Yöntem makalesi

Üretim, kristalizasyon ve insan IKK1/α yapı belirlenmesi için bir rehber

DOI:

10.3791/56091

⸱

2 Kasım 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IκB kinaz 1/α (IKK1/α CHUK) hücresel etkinliklerle öncelikle NF-κB transkripsiyon faktörleri aktivasyonu sayısız ilgilenmektedir Ser/Thr protein kinaz olduğunu. Burada, üretim ve kristal yapısı bu protein tayini için gerekli ana adımları açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir sınıf hücre dışı uyaranların bir NF-κB alt birimi, p52, onun öncü p100 işlenmesi yoluyla nesil ikna etmek için IKK1/α aktivasyonu gerektirir. bir homodimer veya başka bir NF-κB alt birimi, RelB ile heterodimerdir P52 görür. Bu dimer sırayla genler inflamasyon, hücre hayatta kalma ve hücre döngüsü dahil yüzlerce ifade düzenler. IKK1/α öncelikle üçlü bir kompleks olarak IKK2/β ve NEMO ile ilişkili olarak kalır. Ancak, küçük bir havuz da düşük molekül ağırlıklı complex(es) görülmektedir. Bilinmeyen mi p100 işleme faaliyet IKK1/α aktivasyonu içinde daha büyük veya daha küçük karmaşık havuzu tarafından tetiklenir. IKK1/α bünye faaliyet çeşitli kanserler ve inflamatuar hastalıklarda algılandı. IKK1/α aktivasyonu mekanizmasını anlamak ve bir uyuşturucu hedef olarak kullanılmasını etkinleştirmek için biz rekombinant IKK1/α E. coligibi farklı ana bilgisayar sistemleri ifade böcek ve memeli hücreleri. Biz başarılı çözünür IKK1/α baculovirus içinde ifade son derece saf protein miktarda mg alma, huzurunda inhibitörleri crystallizing ve x-ışını kristal yapısını belirleme böcek hücreleri enfekte. Burada, Rekombinant protein, onun kristalizasyon ve onun x-ışını kristal yapısı belirlenmesi üretmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyon dimerik transkripsiyon faktörleri NF-κB ailesinin faaliyetlerinin inflamasyon ve bağışıklık yaşam ve ölüm arasında değişen çeşitli hücresel fonksiyonları için gereklidir. Bu etkinlikler hücrelerinde ve otoimmün hastalıklar ve kanser1,2,3dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullar yönetmelik yol açar bir kayıp sıkı kontrol edilir. Bir uyarıcı yokluğunda, NF-κB faaliyetlerinin IκB (inhibitörü - κB olan) proteinler4tarafından Inhibe tutulur. IκB protein üzerinde belirli Ser kalıntılarının fosforilasyon bunları ubiquitination ve sonraki proteasomal bozulma ya da seçici işleme5için işaretler. İki son derece homolog Ser/Thr kinaz, IKK2/β ve IKK1/α, NF-κB aktiviteleri merkezi düzenleyiciler Bu fosforilasyon olaylar6,7taşıyarak hareket.

Bir ligand ve bir reseptör arasındaki etkileşimler arabulucu NF-κB faktörleri harekete geçirmek için önde gelen bir dizi sinyal transduces. NF-κB sinyal verme işlemi genel olarak iki farklı yolları-kurallı ve kanonik olmayan (alternatif)8sınıflandırılabilir. IKK2/β etkinliği öncelikle iltihaplı ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı9için esastır kurallı yolun NF-κB sinyal düzenlemektedir. IKK2/β10 içinde şimdiye kadar biyokimyasal olarak uncharacterized IKK karmaşık bir hızlı ve kısa ömürlü aktivasyon ayrı özelliğidir bu yolu — IKK1 ve IKK2 yanı sıra düzenleyici bir bileşeni, NEMO (NF-κB temel modülatör oluşan olduğu tahmin )11,12,13. İki katalitik IKK alt birimleri IKK kompleks arasında IKK2 için NF-κB ve aynı zamanda atipik bir IκB protein bağlı öncelikle sorumlu14 için prototip IκBs (α, - β ve - γ) belirli kalıntılarının fosforilasyon olduğunu NF-κB1/olan p105, bir NF-κB p50 alt birim5habercisi. Fosforilasyon ubiquitination indüklenen ve proteasomal bozulma IκB (veya p105 işlenmesi), yayın ve NF-κB dimer15belirli bir kümesi aktivasyonu yol açar. Anormal NF-κB etkinliği IKK2 yanlış düzenlenmiş fonksiyonu nedeniyle birçok kanserleri de olduğu gibi otoimmün hastalıklar2,3,16gözlenmiştir.

IKK2/β aksine, temel geliştirme ve dokunulmazlık için kanonik olmayan yolun NF-κB sinyal IKK1/α etkinlik düzenlemektedir. IKK1 NF-κB2/p100 belirli artıkları, işleme ve p52 nesil yol açar, C-terminal IκBδ kesimindeki phosphorylates. Transcriptionally etkin p52:RelB heterodimerdir oluşumu gelişimsel sinyalleri7,17,18,19,20yavaş ve sürekli yanıt başlatır. İlginçtir, merkezi NF-κB faktör p52 döngüsünün bu nesil eleştirel bir başka faktör, NF-κB Inducing kinaz (NIK)21,22, ama değil IKK2 veya NEMO bağlıdır. Resting hücrelerde, NIK düzeyini nedeniyle onun sürekli proteasome bağlı bozulma23,24,25düşük seviyede kalır. Hücreleri tarafından 'kanonik olmayan' ligandlar ve bazı kötü huylu hücrelerin uyarılması, NIK ve IKK1 etkinleştirmek için stabilize olur / α. kinaz faaliyetleri NIK ve IKK1 verimli p100 p527içine işleme için gereklidir. IKK1 ve NIK işleme ve p52 üretimi için önde gelen onun C-terminal IκBδ kesimi üzerindeki üç serines (Ser866, 870 ve 872) NF-κB2/p100 fazdan. Kanonik olmayan aktivasyonu anormal multipl miyelom26,27,28de dahil olmak üzere birçok maligniteler karıştığı olmuştur.

Hiçbiri bu kadar etkili bir ilaç olduğunu kanıtladı, ancak birkaç son derece verimli ve belirli inhibitörleri IKK2/β için bilinir. Buna ek olarak, IKK1/α-özel inhibitörleri seyrek. Bu kısmen yapısal ve biyokimyasal bilgilerini NF-κB IKK1 hücreleri ve akılcı ilaç tasarım tarafından aktivasyonu mekanik temeli anlayışımız sınırlar IKK1/α üzerinde bizim eksikliği kaynaklanıyor. IKK2/β X-ray yapılarının IKK2/β29etkinleştirme mekanizması anlayışlar sağladı; Ancak, bu yapıların ne kadar farklı ters yönde uyaranlara açığa olabilir değil tetiklemek harekete geçirmek IKK1/α veya IKK2/β NF-κB faaliyetleri 30,31farklı kümeleri düzenleyecek. IKK1/α farklı sinyal verme işlevi temel mekanik olarak anlamak ve akılcı ilaç tasarımı için bir platform oluşturmak için IKK1/α yapısını belirleme üzerinde duruldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. rekombinant virüs IKK1/α büyük ölçekli ifade için uygun hazırlanması

  1. P1 virüs hazırlık 32
    1. 1. gün: Plaka Sf9 hücreleri (~ 6 10 X5) (geçiş sayısı az 10) 2 ml Sf900 III böcek cep orta her iyi bir 6-şey tabak ve 27 ° C'de kuluçkaya Geçiş hücreleri mL süspansiyon başına 2-3 X 106 hücre yoğunluğu ~ 6 X 10 yoğunluğu, taze medya içine sulandrarak ulaştığınızda5.
    2. 2. gün: Sf9-transfection reaktif Sf900 III veya Grace'in böcek orta antibiyotik ve serum olmadan 100 µL içinde 8 µL sulandırmak. Girdap kısaca.
    3. Rekombinant bacmid kit saf (ayrıntılar sağlanır 'Temsilcisi sonuçlarında') 1 µg seyreltik32 aynı ortamda ayrı bir tüp başka bir 100 µL içine.
    4. Seyreltilmiş DNA ve transfection reaktifi (Toplam hacim ~ 210-220 μL) birleştirin ve 15-30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    5. Orta kuyudan çıkarın. Antibiyotik ve serum olmadan taze orta 1 mL ekleyin.
    6. Seyreltilmiş DNA-transfection reaktif karışımı dropwise hücreleri üzerine ekleyin. Öyle ki yapışık hücreleri çıkarmak değil damla boyutunu ayarlayın.
    7. ~ 6 h sonra 1,5 mL taze orta üst eklemek veya orta kaldırmak ve taze Orta 2.5 mL ekleyin. 25-27 ° C sıcak taze orta ek önce.
    8. 27 ° C'de hücreler kuluçkaya Kuyu her ~ 12 h viral enfeksiyon belirtileri için düzenli olarak kontrol edin. Tüm Sf9 bakım ve ifade 27 ° C'de yürütmek
    9. 5. gün: hücreleri 60-72 h sonrası enfeksiyon içeren orta al. 500 g ve 4 ° c x 5 dk santrifüj Süpernatant kaydedin; P1-virüs hisse senedi bu. Küçük aliquots-80 ° C'de dondurmak
  2. P1 virüs klon ifade etmek belgili tanımlık en iyi seçme.
    1. 1.1. adımda açıklandığı gibi benzer şekilde plaka hücreleri.
    2. Kaplama, sonraki gün veya ~ 6 h mesaj farklı wells 20 µL ve 50 µL stoklarının farklı P1 virüs klon hücreleri üzerine ekleyin.
    3. Nazik pipetting tarafından yapışık hücreleri çıkarmak ve 500 g ve 4 ° c x 5 min için centrifuging tarafından enfekte hücreleri 60-72 h sonrası enfeksiyon hasat Süpernatant kaydedin. P2 virüs stok bu. Küçük aliquots-80 ° C'de stokunun depolamak
    4. 2 x Laemmli SDS arabelleği 100 µL hasat hücre Pelet ekleyin. Isı > 95 ° C 10 dk santrifüj için (genellikle 10.000 > x g) 5 min için.
    5. Alt jel boya açık ulaşır kadar 10-15 µL her örneğinin % 8-10 SDS-sayfa 120-160 V, çalıştırın.
    6. Elektro-devret Standart Yarı kuru tarafından çözümlenen proteinler aktarım iletişim kuralı (20 V, 30-45 dk) nitroselüloz/PVDF membran üzerinde.
    7. Leke ile anti-IKK1 antikor (seyreltme ~ 1:2, 000, optimize edilmiş olması gerekir) veya anti-PentaHis antikor (seyreltme ~ 1:3, 000, optimize edilmiş olması gerekir) ifade için.
    8. En iyi P1 virüs klon rekombinant IKK1 ifade karşılaştırarak seçin.
  3. Büyük ölçekli P3 virüs stok hazırlanması.
    1. 25-30 mL Sf900 III orta içeren bir 15 cm tabak 1.1 adımda açıklandığı gibi benzer şekilde plaka hücreleri.
    2. ~ 6 h kaplama sonrası, 150-300 µL hücreleri üzerine en çok ifade P1 virüs stokunun ekleyin.
    3. 72 saat sonra enfeksiyon sonrası, uygun tüp (steril) plaka dikkatle ortamından Aspire edin ve Tüp, 500-1000 X g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Eğer (bir oluşur) hücre Pelet atmak ve süpernatant kaydetmek. P3 virüs stok bu.
  4. Büyük ölçekli protein ifade için en iyi virüs titre belirleme
    1. Plaka hücrelerde 1.1, bir 6-şey tabak içinde açıklandığı gibi Sf900 III orta, 2 mL.
    2. 20, 30, 40 ve 50 µL virüs stok ayrı ~ 6 h sonrası kaplama kuyuları P3 ekleyin. Hastalık bulaşmamış tek bir denetim içerir.
    3. Her iyi 48-60 h sonrası enfeksiyon hücrelerden hasat.
    4. 2 X Laemmli SDS arabelleği 100 µL ekleyin. Isı > 95 ° C 10 dk. 5 min için (genellikle, 14.000 x g) santrifüj için.
    5. 10-15 µL % 8-10 SDS-sayfa jel içinde her örneğinin gidermek.
    6. Çözülmüş protein 1.2.6 içinde belirtildiği gibi bir nitroselüloz/PVDF membran aktarın.
    7. Leke ile anti-IKK1 antikor (seyreltme ~ 1:2000, optimize edilebilir) veya anti-PentaHis antikor (seyreltme ~ 1:3000, optimize edilebilir).
    8. Titre büyük ölçekli ifadeler için ifade en iyi virüs kullanın.

2. büyük ölçekli ifade 6 x-O'nun insan IKK129,33 öğesini

  1. Büyük ölçekli ifade bir süspansiyon kültürü yerine getirir. Bir 2 L Erlenmeyer şişesi Bacalı kapaklı bir ortamda Sf900 III 1 litre hücreleri bölün. Hücre yoğunluğu ~ 5 x 105 hücre/mL olması gerekir.
  2. Bu hücreler bir shaker 27 ° c ~ 100 rpm'de süspansiyon ~ 2 gün 1-2 x 106/mL bir yoğunluğuna ulaşır kadar büyür. Hücre yoğunluğu 2 x 106/mL aşmamalıdır.
  3. P3 virüs, istenilen miktarda 1.4 içinde değerlendirilen gibi ekleyin.
  4. 48-60 h ~ 100 rpm bir shaker 27 ° C'de için virüslü kültür büyümek.
  5. Santrifüjü tarafından hücre hasat < 1.500 x g 4 ° C'de
  6. Hücre Pelet kaydetmek ve orta atın.
  7. Protein arıtma için doğrudan devam edin. Flaş sıvı azot ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de store hücre Pelet dondur.

3. IKK1 O'nun33 saflaştırılması

  1. Gün 1, hücre Pelet lizis arabellek 40 mL resuspend (25 mM Tris pH 8.0, % 0,2 NP-40, 200 mM NaCl, 10 mM imidazole, %10 gliserol, 5 mM β-mercaptoethanol ve proteaz inhibitörü kokteyl).
    Not: Islak Cep Pelet kitle tespit. Genellikle, ~ 2 L kültürünün bu adım için kullanıldı.
  2. % 60-70 görev döngüsü, 30 s süre 5-10 Bakliyat, zaman aralığı sırasında sonication tarafından hücreleri parçalayıcı > hücre süspansiyon tutmak 1dk buzda soğutulmuş.
    Not: Optimizasyon sonicator her modeli ile bu adımı gerektirir. Örnek 10 ° c üzerinde ısınmak izin vermeyin
  3. Santrifüjü ≥ 28.000 x g 4 ° C'de 45 dk için de tarafından lysate açıklamak
  4. 4 üreticinin protokol sonrası mL Ni-NTA özel reçine ile lizis tampon ve mix açıklık lysate (süpernatant) equilibrate.
  5. 4 ° C oda döner bir karıştırıcı 2 h için kuluçka tarafından reçine bağlamak protein sağlar.
  6. Reçine içeren 30 mM imidazole lizis arabellek ile iyice yıkayın. Bradford tahlil kullanarak periyodik yıkama kesir protein konsantrasyonu kontrol edin. Bu protein konsantrasyonu yıkama kesir 0.1 mg/mL ulaşıncaya kadar yıkayın. Genellikle > 20 yatak yıkama arabellek hacmi bu noktaya ulaşmak için gereklidir.
  7. O'nun öğesini IKK1/α protein 20 mL elüsyon arabelleği (250 mM imidazole içeren lizis arabellek) kullanarak yerçekimi akışı altında elute. 1-1.5 mL kesirleri toplamak.
  8. Bir 8 veya % 10 SDS sayfa jel eluted protein saflığı tüm kesirler ile Laemmli tampon karışık üzerinden 5-10 μL örnek yükleyerek kontrol edin.
  9. Tepe kesirler (konsantrasyon ≥ 2 mg/mL) havuz ve protein konsantrasyonu Bradford tahlil kullanarak ölçün.
  10. TEV (1:30-50 (TEV proteaz: IKK1)) proteaz gecede (≥12 s) 4 ° C'de ile sindirmek
    Not: TEV proteaz için gerekli miktarı Optimize (≥ % 95) sindirim bir temanın6 X-O'nun etiketi tamamlamak. TEV proteaz içinde ev saflaştırıldı.
  11. 2. gün sabahı, protein 1 mM ATP huzurunda 20 mM MgCl2, 20 mM β-gliserofosfat, 10 mM NaF ve 1 mM sodyum orthovanadate 27 ° C'de 1 h için kuluçkaya
  12. Protein çözüm ile 0,45 veya 0,22 mikron filtre.
  13. 6 mL örnek bir otomatik sıvı kromatografi sisteme bağlı ~ 120 mL partiye hazırlık boyutu-dışlama sütuna yerleştirin. Arabellek A sütununda equilibrate (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, % 5 gliserol), protein örnek uygulamadan önce.
    Not: Daha küçük bir sütun Ni-NTA benzeşme arıtma adımdan sonra protein verim bağlı olarak kullanılabilir. Ayarlamak/sütun hacmi %5 için yük hacmi hesaplamak).
  14. Boyut-dışlama Kromatografi 1 mL/dk debi çalıştırın ve 280 ve 254 nm, elüsyon izleme. Kesirler 2 mL boyutta toplamak.
  15. Tepe kesirler saflığı kontrol (genellikle çevresinde ~ 60-70 mL) bir % 8-10 SDS-sayfa jel üzerinde.
  16. Saf kesirler (≥0.5 mg/mL bir konsantrasyon ile saflık ≥95%) havuz ve konsantre bir 10 kDa veya 30 kDa molekül ağırlığı kesme santrifüj protein yoğunlaştırıcı üreticinin yönergeleri izleyin.
  17. Düzenli olarak protein konsantrasyonu konsantre Bradford yöntemi tarafından kontrol ve örnek 8-12 mg/mL kadar konsantre.
  18. 25 μL aliquots ve sıvı azot flaş dondurma dağıtmak. Bu flaş Donmuş numuneler-80 ° C dondurucuda saklayın.

4. ekran IKK1 durumunu kristalizasyon için

  1. Aşağıda açıklanan yöntemleri takip kristalleri için ekran için gerekli protein (cilt tarafından) toplam tutarını hesaplar.
  2. Farklı inhibitörleri deneyin (genel kinaz inhibitörleri: AMPPNP ve Staurosporine; IKK-specific inhibitörleri: MLN120B, bileşik A ve IKK-inhibitörü XII) kristalizasyon için tarama gerçekleştirmek için. Üreticinin yönergelerini izleyerek bu bileşiklerin hisse senedi çözümler olun. Bahçedeki hisse senedi çözümünün içinde maksimum konsantrasyon 20 mikron aşmaz olun.
  3. Karmaşık IKK:inhibitor IKK1 karıştırma 100 mikron 200 mikron inhibitörü ile kristalizasyon ekran için hazırlayın ve 30-40 dk santrifüj kapasitesi için bu karisimin 18-20 ° C'de kuluçkaya > Oda sıcaklığında 2 dak için 15.000 x g. Süpernatant kristalizasyon ekran için kaydedin.
  4. (Bkz. Tablo reçetesi) ticari olarak mevcut kristalizasyon ekranlarını kullanın.
  5. Her kristalizasyon reaktif (rezervuar çözümleri), 80-100 μL bir çok kanallı pipet veya bir robot, bir 96-şey plaka göle kullanarak pipette. Plaka şimdi damla kadar ayarlamak hazırdır. Böylece 2-3 inhibitörleri tek bir tabak içinde ekranlı plaka 2-3 kristalizasyon damla barındırır emin olun.
  6. Kristalizasyon robot kullanarak, dağıtmak ve 0,2-0,25 mix IKK1:inhibitor karmaşık μL rezervuar çözüm aynı hacmi ile.
    Not: Tarama daha büyük damla birimleri kullanarak el ile gerçekleştirilen (0.5-1.0 IKK1:inhibitor karmaşık μL rezervuar çözüm aynı hacmi ile). Ancak, bir robot kullanımı değerli reaktifler yardımcı olacaktır.
  7. Hemen buharlaşma önlemek için optik net filmleri ile damla ayarladıktan sonra plakalarının. Düzgün uygun aplikatör kullanarak kapatın. Yineleme plakaları her inhibitörü kümesi için yapmak. 18 ° C ve diğer soğuk oda (sıcaklık aralığı ~ 4-6 ° C) bir tabak kuluçkaya. İnkübatörler titreşim tarafından etkilenmez emin olun.
  8. Bir stereomicroscope bir polarize ile görünüm içinde her damla kristallerinin her gün ilk yedi gün boyunca ve daha sonra daha uzun aralıklarla denetlemek için kullanın. Sistematik olarak unutmayın ve bu gözlemler atabilirsin.
    Not: büyüme ekranlarda kristaller bulunan görsel olarak değerlendirilebilir böylece bir polarize ile bir stereomicroscope kullanın. Burada, kristaller bir durumda rezervuar çözüm %3 w/v Dextran sülfat sodyum tuzu Mr 5.000, 0.1 M bulunduğu BICINE pH 8,5, % 15 w/v Polietilen glikol 20.000 ortaya çıktı. IKK1 kristalleri sadece IKK-inhibitörü XII huzurunda büyüdü.

5. kristal büyüme optimizasyonu29,33

  1. Hisse senedi çözümleri hazırlanması.
    1. Farklı molekül ağırlığı (ortalama MW 5.000, 8.000, 15.000, 40.000 Da) deiyonize H20,22 mikron filtre kullanma O. filtre çözüm Dextran sülfat % 30 w/v çözümleri hazırlayın.
    2. 1 M veya 0,5 M stokları 6.5-9 pH aralığında farklı arabellekleri hazırlayın. Çözümleri 0,22 mikron filtre kullanarak filtre.
    3. PEG çözümleri farklı molekül ağırlığının % 25 veya %50 (w/v) hazırlamak (ortalama MW:1000, 1500, 3.350, 4000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, 20.000 Da). Çözümleri 0,22 mikron filtre kullanarak filtre.
    4. Bir kılavuz ekran sistematik olarak pH, ara bellek türü, konsantrasyon ve PEG ve Dextran sülfat türünü değiştirerek gerçekleştirin.
  2. Tarama 18 ° C'de hem soğuk oda (sıcaklık aralığı ~ 4-6 ° C) en iyi duruma getirme.
  3. İyi çözüm ile karmaşık IKK1:Inhibitor eşit miktarda karıştırın ve kapalı bir ortamda iyi çözüm üzerine kuluçkaya. Bu adımı el ile yapılabilir veya bir dağıtım robot kullanarak.
    Not: Burada, aşağıdaki koşullar altında (Tekdüzen büyüme gösterilen polarize altında tek tip renk tarafından değerlendirildi gibi) büyük ve iyi tanımlanmış kristalleri elde edilmiştir: 100 mM BisTris pH 7,0, Dextran sülfat (ortalama MW 15 kDa), 8,5-%10 20 PEG 2.8-%3.5 kDa soğuk odada.

6. çok sayıda büyüyen kristalleri

  1. Aşağıdaki hisse senedi çözümleri hazırlamak ve onları 0,22 mikron filtre ile filtre.
    1. 0, 5 M BisTris pH 7,0 ve BisTris propan pH 7,0 ve 7,5 hazırlayın.
    2. %30 (w/v) Dextran sülfat (ortalama MW ~ 15 kDa) hazırlayın. 4 ° C'de mağaza
    3. % 50 hazırlamak PEG (ortalama MW ~ 12 kDa).
  2. Kullanım 24 iyi açılan tabak asılı.
  3. Dolgu macunu yağ her şey büyüdü Yüzüklerin uygulanır.
  4. En iyi çözüm (son konsantrasyonu) aşağıdaki gibi hazırlamak: 100 mM BisTris pH 7,0-7.5, 2.8-%3.5 Dextran sülfat ~ 15 kDa, % 8,5-10 ~ 12 kDa PEG. 1 mL iyi çözüm 1.5 mL tüpler hazır olun.
    Not: Kristalizasyon durumda küçük bir varyasyon protein ve/veya Dextran sülfat dizi bağlı olarak gözlendi, böylece a duruşma-in dar aralığı önerilir. BisTris ve BisTris aynı pH aralığı propan arabellek verim tek kristalleri.
  5. İyi çözümleri ve yağlanmış plakalar en az 1 h için soğuk oda tutun.
  6. IKK1:Inhibitor 4,3 açıklandığı gibi karmaşık hazırlayın. En iyi çözümleri 1,5 mL tüpler için 24 iyi plaka wells bireysel aktarın.
  7. Temiz silikonlu (ticari veya şirket içi (siliconization/silanization)) cam kapak hav bırakmayan mendil kullanarak paket fişi ve kesin olarak belirlemiş basınçlı hava modeller piyasada mevcut aerosol toz bezi kullanarak uygulayabilirsiniz.
  8. 1 – 1,5 μL iyi çözüm bir temiz kapak fişinde yer. Pipet eşit IKK1:inhibitor karmaşık hacmi, mix yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından 3 - 4 kez. Cam kapak notu açmak ve de forseps ile ilgili yerleştirin ve kuyu üzerinde yağ basarak kapatın.
  9. 24-şey plaka tüm damlaları ayarladıktan sonra soğuk oda karanlıkta plaka kuluçkaya. Zaman zaman damla bir mikroskop görünüm ve büyüme kristallerinin altında kontrol edin.
    Not: kristal plakaları ışığı altında kuluçka sonucunu değiştirecek olup olmadığını bu test edilmemiştir. Bu, ancak, tabakları en düşük/Hayır titreşim olan bir ortamda inkübe önemlidir.

7. Cryo koruma kristaller

  1. Cryo çözümleri hazırlanması.
    1. Cryo A hazırlamak (~ %2 Dextran sülfat, ~ %10 PEG 12000, 60 mM BisTris propan (Toplam aynı pH amaçlanan iyi çözüm olarak), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, % 2.5 gliserol).
    2. Cryo B hazırlamak (~0.3% Dextran sülfat, ~ %10 PEG 12000, 60 mM BisTris propan (Toplam aynı pH amaçlanan iyi çözüm olarak), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 20 veya % 25 gliserol veya 20 veya % 25 etilen glikol).
      Not: farklı cryo-protectants gliserol ve etilen glikol (Örneğin, PEG 200, 400 PEG, MME 550 PEG, PEG 1000) ek olarak sınayın.
  2. Yavaşça cam kapak kristal içeren notu çıkarın ve yukarı bakacak şekilde kristal damla ile sağlam bir yüzeye yerleştirin. Yavaşça 10 μL Cryo bir çözüm üstünde tepe-in belgili tanımlık damla ekleyin ve karışımı yavaşça böylece kristal dokundu pipetting tarafından.
    Not: Bu enkaz kristal yüzeyini temizler ve ilk soğuk arabellek ile kristal equilibrate yardımcı olur. Kristal için mekanik ve termal stres kaçının. Kristal için herhangi bir zarar görmemesi için mikroskop altında sonraki adımları uygulayın.
  3. Yavaş yavaş bazı sıvı kristal kaldırın ve hakkında tutun 5-8 μL çözüm. Kristalin kurutma önlemek. Mekanik stres ve kristal sonraki adımda susuzluktan önlemek için aşırı dikkatli.
  4. Yavaşça, karışımı çok yavaşça pipetting tarafından 2.5-4 μL Cryo B çözüm üzerine damla ekleyin. Kristal üzerinde doğrudan hava akışı önlemek için küçük bir petri kapak. 5 dk. için beklemek her zaman kristal hızlı değişiklikler ozmotik basınç ya da su kaybı acı değil dikkatli olun.
  5. Adımı yineleyin 7,4 kristal cryo çözüm içine yavaş yavaş parkenizin için dört kez.
  6. 10-20 μL cryo çözümün bu aşamada tutmak (yani, yaklaşık 20-25 %'i banyo kristal izin cryo-koruyucu içeren çözüm). Farklı bir süre için (5 dk 1 h) son cryo-çözüm içinde bekletin.
  7. Birden çok kristalleri farklı zaman noktalarda dondur.
  8. Dikkatli bir şekilde uygun Bankası ve dalma-sıvı N2dondurucuda monte uygun bir soguk döngü içinde açılan tek bir kristal seç. Sorunsuz ve hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirmeniz Kristal buz oluşumunu önlemek için.
    Not: kullanılan Gelişmiş foton kaynak, Argonne Ulusal Laboratuvarı Robot Gonyometre içinde monte edilebilir kristal en uzun eksen biraz daha büyük bir döngü çapı kullanarak kristal seç.
  9. Cryo-döngüler içinde sıvı N2' batırma adam içeren kristal saklayın. Kadar sinkrotron, x-ışını kırınımı için sevkiyat için hazır bu adam sıvı N2 ' Dewar flask saklayın. X-ışını kırınım veri toplama ve (Bölüm 8 ve 9) işleme devam edin.
    Not: her ne kadar sinkrotron taranması için kristalleri kalitesini belirtilen kırınım veriler ev x-ışını kaynaklarından IKK1 kristallerinin yapı belirlenmesi denemeler için yeterince yüksek çözünürlük değildi. Tüm kırınım veri önceden foton kaynak, Argonne Ulusal Laboratuvarı, ABD farklı beamlines (öncelikle 19ID) toplanmıştır.

8. x-ışını veri toplama

  1. Uzak veri toplama yazılımı34kullanarak APS sinkrotron kaynak ID19 beamline x-ışını kırınım veri toplamak.
    Not: yukarı 100 kristal kırınım özellikleri için test edildi. Kristalleri rutin olarak 7-11 Å, nadiren çözünürlük için 5 diffracted kristalleri diffracted Å 4.5 diffracted gözlenen ve tek bir büyük kristal vardı Å. Bu yana kristalleri hızla veri koleksiyon sırasında çürüdü, veri kümeleri, farklı kısımlarını aynı kristal toplanmıştır. Kristalleri büyük olduğundan bu mümkündü (400 µm daha büyük), ve kullanılan ışın çapı 100 µm yapıldı.

9. x-ışını veri işleme

  1. Aynı kristal34farklı yerlerinden toplanan tüm veri kümeleri birleştirme.
    Not: yedi veri kümeleri en iyi kristal birleştirildi ve sonuç veri %93 tamamlanmış oldu. Genel ben / σ ~ 6,8) ve Rmerge (5.4-4.5 Å) en yüksek çözünürlük Kutusu'ndaki % 89.
  2. İşlem veri kümeleri ile alan grup, birim hücre boyutları, solvent içerik ve asimetrik biriminin makul kompozisyon elde etmek için HKL200034 .

10. yapı çözüm

  1. Arama modelleri hazırlanması
    1. Mevcut yapısal hIKK2 modellerde dayalı (pdb kimliği 4E3C ve 4KIK35), dimer bir dizi farklı yönelimleri N-terminal KD ile oluşturmak (Bu bir açılış 30 ve 62 işler Å, iki KD dimer P578 arasında). Bu modellerin hiçbiri çok çalışmadan sonra bir moleküler yerine arama çözüm getirdi.
    2. IKK1 haritası tek-parçacık cryo-EM veri33oluşturur.
    3. İnsan IKK1 bir model IKK2 en yüksek çözünürlük yapısından oluşturmak (pdb kimliği 4KIK).
    4. Bireysel etki alanları insan IKK1 modelinin COOT36kullanarak cryo EM yoğunluğu Haritası insan IKK1 yerleştirin. Bu KD yönlendirme yaklaşık 24 derece döndürülmüş ve 58 ~ Å açılış N-terminal değiştirilebilir.
    5. Cryo-EM ile donatılmış modeli (monomer) KD yönünü 10.1.1 son içinde oluşturulan tüm dimer uygulanır.
  2. Moleküler değiştirme
    1. Dimer 10.1.1 son ve 10.1.5 arama modellerinde programları fazer37, MOLREP38 ve CNS39,40olarak kullanın.
      Not: Burada, bir dimer 10.1.5 (52 Å açılış)--dan a arama model olarak kullanarak, altı dimer (iki hexamers) asimetrik biriminde MOLREP kullanarak bulunmaktaydı. Arama modelinde açılış 52 Å zarif yapısı dimer (tüm altı dimer) 49-50 Å açılış benzer.

11. yapısı arıtma

  1. Yapısı arıtma yordamı
    1. Oryantasyon ve bu ilk model konumunu CNS (cns_solve_1.3)39,40katı vücut arıtma sabitleyin.
    2. Daha fazla pykał ve maksimum olabilirlik hedef işlevi ve bir daire toplu solvent düzeltmesi CNS sistem39,40kullanarak simule edilmiş tavlama kullanarak yapısı rafine.
    3. 2FO-FC temel model oluşturmak ve Fo-Fc Xtalview41kullanarak eşler.
      Not: DEN destekli arıtma42 geçerli ve NCS model daha iyi doğruluk için ayrıntılandırmaları sırasında dizginlemek. Nitekim, DEN arıtma önemli ölçüde geometrileri ve R-faktör yapısı, geliştirmek ve R faktörü %22,2 ve ücretsiz R faktörü %27,8 son modelinde için oldu. R ücretsiz dramatik gelişme nedeniyle yüksek doğruluk modeli IKK2 modeli (4KIK) oluşturulan IKK1 etki alanlarının olması gerekir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonlama ve ifade IKK1/α farklı yapıları
İnsan IKK1/α baculovirus ifade vektör pFastBacHTa bir N-terminal hexa-histidin elde etmek için onun EcoRI ve NotI kısıtlama siteleri içinde içine klonlanmış tam uzunlukta IKK1 etiketli. Etiketi TEV proteaz sindirim tarafından kaldırılmış olabilir. Tam uzunlukta IKK1/α her iki ucundaki esnek bölgeleri içeren ve esnek bölgeler genellikle bir protein kristalize zor render beri IKK1/α pFastBacHTa vektör yukarıda belirtilen siteler i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üretim, kristalizasyon ve yapı çözüm iki ilgili IKK proteinlerin
Biz IKK1/α X-ray kristal yapısı deneyimlerimiz IKK2/β protein üretim, kristalizasyon ve yapı belirlenmesi ile verilen nispeten basit bir egzersiz olacaktır kavramı ile belirlemek için yola çıktı. Ancak, biz bu iki ilgili proteinler kristalizasyon kolaylığı ile ilgili çok farklı davrandığını çok şaşırdık. Birkaç yüksek profilli laboratuvarları çabalarına rağmen yaklaşık yirmi IKK1 yapı tayini aldı. Bu büyük ölçüde birkaç anahtar performan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Personel beamlines 19ID, 24ID ve 13ID kaynağında Gelişmiş foton, Lemont, IL, çeşitli kristalleri veri toplama sırasında destek için teşekkür ediyoruz. Düşük çözünürlüklü cryo-EM harita EM harita/bina, ilk IKK1 moleküler yerine arama model oluşturmak için kullanılan modeli erken aşamalarında bize alma için Dmitry Lyumkis, Salk Enstitüsü için minnettarız. Bu sonuçlar için önde gelen araştırma gelen NIH hibe AI064326, CA141722 ve GM071862 GG için fon aldı. SP Şu anda bir hoş geldiniz güven DBT Hindistan ara biri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin artık üretilmiyor, yerini Cellfectin II
Sf900 III alıyor Böcek hücre ortamıThermo Fisher Scientific12658-027
SF9 hücreleriThermo Fisher Scientific12659017
anti-IKK1 antikoruNovus BiologicalsNB100-56704Daha önce Imgenex tarafından satılıyordu
anti-PentaHis antikoruQiagen34460
PVDF membranMilliporeIPVH00010Nitroselüloz da kullanılabilir
Ni-NTA agarozQiagen30210
Bradford tahlil reaktifiBioRad500001
Superdex 200 sütunGE Healthcare28989335
Amicon yoğunlaştırıcıMilliporeUFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Bileşik ABayer
Calbiochem IKK inhibitörü XIICalbiochem401491
StaurosporineSIGMAS4400
MLN120BMilleniumHediye öğesi
AMPPNPSIGMAA2647
Dekstran sülfatSIGMA51227, 42867, 31404,
Dekstran sülfatAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172Bazıları SIGMA kataloğunda yeni Cat #. Sahip olduğumuz şey aslen farklı Cat # olan Fluka'dandı.
Kristalizasyon Ekranları
Kristal Ekran I ve II (Kristal Ekran HT)Hampton ResearchHR2-130
İndeksi HTHampton ResearchHR2-134
PEG/İyon ve PEG/Ion2 (PEG/İyon HT)Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 ve PEGRx 2 (PEGRx HT)Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 ve SaltRx 2 (SaltRx HT)Hampton ResearchHR2-136
Kristal bağlarHampton ResearchHR8-188, 190, 192, 194
SynchrotronABD Enerji Bakanlığı'ndaki Gelişmiş Foton Kaynağı (APS) s Argonne Ulusal LaboratuvarıIşın Hattı 19 IDABD Enerji Bakanlığı'ndaki Gelişmiş Foton Kaynağı (APS) Argonne Ulusal Laboratuvarı, neredeyse tüm bilimsel disiplinlerde araştırma için ultra parlak, yüksek enerjili depolama halkası tarafından oluşturulan X-ışını ışınları sağlar.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

IKK1 AlphaProtein ExpressionInsect CellsBaculovirus SystemProtein PurificationSize Exclusion ChromatographyProtein CrystallizationX ray CrystallographyMolecular ReplacementStructure Determination

İlgili makaleler