bir şekilde incelenen parakrin etkileri ve yeteneklerini nedeniyle damar rejenerasyon adaylarıdır. Özellikle ilk üç aylık dönem insan göbek kordonu Perivasküler (FTM HUCPVCs) onların pericyte gibi özellikler, proliferatif ve multilineage potansiyeli yüksek, bağışıklık ayrıcalıklı özellikler ve sağlam parakrin nedeniyle son derece gelecek vaat eden bir aday hücrelerdir profil. Etkili bir şekilde potansiyel anjiogenik rejeneratif hücre değerlendirmek için onlara güvenilir ve "çevrilebilir" önceden klinik deneyleri test için gerekli olduğunu. Aort yüzük tahlil endotel yapılar kolay miktar için sağlar, Aksesuar destekleyici hücreleri ve hücre dışı Matriks (ECM) ana bilgisayardan sağlayan, inflamatuar bileşenleri hariç, ve bir ex vivo angiogenez modelidir hızlı ve ucuz ayarlamak. Bu zaman içinde vivo modelleri (örneğin, kornea tahlil, Matrigel tak tahlil); göre avantajlıdır Aort yüzük tahlil yönetilen hücreleri izleyebilir ve hücreler arası etkileşimler xeno-bağışıklık ret kaçınırken gözlemlemek.

Biz gelişmekte olan fare aort endotel ağları ile ortak kültürde insan MSCs içerir aort yüzük testin roman bir uygulama için bir iletişim kuralı mevcut. Bu tahlil analiz oluşumu ve gelişimi fiziksel pericyte gibi etkileşimleri aracılığıyla tüp için MSC katkı ve onların potens aktif angiogenez sitelere geçirmek için ve yeteneklerini gerçekleştirmek ve arabuluculuk değerlendirmek için izin verir ECM işleme. Bu iletişim kuralı MSC fenotip ve gen ifade ortak kültür aşağıdaki değişiklikler üzerinde daha fazla bilgi sağlar.

Giriş

Karmaşık süreç angiogenez geliştirir ve damarlara1önceden varolan yeni kan damarı geliştirme teşvik ederek doku perfüzyon korur. Pro-anjiogenik ve anti-anjiogenik faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmiş, dengeli bir süreçtir. Bu sistemde herhangi bir eksikliği, yetersiz gemi bakım ya da büyüme, miyokardiyal hastalığı, inme ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere ağır iskemik hastalıklar neden neden olabilir. Ancak, abartılı vasküler geliştirme kanser ve enflamatuar bozuklukları2dahil olmak üzere koşullar özelliğidir.

Olumlu doku rejenerasyonu ulaşmak için anjiogenezi kontrol hedefliyoruz tedaviler geliştirmek anahtar öneme sahiptir. Geniş preklinik ve klinik araştırmalar rağmen istenilen sonuçları3,4,5ulaşmak pro-anjiogenik faktörler ve mikroRNA'lar kullanarak angiogenez uyarmak için girişimleri başarısız. Geçici efektler için olası nedenler şunlardır: anjiogenik proteinler ve nükleik asitleri ve sınırlı sayıda sınırlı uzun ömürlü hedeflenen büyüme faktörleri6,7. Çözünür anjiogenik faktörler angiogenez başlatmak için gerekli olmakla birlikte, bakım ve damarlara işlevselliğini perisitlerden ve düz kas hücreleri8de dahil olmak üzere hücre tipleri destekleyen bağlıdır. Pro-anjiogenik tedavi alan artık fiziksel olarak destekleyen yeni geliştirilen damarlara, kendini sürekli yenileyen veya içine bile ayırt ederken anjiogenik faktörler yerel olarak sağlayabilir potansiyel kök hücre ve progenitör hücre kaynakları keşfetmek endotel benzeri hücreler9,10. Hücre tipleri bu fonksiyonel gereksinimleri yerine getirmek için yeteneği ile en uygun anjiogenik bulma iskemik doku rejenerasyonu için büyük söz sahibidir.

Başarılı bir şekilde potansiyel hücre tabanlı terapiler klinik çevirmek için önceden klinik çalışmalar onların etkinliğini göstermek ve temel anjiogenik mekanizmaları vurgulamak gerekir. Kurulan angiogenez deneyleri yüksek sayıda rağmen alan güvenilir bir şekilde potansiyel aday hücre türleri11,12, etkinliğini değerlendirmek olabilir bir "altın standart" vitro tahlil yoksun 13. (endotel proliferasyon, geçiş ve tüp oluşumu deneyleri de dahil olmak üzere) çoğu vitro angiogenez deneyleri genellikle endotel hücre phenotypical değişiklikler veya içine farklılaşma hücre veya bileşikler etkilerini değerlendirmek borulu ve ağ yapıları14,15. Bu özellikler angiogenez için kritik olmakla birlikte, bir "çevrilebilir" tahlil da değerlendirmelidir: 1) büyütme veya yenisi ile değiştirme perisitlerden veya düz kas hücreleri, ECM ve/veya membran, 2) işlenmesi de dahil olmak üzere destek hücre tiplerinin ve 3). fonksiyonel microvasculature oluşumu tanıtmak için verimlilik. Vivo angiogenez modeller, kornea tahlil ve Matrigel tak tahlil, benzersiz vivo içinde microenvironment özetlemek ama yönetilen izleme hücre zorluk fiziksel etkileşim gözlemlemek için zorlanmaktadır. Ayrıca, in vivo modellerinde, potansiyel allojeneik hücre terapisi aday16test ederken xeno-bağışıklık ret oluşabilir. Ex vivo angiogenez modelleri, özellikle aort yüzük tahlil sağlayabilir: 1) kolay gözlem ve miktar ECM 3) 4) dışlama inflamatuar ana bilgisayar ve yapay malzemeleri, tübüler yapıların, 2) Aksesuar destekleyici hücreleri, bileşenler ve 5) hızlı ve ucuz17,18. Genellikle, aort yüzük tahlil küçük salgı proteinler, farmakolojik ve transgenik kemirgen modelleri19,20,21anjiogenik potansiyelinin test edebilirsiniz.

MSCs öncelikle den onların etkileri parakrin aracılı22,23,24vasküler rejenerasyon için umut verici adaylardır. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), hepatosit büyüme faktörü (HGF), dahil olmak üzere anahtar anjiogenik faktör salgılaması için MSCs gösterilmiştir İnsülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1), temel Fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs da algılayabilir ve ev sahipliği iskemik veya iltihaplı doku, ancak, tam mekanizmalar hâlâ soruşturuluyor. Giderek, edebiyat çoğu MSCs Perivasküler hücrelerden ortaya, pericyte işaretleri co hızlı ve perisitlerden27gibi davranabilir hipotezi destekler. HUCPVCs insan göbek kordonu Perivasküler bölgesinden elde edilen MSCs genç bir kaynaktır. Onlar MSCs nüfusu pericyte benzeri özellikleri ile temsil ve FTM ve terimi göbek bağları ile karakterizedir. FTM HUCPVCs yüksek bir ifade CD146 ve NG2, proliferatif ve multilineage potansiyeli yüksek, bağışıklık ayrıcalıklı özellikler de dahil olmak üzere pericyte işaretlerinin göstermek ve bir sağlam parakrin profil28görüntüler. FTM HUCPVCs yaralı doku pericyte benzeri özellikleri ile yeni damarlara teşviki ile rejenerasyon teşvik için ideal bir aday hücre tipi vardır.

Anjiogenik potansiyeli ve insan MSCs pericyte gibi özelliklerini sınamak için anjiogenez deneyleri çok sınırlı sayıda mevcut olumlu nerede angiotropic geçiş (bundan sonra "posta" olarak anılacaktır), işleme ECM ve fiziksel gelişimi vardır hücre tipleri arasındaki etkileşimler, microvasculature gelişimi üzerine Nicel veri alırken soruşturma.

Bu vesile ile aort yüzük testin yeni bir uygulamayı açıklayan bir iletişim kuralı mevcut. İnsan MSCs oluşumu, olgunlaşma ve homeostasis tüp için yaptıkları katkı değerlendirmek için gelişmekte olan fare kaynaklı aort endotel ağları ile birlikte kültürlü. Aort yüzük tahlil bu sürümü yetenek ve kudret eve angiogenez sitelere gerçekleştirmek ve ECM işleme aracılık ve pericyte gibi fiziksel kurulması ile endotel borulu gelişmeye katkıda hücre terapisi adayların değerlendiriyor etkileşimler. MSCs net etkisi vitro endotel ağ oluşumu üzerinde miktarının ve hücreler arası etkileşimler gözlemleyerek ek olarak, biz de ortak kültürler MSCs yalıtmak için bir protokol optimize. Akış Sitometresi ve qPCR gerçekleştirerek, MSC fenotip ve gen ifade ortak kültür aşağıdaki değişiklikleri tanımlamak mümkündür. Olarak model hücre tipleri, biz ontogenetically erken göre (doğum öncesi) ve insan MSCs geç (Yetişkin) kaynakları: FTM HUCPVCs ve insan kemik iliği türevi MSCs (BMSC), sırasıyla, aort yüzük tahlil içinde. Önerdiğimiz aort yüzük tahlil soruşturma zaman anjiogenik rejeneratif uygulamaları altında fiziksel olarak destekleyen herhangi bir hücre tipi anjiogenik potansiyelinin çalışma için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

hayvanları içeren tüm çalışmaları yürütülen ve varış yönergeleri 29 göre bildirdi. Tüm çalışmaları kurumsal araştırma Etik Kurulu onayı (REB numarası 4276) ile yapıldı. Tüm hayvan yordamlar Üniversitesi Sağlık ağı (Toronto, Kanada), hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi ve tüm hayvan insana ilişkin bakım bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım kılavuzu, 8 th edition () uygun olarak alınan Sağlık 2011 Ulusal Enstitüleri).

1. aort yüzük tahlil kurulum

  1. izole sıçan Aortası.
    1. Euthanize 8 - 10 haftalık Sprague-Dawley Rat CO 2 boğulma kullanarak: Set CO %2 20 odalarına gaz değiştirme (akış hızı 0.2 x odası birim/dk =). Çimdik refleks ve kalp atım yokluğunda tarafından göğüs palpating tarafından onaylayın.
    2. Kürk göğüs bölgesinde % 70 etanol ile steril gazlı bez kullanarak üzerinde ıslak. Kesik göğüs orta hat yapmak ve cilt ve kas katmanından kesmek için sterilize forseps ve makas kullanın.
      3. Göğüs kafesi maruz sonra
    3. her iki tarafta göğüs kafesi kesilmiş ve göğüs kemiği yukarı doğru yaklaşık 5 mm'den her iki tarafta katlayın. Taze kadavraları interkostal arterler bazı kanama beklenen.
    4. Kalp ve akciğer dokusu aort damarı ortaya çıkarmak için anatomik sağ tarafa itin. Aort beyazdır bulunan gemi omurga için bitişik renkli.
    5. (Aort sonra) aort pinch ve Cerrahi makas Forseps ile aort tutarken ilk kesi yapmak kullanmak için kullanım forseps. Aort kesme, üzerine göğüs boşluğu kanla hızlı bir şekilde doldurur, bu nedenle kan pıhtılaşması önce aort elde etmek için hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir.
    6. Aort tutun ve hafifçe aşağı doğru aort omurga uzak soyma kullanım forseps. Çekme olmadan daha fazla insizyon interkostal arterler sever. Aort karın boşluğunda iki dalı böler ve aort karkas dışarı kesme önce yaklaşık 10 cm doku ve/veya edinin. Kaudal yönü aort bölümlerini düşürmek için erişim kazanmak için gerekirse diyafram itin.
      Not: yoğun güç gözyaşı neden olabilir çünkü aort hafifçe kabuğu. Aort gözyaşları kan pıhtılaşması birkaç saniye için izin ve pıhtılaşmış kan kaldırmak için kağıt havlu kullanın, kalan aort görünürlüğünü izin.
    7. 15 mL tüp 10 mL buz gibi Hank ile aort yer ' dengeli tuz çözüm (HBSS) takıma % 1 penisilin/streptomisin ile (P/S) s. Tüpler buz üzerinde tutmak
      Not: Aortik doku buz üzerinde 1-2 saat sürebilir ama mümkün olduğunca hızlı bir şekilde işlemek en iyisi.
  2. Steril Biyogüvenlik Kabini (BSC) aort yüzük tahlil kültür medyada hazırlamak.
    1. Hazırla %2 Fetal sığır Serum (FBS), % 1 gentamisin ve büyüme faktörleri (Tablo malzemeleri görmek) 500 mL endotel Bazal orta (EBM) filtre uygulamak için bir filtrasyon ünitesi kullanarak endotelyal büyüme orta (EGM). Boncuk veya su banyosu 37 50 mL süzülmüş medya yerleştirin ° C.
    2. 100 mL filtre uygulamak için başka bir filtrasyon ünitesi kullanın, %2 FBS ve % 1 ile EBM EBM P/S için hazırlanan % 2 FBS (EBM-FBS) ve 4'te ° C.
  3. Kat 12-iyi doku kültürü plakaları Bazal membran ayıklamak (BME) ile buz üzerinde çalışırken.
    1. Yer soğuk bir yüzey (büyük buz torbası veya tepsi) 12-şey tabağa. 200 µL/iyi taze çözdürülen BME kullanmanın pipet ipuçları buzdolabında ve hatta kaplama emin olmak için BME girdap ekleyin. Hızlı bir şekilde BME düzensiz polimerizasyon önlemek için çalışma.
      Not: Tipik aort eksizyon 20 aort halkaları verir. Aort yüzük deneyleri arasında değişkenlik hesaba katan tedavi grubu başına en az üç aort yüzük deneyleri kurulum ve denetim içerir. Kaynak izin verirse, tedavi grubu başına 6 halkası önerilir.
    2. Yer kaplamalı plakalar oksijen kuluçka (%95 bağıl nem, 37 ° C, % 5 CO 2; bundan sonra tüm oksijen kuluçka adımlar için geçerlidir bu koşullar) 30 dk. yer 1000-20 ° C için adım 1.5.3 µL pipet ipuçları geri.
      Not: Bazal membran özü hisse senedi konsantrasyon kullanılırken, tutarlılık ve sertlik sıkı bir şekilde kontrol polimerizasyon zaman. Tam aynı polimerizasyon zaman tüm paralellikler ve bağımsız denemeleri için tutmak için emin olun.
  4. Aort Tekdüzen yüzük içine bölüm.
    1. Aort 15 mL tüp alıp 10 mL % 1'ile takıma taze HBSS ile 10 cm çanak içine yerleştirin P/S.
    2. İki set forseps dikkatle aşırı bağ dokusu, yağ dokusu ve aort için neşterden interkostal arterler kalan dalları için bağlı kullanım ayırmak için kullanın. Bu değişkenlik kalan dokusunun farklı düzeylerine göre yüzük birimler arasında azaltır. Herhangi bir kalıntı pıhtılaşmış kan aort içinde kaldır.
    3. Bir cetvel ya da kılavuz tam olarak 1-2 mm geniş steril neşter ve forseps kullanarak aort bölümlerini kesmek için altında 10 cm çanak yerleştirin. Bölümleri birimleri arasındaki değişkenliği azaltmak mümkün olduğunca kesin olarak kesmek.
  5. Aort Yüzüklerin BME embed.
    Not: Aortik halkaları kesit BME polimerizasyon kuluçka önce tamamlanmazsa, kaplamalı plakalar oksijen İnkübatörler kaldırın ve EBM 100 µL polimerizasyon sonlandırmak için her şey için ekleyin. Tam zamanlama olarak BME aşırı polimerizasyonu ile endotel ağ geliştirme ve hücre göç engelleyebilir önemlidir. Aort Yüzüklerin hazırlanır sonra EBM kuyulardan kaldırmak ve 1.5.2 adımından devam.
    1. Kaplı BME wells oksijen İnkübatörler kaldırmak ve lisans için iade.
    2. Dikkatle Forseps ile bireysel aort yüzük almak ve her BME kaplı iyi ortasında yer. Tekrar kalan aort yüzük için.
      Not: medya ile birlikte aort yüzük transfer polimerizasyon usulsüzlük önlemek için en az tutulmalıdır.
    3. Kullanımı (-20 ° C) 1.000 µL pipet ipuçları BME 300 µL üstünde tepe-in her aort halka eklemek ve eşit BME kuyunun etrafında dağıtmak için soğutmalı.
    4. Katıştırılmış aort Yüzüklerin 30 dakika süreyle oksijen kuluçka için dönmek
    5. Katıştırılmış aort yüzük ile plakalar oksijen İnkübatörler kaldırmak ve yavaş 1.000 µL EGM (hazır ve ılık, adım 1.2.1), pipet yerleştirerek uç kültür duvara de ekleyin.
      Not: Doğrudan medya BME üzerine pipetting polimerli BME ve sürekli endotel ağ geliştirme engel bozmak. Kullanılabilir uygun bir çok kanallı pipet kullanın.
    6. Takiben 24 h, EGM 1.000 µL kaldırmak ve EBM-FBS adım 1.2.2, yine yavaş yavaş kültür yan karşı iyi pipetting tarafından hazırlanmış 1000 µL yerine.
  6. Aort yüzük tahlil EBM-FBS 500 µL taze EBM-FBS (37 ° C) 500 µL ile her 48 h. değiştirerek korumak
    Not: Bkz: snTion MSC kültür genişleme aort yüzük tahlil kuruluş olarak aynı gün başlatmak için 2. Bu endotel ağlar hazır olduğunuzda MSCs ortak kültürü için hazır olduğunu garanti eder.
  7. Aort yüzük tahlil endotel ağ geliştirme takip etmek parlak alan mikroskobu kullanın (en iyi ağ geliştirme için başvuru olarak şekil 1 bakınız). Şekil 2 ' de gösterildiği gibi endotel ağlar yönüdür sonra aort yüzük tahlil-MSC ortak kültürler (Bölüm 3) ayarlama ile devam etmek. Adım 4.1 endotel ağları görüntüleme daha ayrıntılı bilgi için aşağıdaki anlamlara.

2. Doku kültürü

  1. doku kültürü medya hisse senedi çözümleri hazırlayın.
    1. Kültür FTM HUCPVCs (daha önce kurulmuş, n ≥ her biri için 3 bağımsız hattı) 30 ve alfa-MEM %10 FBS ve % 1 ile desteklenmiş olarak piyasada bulunan BMSCs P/S.
    2. 0.2 µm gözenek boyutu filtre şişeler kullanarak ortamın sterilize.
    3. Hazırlanan medya çözümleri 4 ° C'de 3 haftaya kadar mağaza.
  2. Oksijen İnkübatörler ve geçiş faz kontrast mikroskobu tarafından belirlenen % 70-80 confluency, FTM HUCPVC korumak ve BMSC kültürlerde. Doku kültürü çanak boyutu için medya kullanımı uygun birimler (Yani 10 cm tabak içinde 10 mL) kullanılır. Bakımı ve MSCs passaging Bu kültür koşullar kullanın.
  3. Passaging için MSC monolayers ayırmak veya aort yüzük tahlil-MSC bir ayrılma enzim çözüm (4 mL/10 cm çanak) kullanarak ortak kültürler ve 3 dk. emin olun dekolmanı parlak alan mikroskobu kullanarak hücrelerin oksijen İnkübatörler kuluçkaya; kuluçkaya gerekirse bir ek 1-2 min için.
  4. 15 mL tüp ve vasıl 400 x g 5 dakika süreyle santrifüj Disosiye hücrelere transfer
  5. Hücre Pelet bozmadan süpernatant Aspire edin ve bir hücre sayaç sayım için uygun bir kültür ortamının (alfa-MEM komple medya hücreleri veya EBM-FBS aort yüzük tahlil/MSC ortak kültürler için passaging için) 1 mL hücrelerde resuspend.

3. Aort yüzük tahlil/MSC ortak kültürler hazırlanması

  1. tohum 10 4 MSCs her gömülü aort yüzük (9,000 hücreler/cm 2 / 12-şey plaka). Aort yüzük deneyleri sayısına göre uygun, devredilemez floresan boya MSCs önceden leke. MSCs olmadan aort halkalar bir kontrol grubu için en az üç kuyu korumak.
    1. 10 5 MSCs/mL EBM-FBS medya leke, 2.5 µL kalıcı olarak eklemek için devredilemez floresan boya/mL medya (5 mikron) 15 mL tüp ve yer 30 dakika süreyle oksijen kuluçka kuluçka yarım tüp karışımı yavaşça.
    2. Aşağıdaki 30 dk kuluçka, taze EBM-FBS lekeli hücrelere 1 birim ekleme ve 400 x g 5 dakika süreyle de spin
    3. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 1 mL EBM-FBS medya yeniden askıya alma. Başarılı Floresans mikroskobu kullanılarak MSCs boyama onaylayın.
  2. Aort yüzüğü içeren levhalar her kuyudan EBM-FBS 500 µL sökün oksijen kuluçka ve.
  3. Dikkatle 10 4 MSCs EBM-FBS 500 µL her katıştırılmış aort halkası üzerinde eşit olarak endotel ağlar pipetting tarafından tohum. Hatta dağıtım kültür plaka hafifçe sallayarak olun.
    1. Aort yüzük tahlil/MSC işbirliği kültürü üzerinde medya hacmi 1000 µL olduğundan emin olmak için ek EBM FBS ekleyin.
  4. Aort yüzük tahlil fluorescently etiketli MSCs görselleştirmek için Floresans mikroskobu kullanın.

4. mikroskopi

  1. aort yüzük tahlil/MSC önce sıçan endotel ağlar görüntüye kullanım alanı parlak mikroskobu ortak kültürlerin endotel ağ özellikleri (örneğin, ağ temel (0 gün) ölçülerini Uzunluk, ağ döngüler). Görüntü 4 kadranın aort yüzük kuyudan endotel ağı bu çeyreği içinde en uzak kısmına başına. Aort yüzüğü takip
    1. görüntü aort ring ağlarında tahlil/MSC 3, 5 ve 7 gün ortak kültürler. Endotel ağ geliştirme MSC etkisini ölçmek için bu görüntüleri kullanın.
  2. Aort yüzük tahlil önceden etiketli MSCs görüntüye Floresans mikroskobu kullanın.
    1. Aşağıdaki 24 aort yüzük tahlil/MSC s ortak kültürler, Floresans mikroskobu MSC posta, uzama ve endotel ağları ile entegrasyon görselleştirmek için kullanın. MSCs floresan görüntüleri her iki hücre tiplerinin colocalization gözlemlemek için endotel hücreleri parlak alan görüntüleri ile örtüşüyor.
    2. Görüntü gelişmiş endotel ağları proksimal aort yüzük doku içerisinde lokalize MSCs ve yeni ağlar distal aort yüzük doku ( Şekil 2) geliştirme içinde lokalize MSCs.

5. Akış Sitometresi ve qPCR

  1. 4 ° C'de O donmuş dispase aort ring endotel ağları, dissociating önce bir gün tezcan/i. Bölüm 5.3 Akış Sitometresi ve qPCR için aynı.
  2. 50 mL dispase ve 37 ° C boncuk veya su banyosunda % 0.5 tripsin 50 mL sıcak.
  3. Aort yüzük tahlil/MSC ortak kültür analizi için hücreleri almak.
    1. Sonra 1 hafta aort yüzük tahlil/MSC ortak kültür, kültür ortamını çıkarın ve 1 mL olarak Phosphate-Buffered serum fizyolojik (yavaş yavaş her 3 dakikadır iyi ve kaldırmak için PBS) ekleyin. Bu yıkama iki kez daha tekrarlayın.
    2. Eklemek 800 µL, dispase her şey için önceden ısıttı ve 15 dakika süreyle oksijen İnkübatörler kuluçkaya
    3. Tabakaları oksijen İnkübatörler kaldırmak ve dispase kadar BME kırmak için (5-10 x) pipetting tarafından askıya alma ve her şey içeriğini ayrı 15 mL tüpler içine aktarmak.
      4. Hiçbir kalıntı kadar taze Önceden ısıtılmış dispase ile tekrar
    4. tekrar adım 5.3.3 BME kültüründe de görülmektedir. %3 ile desteklenmiş PBS 1 birim ekleme FBS dispase-hücre süspansiyon için dispase devre dışı bırakabilirsiniz. Aort Yüzüklerin pipet ipuçlarını kullanarak hücre süspansiyon içinde yüzen kaldırmak.
    5. Spin hücre süspansiyonlar 400 x g de 5 dk. için çıkarmak süpernatant dikkatle, hücre süspansiyon 3 mL 15 mL tüp bırakarak.
      Not: Bir açık, katı Pelet görünür olmayabilir ama hücreleri ve BME hediyesi.
    6. Prewarmed % 0.5 tripsin 3 mL hücre süspansiyon ve şiddetle resuspend (5-10 x pipetting tarafından) hücreleri ekleyin. 10 dakika süreyle oksijen İnkübatörler trypsinized hücre çözümlerinde kuluçkaya
    7. Trypsinized hücre süspansiyonlar oksijen İnkübatörler kaldırmak ve PBS %3 FBS ve resuspend 6 mL ekleyin birkaç times. Hücre süspansiyonlar 400 x g 5 dakika süreyle, spin
    8. Dikkatle hücre Pelet tüp bırakarak tüm süpernatant, kaldırmak ve 1 mL %3 ile desteklenmiş PBS hücrelerde resuspend her tüpün içinde FBS.
    9. Toplanan hücre ve kalan BME hücre süspansiyon kaldırmak için bir 70 µm hücre süzgeç kullanma 1 mL hücre süspansiyon filtre. Hücrelerin hücre süspansiyon hücre sayaç 1 ml.
  4. Hücreleri Akış Sitometresi için hazırlamak.
    1. Incubate hücre süspansiyonlar (%3 ile takıma 200 µL PBS 10 5 hücrelerde FBS) fluorophore Birleşik (FITC veya APC) birincil antikorlar ile (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) konsantrasyon = 1:40) 30 dk için 4 ° C'de korumalı gelen ışık.
      Not: Hong vd tarafından 2013 28 Akış Sitometresi MSCs için optimize edildi. En az 10.000 hücrelerinin doğru okumalar için gereklidir.
    2. 30 dk kuluçka takip resuspend 2 mL %3 FBS ve santrifüj (400 x g, 5 min) ile desteklenmiş PBS hücrelerde.
    3. Tutun hücreleri ışıktan Akış Sitometresi (en az 1 x 10 4 olaylar) tarafından analiz kadar korumalı içinde 1 h 4 ° C'de. Perdeleme strateji için tamamlayıcı şekil 1 bakınız. Sıralama insan MSCs anti-TRA-1-85 (APC) kullanarak (konsantrasyon: 1:40 ve % 0,5 FBS/PBS) ve sıralama hücreleri içine hücre lizis arabelleği qPCR analiz için 350 µL.
      Not: Gelecekteki qPCR analiz için 3 aya kadar-80 ° C'de Lysed hücreleri saklanabilir.
  5. QPCR analiz için hücreleri hazırlayın.
    1. Lysed hücreleri sütunlara göre RNA izolasyon Kitleri kullanarak RNA yalıtmak ve RNA konsantrasyon ve kalite belirlemek.
    2. Hazırlama cDNA RNA 5 µg başına 100 üzerinden µL transkriptaz tepki. RNA verim düşükse bir öncesi amplifikasyon adımıysa (< 10 ng/µL). 100'den küçük kullanımı ng RNA'ın yanlış negatifleri yüksek bir oran içinde sonuçlanacaktır.
      Not: CDNA şablonları-20 ° c daha fazla çözümleme için 4 aya kadar saklanabilir.
    3. Gen ifadesinde değişiklikleri algılamak için angiogenez ifade profiler dizileri kullanma qPCR gerçekleştirin. CDNA reaksiyon (40 döngüleri, 60 ° C sıcaklık tavlama/genişletme) başına kullanım 5 ng. Kat değişiklik farklılaşmamış türetilmiş MSC cDNA örnekleri için karşılaştırıldığında ifade hızlı. Uygun negatif denetimleri (aort yüzük olmadan insan MSCs) çalıştırmak.

6. Ağ miktar aşağıdaki aort yüzük tahlil/MSC ortak kültür

  1. ile birlikte angiogenez Çözümleyicisi eklenti 31 ImageJ gibi görüntüleme yazılımı indirmek.
  2. Alınan endotel ağ görüntüleri içe ve açmak belgili tanımlık bilgisayar yazılımı ı.
  3. Kullanılan mikroskop teknik özellikleri temel görüntüyü ölçekler dönüştürmek.
  4. Radyal ağ büyüme ölçmek için bir düz çizgi aracını kullanın.
  5. Hücre sayacı aracını kullanarak endotel ağ döngüler saymak (döngüler en az 4 kenarlara sahip sayılabilir).
  6. Ağ özellikleri, ek miktar kullanmak için angiogenez Çözümleyicisi eklenti veya benzer diğer eklentileri ana segmentleri, analiz etmek için toplam kesim uzunluğu, toplam ağ alanları ve kavşak sayısı. Aort yüzük doku ve yanlış pozitif hesaplamalar önlemek için boşluk bulanıklık için bulanık maskesi aracını kullanın.
  7. Aort yüzük tahlil/MSC ortak kültürler takip bir istatistik programı ve graph endotel ağ özellikleri için değerleri transfer.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Aort yüzük/MSC ortak kültür tahlil oluşturmak için şematik iş akışı şekil 1' de gösterilmiştir. Ana adımları şunlardır: rat aort yalıtım, kesit ve aort Yüzüklerin katıştırma, endotel çimlenme ve ağ geliştirme, izleme ve son olarak etiketleme ve MSCs yönetme. Endotel ağ analizi kronolojisi ortak kültür her dönem için uygun analizleri için pencere özetliyor: gün 1, 5 & 7. Ek notlar noktalı kutuları ile vurgulanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bir başarılı aort yüzük tahlil MSC ortak kültür deney ortamında birkaç kritik aşama vardır. İlk olarak, yalıtma ve aort kesit en önemli adımlar şunlardır: 1) aort; sadece torasik segment elde etme 2) dikkatle dallanma kan damarları, bağ ve yağ dokusu kaldırma ve; 3) kesme bile bölümleri her tahlil arasında değişkenlik sınırlamak için aort (~ 1 mm). İkinci olarak, başarılı aort halkaları BME gömme bu tahlil için önemlidir. BME tamamen polimerli ya da düzensiz polimerli BME içinde gömülü Yüzüklerin aort endotel çimlenme ba...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Dr. Clifford L. Librach olduğunu ortak patent sahibinin: yalıtım ve ilk üç aylık göbek kordonu dokusundan elde edilen hücre kullanım yöntemleri. Kanada ve Avustralya'verildi.

Teşekkürler

Yazarlar aşağıdaki personel üye teşekkür ve araştırma personeli: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai ve Sarah Laronde.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alpha-MEMGibco12571071FTM HUCPVC ve BMSC kültür ortamı için.
APC konjuge anti insan TRA-1-85R& D SystemsFAB3195AAkış sitometrisi ve hücre sıralama için insana özel hücre belirteci
Bazal membran ekstresi (BME) (Matrigel)Aortgömme içinCorning354234
Bullet-kitLonzaCC-3162şunları içerir: Gentamisin/Amfoterisin-B
(GA)insan epidermal
Büyüme Faktörü (hEGF); Vasküler
endotelyal büyüme faktörü (VEGF); R3-
İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü-1 (R3-IGF-1);
askorbik asit; Hidrokortizon;
insan Fibroblast Büyüme Faktörü-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Sığır Serumu
(FBS). EGM
CellTracker Green CMFDA DyeThermo-fisherC2925'iiçin gereklidir MSC'leri boyamak için yeşil, MSC'ler tarafından en iyi şekilde alınır
CKX53 Kültür MikroskobuOlympusEndotel ağı gelişiminin parlak alan görüntülemesi için
Kontes otomatik hücre sayacıInvitrogenC10227MSC kültürü, akış sitometrisi ve qPCR
Dispaseiçin hücre sayımıKök Hücre teknolojileri7923Aort halkası-MSC ko-kültürlerini ayırmak için (37 ° C'de ön ısıtma; C)
Tek kullanımlık steril neşterlerVWR21909-654Aort
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinSigma-AldrichD8537PBS'sini kesmek için. 1X, Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan
Endotelyal bazal ortam (EBM)LonzaCC-3156Aort halkası testi-MSC ko-kültürlerinin kültürlenmesi için gerekli bazal ortam (37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C). EGM ve EBM-FBS için gereklidir
Etanol, %70, Biyoteknoloji SınıfıVWR97064-768Yüzeyleri sterilize etmek için
EVOSYaşam TeknolojileriMSC göçünü ve entegrasyonunu izlemek için kurum içi floresan mikroskobu
Fetal sığır serumu (FBS) (Hyclone)GE HealthcareSH3039603Hücre kültürü ortamının serum bileşeni
FITC konjuge anti-CD31 antikoruBD558068Akış sitometrisi için insan endotel belirteci
FITC konjuge anti-CD146antikorBD560846Akış sitometrisi için insan perisit belirteci
ForsepsAlmedic7727-A10-704Sıçan dokusunu vermek için. Benzer forseps kullanabilir
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Yaşam Teknolojileri14175-0941X Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan
HERAcell 150i CO2 İnkübatörThermo Fisher Scientific51026410Hücreleri inkübe etmek için
İnsan Anjiyogenezi RT2 profil oluşturucu PCR dizisiQiagenPAHS-024Zİnsana özgü ve anjiyogenezde yer alan 84 gen için primerler içerir. Her kuyu 1 primer reaksiyon
ImageJAçık kaynak görüntü işleme yazılımıdır. Anjiyogenez analizörü eklentisi
gerektirir: LSR IIBDUHN SickKids FC Tesisi. Akış sitometrisi için.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Tesisi. Hücre sıralama için.
Penisilin / streptomisinGibco15140122Tamponlara ve hücre kültürü ortamına antibiyotik bileşeni
RNeasy Mini KitQiagen74104RNA saflaştırması için. Hücre lizis tamponu
içerir RT2Easy İlk İplik KitiQiagen330421qPCR için cDNA'nın hazırlanması için
RT2PreAMP cDNA Sentez KitiQiagen330451Düşük verimli RNA ise cDNA'nın ön amplifikasyonu
Cerrahi makasGüzel Bilim Araçları14059-11Cilt, kas ve aort kesmek için
Steril gazlı bezVWR3084Göğüs kürkünü nemlendirmek ve sterilize etmek için
TrypleEThermo Fisher Scientific12605036MSC ayrışma enzimi 37 ° C'de önceden ısıtılır; C
0.2 ve mu; m gözenek filtrasyon ünitesiThermo Fisher Scientific566-0020Doku kültürü ortamını sterilize etmek için
%0,25 Tripsin/EDTAGibco25200056Hücre ayrışması için, 37 ° C'de ön ısıtma; C
10 cm doku kültürü kaplarıCorning25382-428Aort ve MSC hücre kültürünün temizlenmesi ve kesitlenmesi için
12 iyi hücre kültürü plakasıCorning-Sigma AldrichCLS3513Aort halkası testi-MSC ko-kültürlerinin ayarlanması için
15 mL tüpBD Falcon352096Genel doku kültürü prosedürleri için
70 & mu; m hücreli süzgeçFisherbrand22363548Akış sitometrisi veya sıralamadan önce tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için
hazırlamak

Kaynaklar

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946(2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Aort Halkası AnaliziKo-kültür TekniğiEndotelyal Ağ OluşumuAydınlık Alan MikroskopisiFloresan MikroskobisiAkış SitometrisiqPCR AnaliziDispase UygulamasıTripsin Sindirimi
Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.