Yöntem makalesi

Vitro Sıçanlarda kolon Afferent liflerinin Elektrofizyolojik özellikleri karakterizasyonu

DOI:

10.3791/56090

⸱

27 Eylül 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hongqiao International Institute of Medical Research, Tongren Hospital and Department of Physiology, Faculty of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anormal duyusal fonksiyonu altında yatan visseral ağrı ve diğer semptomlar işlevsel ve enflamatuar barsak hastalıkları. Bir ex vivo sıçan colorectum hazırlık kolon afferent sinirlerin Elektrofizyolojik kayıt için bir protokol burada sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Disfonksiyon kolon duyusal sinir işlevsel ve enflamatuar barsak hastalıkları ve diyabet gibi birçok ortak koşulları Patofizyoloji karıştığı olmuştur. Burada, kolon afferents Sıçanlarda Elektrofizyolojik özellikleri vitro karakterizasyonu için bir protokol açıklayın. Colorectum bağlı, bozulmamış pelvik gangliyon (PG) ile sıçan gelen kaldırılır; carbogenated kayıt odasında Krebs çözüm ile superfused; ve distansiyonu için izin vermek için oral ve anal ucunda cannulated. PG yayılan bir iyi sinir paket tanımlanır ve multiunit afferent sinir faaliyet emme bir elektrot kullanarak kaydedilir. Distansiyonu kolon segmentin kademeli multiunit deşarj artışlar ortaya çıkarır. Düşük eşikli, yüksek eşikli ve geniş dinamik sıra afferent lifleri ayırmak için asıl bileşen analizi yapılır. Kolon afferents kimyasal duyarlılık testi bileşikler banyo veya intraluminal yönetim okudu olabilir. Bu iletişim kuralı uygulama için diğer türler, fare ve eskiden şiling şimdi pigs gibi ve thoracolumbar/hypogastric ve Lumbosakral/pelvik afferents inen kolon normal Elektrofizyolojik özelliklerindeki farklılıklar çalışmaya değiştirilebilir ve patolojik durum.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrointestinal sistem (GIT) zengin dışsal afferent sinir duyusal gut merkezi sinir sistemi için sinyalleri iletmek ve bu gut-beyin etkileşimine katkıda innervated. Bu dışsal afferents değişmiş uyarılabilirlik, hem de değiştirilmiş merkezi işlem afferent girdilerin visseral ağrı ve diğer semptomlar işlevsel ve enflamatuar barsak hastalıkları1de dahil olmak üzere GI koşullardan altında yatan. Colorectum gelen duyusal bilgileri öncelikle thoracolumbar/hypogastric ve Lumbosakral/pelvik sinirler (PN)2ile aktarılmaktadır. Kemirgen hastalık modelleri bu birincil afferent liflerinin Elektrofizyolojik özellikleri eğitim artan bir ilgi oluştu. Ancak, in vivo Elektrofizyolojik kayıtları Rodents kolon afferents teknik bir sorundur ve önemli cerrahi becerileri gerektirir. Buna ek olarak, hemodinamik değişiklikler, doku hareketi ve anestezi de sinir etkinliği ve hassasiyetini uyaranlara vivo içindetest etmek için bazı etkileri olur. Bu nedenle, son yıllarda, farklı tür, dahil olmak üzere fare, rats, eskiden şiling şimdi pigs ve insanlar, vitro (ex vivo) hazırlıkları içinde kolon duyusal iletim mekanizmaları incelemek için çalışmalar giderek artan sayıda istihdam afferents ve hastalık koşullarında değişmiş uyarılabilirlik. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8

Ex vivo kolon hazırlık iki tür öncelikle bildirilmiştir: "düz sayfalık" hazırlık5,9,10 ve "tüp" hazırlık3,4. Video iletişim kuralı "düz sayfalık" fare colorectum hazırlık için daha önce yayımlanmış11oldu. Bu protokol, fare colorectum ile PN) veya lomber splanchnic sinirler (SSN) bağlı, hasat ve superfused bir doku odasında. Colorectum boyuna ikiye ayıracağım ve sinir demeti parafin yağı ile dolu bir kayıt bölme içine genişletilir. Sinir faaliyet monopolar Platin-iridyum elektrot kullanarak kaydedilir. Protokol bireysel afferent liflerinin alıcı alanları tanımlanması için tarafsız elektriksel stimülasyon kullanarak sağlar. Kimyasal uyaranlara uygulanması, hem de uygulamanın farklı mekanik stimülasyon paradigmaların yerelleştirir (Örneğin, Fokal Mukozal sondalama ve çevresel streç), afferent sinir uçlarının için. Sinir doku odasından ayrı bir odaya genişlemelidir çünkü bağlı sinir nispeten uzun tutmak için önemlidir; sinirleri başarılı diseksiyon Bu metodoloji yeni bu bir meydan okuma teşkil. Daha yakın zamanlarda, Nullens ve ark. Mezenterik afferents in vitro kayıt için video bir protokol fare jejunal ve kolon kesimleri12yayınlandı. Bu "tüp" hazırlanmasında bağlı bıçaklanmasından gut segment bozulmamış, böylece kademeli distansiyonu ve farklı kimyasallar içi ve ekstra luminal Yönetim için izin tutulur. Bıçaklanmasından sinir doku yakın konumlandırılmış olabilir, bir emme elektrot kullanarak kaydedilen bu yana bıçaklanmasından sinir nispeten kısa olsa bile afferent etkinlik kaydedilebilir. Ancak, bıçaklanmasından sinir değişir innervate Vagus ve omurga afferent liflerinin karışık nüfus oluşur veya thoracolumbar hypogastric. Lumbosakral pelvik afferents bu protokol için ayrımcılık colorectum innervate. Burada, sıçan kolon afferents "tüp" colorectum hazırlık ile sağlam bir PG kullanarak Elektrofizyolojik kayıt için detaylı bir iletişim kuralı mevcut Bu yöntem lomber fonksiyonel özelliklerini karakterizasyonu için splanchnic izin verebilir (hypogastric) ve Lumbosakral pelvik afferents.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hayvan Etik Komitesi, Shanghai Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından (# SYXK2013-0050) rapor burada deneysel protokol onaylandı. sağlam ganglion ve sinir colorectum diseksiyon gövde Bu teknikte oldukça deneyimli bir kişi için en az 15 dakika alır. Bu nedenle sonraki Elektrofizyolojik kayıt için dokuların canlılığı sağlamak için gruptakiler, performans iken hayvan hayatta ama derin anestezi altında tutmak gereklidir.

1. hazırlık perfüzyon çözüm ve Test bileşikleri

  1. hazırlamak 5 L Krebs çözüm: 113 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO 3, 1,2 mM CaCl 2 ve 11.5 mM glikoz. Çözüm emdirmek % 95'i O 2 + % 5 CO 2 gaz karışımı ile. Önceden buzdolabından oksijenli Krebs ~ 500 mL serin.
  2. Hazırla aliquots stokunun gerektiği gibi bileşikler (etanol ve 10 mM 5-hydroxytryptamine (5-HT) serum fizyolojik içinde 1 mM kapsaisin) sınayın. Hisse senedi Krebs (için banyo uygulaması) ve serum (intraluminal Yönetim için) son toplama kullanmak için sadece önceki sulandırmak.

2. Kayıt elektrodu hazırlanması

  1. kayıt elektrot çift cam tüpler bir geleneksel elektrot çektirmenin kullanarak iç filamentler (1.5 mm dış çap) çekme. Isı çektirme ayarlarını ve böylece bıçak çekti elektrot arasında 20 çekin ve 25 mm.

3. Doku koleksiyonu

  1. uyuşturan derinden sodyum Fentobarbital (80 mg/kg, IP) kullanarak fare.
  2. Kısırlık sağlarken, karın boşluğu bir neşter kullanarak karın duvarına bir ensizyon uygulayarak maruz. Bıçaklanmasından ve colorectum ortaya çıkarmak için diğer dokulara bir kenara çekin.
  3. Hayvan diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Dikkatli diseksiyon, sol PG bulun ve PN ve katılarak SSN tanımlar. Bu sinirler sayfa uzak birkaç milimetre kesme
    Not: PG kolorektal Kavşağı yakınında yer almaktadır. Genellikle, Lumbosakral spinal kord ve SSN projesinde 3-4 PN için PG ( şekil 1).
  4. Rektum ortaya çıkarmak için symphysis kemik kesme. Colorectum yukarıda belgili tanımlık doku (Yani, idrar kesesi, vb) kaldırın; PG olduğu gibi bırakmak için dikkatli olun.
  5. Sıçan Fentobarbital aşırı dozda intravenöz enjeksiyon tarafından kurban. İki nokta üst üste yaklaşık 3 cm yukarıda PG transect ve forseps kullanarak hayvandan colorectum kaldırmak.
  6. Colorectum önceden soğutulmuş Krebs çözüm ile dolu bir Petri kabına aktarın. Belgili tanımlık feces yavaşça iki nokta üst üste temizlenerek kaldırın. Kalan idrar kesesi ve diğer dokuların dikkatli bir şekilde, sayfa ödün vermeden çıkarın

4. Diseksiyon kolon Afferent sinir

  1. iki nokta üst üste kayıt odası (20 mL) yerleştirin ve doku carbogenated Krebs çözüm ile sürekli sıvı. Set perfüzyon oranı 15 mL/dak.
  2. Her iki ucunda oral ve anal colorectum cannulate. 10 mL/h oral anal yönüne oranında salin ile iki nokta üst üste intraluminal infüzyonu başlatın.
  3. Büyük PG diseksiyon mikroskop altında bulun. Böcek pimleri ganglion ortaya çıkarmak için kullanın. Dikkatli diseksiyon ile sinir gangliyon yayılan ve iki nokta üst üste doğru ( şekil 1) çalışan iyi bir dalı bulmak. Sinir gangliyon yakın kesti.
    Not: Resim 1 PG distal bir sinir dallara bir kayıt gösterir. Sinir muhtemelen pelvik ve Lomber splanchnic afferent lifler karışımı içerir. Alternatif olarak, bir kayıt PN ve/veya sayfa için proksimal SSN yapılabilir
  4. Isıtma banyo ve sıcak 34 ± 0,5 ° c oda sıcaklığında tutmak için Krebs çözüm açmak

5. Emme elektrodu hazırlanması

  1. önceden çekti cam pipet (Adım 2) almak ve diseksiyon mikroskop altında incelemek. Kaydedilmek üzere sinir çapı ile uyumlu bir büyüklükte olduğu elektrot ucunu forseps bir çift ile break.
  2. Daha hafif bir parlama yakın yerleştirerek uç eğim.

6. Elektrofizyolojik kayıt

  1. Bağlan eğimli elektrot elektrot tutucu için. Yan bağlantı noktasına tutucu elektrot için negatif veya pozitif basınç uygulamak için bir 10 mL şırınga takın.
  2. Sahibi bioamplifier headstage için bağlanmak ve headstage bir manipülatör üzerine monte edin.
  3. Elektrot doku Kaplıcalar'a hareket ve elektrot sahibinin gümüş tel bağlantı kurduğunda kadar nazik emiş uygulayarak Krebs çözüm ile doldurun. Elektrot uç sinir kesme sonuna yakın koyun ve elektrot sinir emmeye negatif basınç uygulayın. Sinirin ~ 1 mm elektrot çekti ve sıkı bir mühür formları daha negatif basınç uygulamak.
  4. Dönüş bioamplifier ve küme filtre için 300-3.000 Hz. osiloskop üzerinde sinyal izlemek ve sinir sinyal (20 kHz örnekleme hızı) ve bir bilgisayar ile bir spike veri işleme kullanarak intraluminal basınç sinyal (100 Hz örnekleme hızı) kayıt yazılım.

7. Kolon Afferent duyarlılık test

  1. Uygula rampa distansiyonu sürekli intraluminally beslerken ise çıkış kanül üç yönlü mekândaki kapatarak kolon. Bu üç yollu musluk boşaltma kanül üstünde hangi zamanda açık 60 mmHg, ulaşıncaya kadar intraluminal basınç izlemek.
  2. 15 dk. Uygula uyuşturucu ilave - veya intraluminally afferent sinirlerin kimyasal duyarlılık test etmek için düzenli aralıklarla bu yordamı yineleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 bir sinir distal PG için kayıt bir temsilci ile ex vivo "tüp" colorectum hazırlık için deneysel kurulumunun şematik çizimde olduğu Sinir muhtemelen pelvik ve bel splanchnic afferents karışımı yer. Normal sıçanlar üzerinden hazırlıkları içinde kolon afferent sinirlerin genellikle düzensiz spontan aktivite düşük düzeyde var. Rampa distansiyonu kolon ateş oranı (şekil 1B) kademeli bir artış neden olmaktadır. Her sin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan sıçan kolon afferents Elektrofizyolojik özelliklerini değerlendirmek için nispeten basit bir deneysel yöntem protokolüdür. İletişim kuralından (doku diseksiyon) kadar sinir kayıt ayarı genellikle tamamlamak için yaklaşık 2 saat sürer. Doku toplama (Adım 3) ve emme elektrot (5. adım) hazırlanması önemli adımlardır. PG, SSN ve PN bulun ve sinirler ve sinir dokusu diseksiyon sırasında zarar vermemeye dikkat çekmek için önemlidir. Cam pipet ucu kırık ve sinir paket ile uyumlu bir boyuta eğimli gerekir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı araştırma hibe Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (#31171066, #81270464) ve Sino-Alman bilim merkezi (GZ919) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sodyum PentobarbitalŞangay Westang Bio-TechB558
KapsaisinSigmaM2028
Elektrot çektirmeMicroData Instrument IncPMP107
Nörolog Sistemi (Biyoamplifikatör)Digitimer, LtdNeurolog Sistemi
A / D dönüştürücüCambridge Elektronik TasarımMicro1401
Veri işleme yazılımıCambridge Electronic DesignSpike2 sürüm 6
Gümüş telWorld Precision InstrumentsEP12
Cam tüplerWorld Precision Instruments1B150-4
Elektrot tutucuWorld Precision InstrumentsMEH3SBW
Isıtma banyosuGrantGR150
Diseksiyon mikroskobuLeicaZoom2000
Diseksiyon mikroskobuDünya Hassas AletlerPZMIII-BS
Çakmakherhangi birNA
Cerrahi aletlerDünya Hassas AletlerNA
Böcek pimleri0,1 mm paslanmaz çelik telden ev yapımıNA
Üç manipülatörDünya Hassas AletlerKITF-R
SıçanlarHerhangi birNAHerhangi bir suş / cinsiyet kullanılabilir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
  2. Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
  3. Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
  4. Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
  5. Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
  6. Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
  7. Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
  8. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
  9. Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
  10. Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
  11. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310(2015).
  12. Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
  13. Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
  14. Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
  15. Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  16. La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
  17. Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pelvik Gangliyon DiseksiyonuSinir Vakumlama ElektroduKolonik DistansiyonTemel Bile en AnaliziMekanosensoriyel AktiviteKimyasal Hassasiyet TestiBiyo Amplifikat r Kayd

İlgili makaleler