Üretim, kristalizasyon ve insan IKK1/α yapı belirlenmesi için bir rehber

Transkripsiyon dimerik transkripsiyon faktörleri NF-κB ailesinin faaliyetlerinin inflamasyon ve bağışıklık yaşam ve ölüm arasında değişen çeşitli hücresel fonksiyonları için gereklidir. Bu etkinlikler hücrelerinde ve otoimmün hastalıklar ve kanser^1,2,3dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullar yönetmelik yol açar bir kayıp sıkı kontrol edilir. Bir uyarıcı yokluğunda, NF-κB faaliyetlerinin IκB (inhibitörü - κB olan) proteinler⁴tarafından Inhibe tutulur. IκB protein üzerinde belirli Ser kalıntılarının fosforilasyon bunları ubiquitination ve sonraki proteasomal bozulma ya da seçici işleme⁵için işaretler. İki son derece homolog Ser/Thr kinaz, IKK2/β ve IKK1/α, NF-κB aktiviteleri merkezi düzenleyiciler Bu fosforilasyon olaylar^6,7taşıyarak hareket.

Bir ligand ve bir reseptör arasındaki etkileşimler arabulucu NF-κB faktörleri harekete geçirmek için önde gelen bir dizi sinyal transduces. NF-κB sinyal verme işlemi genel olarak iki farklı yolları-kurallı ve kanonik olmayan (alternatif)⁸sınıflandırılabilir. IKK2/β etkinliği öncelikle iltihaplı ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı⁹için esastır kurallı yolun NF-κB sinyal düzenlemektedir. IKK2/β¹⁰ içinde şimdiye kadar biyokimyasal olarak uncharacterized IKK karmaşık bir hızlı ve kısa ömürlü aktivasyon ayrı özelliğidir bu yolu — IKK1 ve IKK2 yanı sıra düzenleyici bir bileşeni, NEMO (NF-κB temel modülatör oluşan olduğu tahmin )^11,12,13. İki katalitik IKK alt birimleri IKK kompleks arasında IKK2 için NF-κB ve aynı zamanda atipik bir IκB protein bağlı öncelikle sorumlu¹⁴ için prototip IκBs (α, - β ve - γ) belirli kalıntılarının fosforilasyon olduğunu NF-κB1/olan p105, bir NF-κB p50 alt birim⁵habercisi. Fosforilasyon ubiquitination indüklenen ve proteasomal bozulma IκB (veya p105 işlenmesi), yayın ve NF-κB dimer¹⁵belirli bir kümesi aktivasyonu yol açar. Anormal NF-κB etkinliği IKK2 yanlış düzenlenmiş fonksiyonu nedeniyle birçok kanserleri de olduğu gibi otoimmün hastalıklar^2,3,16gözlenmiştir.

IKK2/β aksine, temel geliştirme ve dokunulmazlık için kanonik olmayan yolun NF-κB sinyal IKK1/α etkinlik düzenlemektedir. IKK1 NF-κB2/p100 belirli artıkları, işleme ve p52 nesil yol açar, C-terminal IκBδ kesimindeki phosphorylates. Transcriptionally etkin p52:RelB heterodimerdir oluşumu gelişimsel sinyalleri^{7,17,18,19,20}yavaş ve sürekli yanıt başlatır. İlginçtir, merkezi NF-κB faktör p52 döngüsünün bu nesil eleştirel bir başka faktör, NF-κB Inducing kinaz (NIK)^21,22, ama değil IKK2 veya NEMO bağlıdır. Resting hücrelerde, NIK düzeyini nedeniyle onun sürekli proteasome bağlı bozulma^23,24,25düşük seviyede kalır. Hücreleri tarafından 'kanonik olmayan' ligandlar ve bazı kötü huylu hücrelerin uyarılması, NIK ve IKK1 etkinleştirmek için stabilize olur / α. kinaz faaliyetleri NIK ve IKK1 verimli p100 p52⁷içine işleme için gereklidir. IKK1 ve NIK işleme ve p52 üretimi için önde gelen onun C-terminal IκBδ kesimi üzerindeki üç serines (Ser866, 870 ve 872) NF-κB2/p100 fazdan. Kanonik olmayan aktivasyonu anormal multipl miyelom^26,27,28de dahil olmak üzere birçok maligniteler karıştığı olmuştur.

Hiçbiri bu kadar etkili bir ilaç olduğunu kanıtladı, ancak birkaç son derece verimli ve belirli inhibitörleri IKK2/β için bilinir. Buna ek olarak, IKK1/α-özel inhibitörleri seyrek. Bu kısmen yapısal ve biyokimyasal bilgilerini NF-κB IKK1 hücreleri ve akılcı ilaç tasarım tarafından aktivasyonu mekanik temeli anlayışımız sınırlar IKK1/α üzerinde bizim eksikliği kaynaklanıyor. IKK2/β X-ray yapılarının IKK2/β²⁹etkinleştirme mekanizması anlayışlar sağladı; Ancak, bu yapıların ne kadar farklı ters yönde uyaranlara açığa olabilir değil tetiklemek harekete geçirmek IKK1/α veya IKK2/β NF-κB faaliyetleri ^30,31farklı kümeleri düzenleyecek. IKK1/α farklı sinyal verme işlevi temel mekanik olarak anlamak ve akılcı ilaç tasarımı için bir platform oluşturmak için IKK1/α yapısını belirleme üzerinde duruldu.

1. rekombinant virüs IKK1/α büyük ölçekli ifade için uygun hazırlanması

1. P1 virüs hazırlık ³²
   1. 1. gün: Plaka Sf9 hücreleri (~ 6 10 X⁵) (geçiş sayısı az 10) 2 ml Sf900 III böcek cep orta her iyi bir 6-şey tabak ve 27 ° C'de kuluçkaya Geçiş hücreleri mL süspansiyon başına 2-3 X 10⁶ hücre yoğunluğu ~ 6 X 10 yoğunluğu, taze medya içine sulandrarak ulaştığınızda⁵.
   2. 2. gün: Sf9-transfection reaktif Sf900 III veya Grace'in böcek orta antibiyotik ve serum olmadan 100 µL içinde 8 µL sulandırmak. Girdap kısaca.
   3. Rekombinant bacmid kit saf (ayrıntılar sağlanır 'Temsilcisi sonuçlarında') 1 µg seyreltik³² aynı ortamda ayrı bir tüp başka bir 100 µL içine.
   4. Seyreltilmiş DNA ve transfection reaktifi (Toplam hacim ~ 210-220 μL) birleştirin ve 15-30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
   5. Orta kuyudan çıkarın. Antibiyotik ve serum olmadan taze orta 1 mL ekleyin.
   6. Seyreltilmiş DNA-transfection reaktif karışımı dropwise hücreleri üzerine ekleyin. Öyle ki yapışık hücreleri çıkarmak değil damla boyutunu ayarlayın.
   7. ~ 6 h sonra 1,5 mL taze orta üst eklemek veya orta kaldırmak ve taze Orta 2.5 mL ekleyin. 25-27 ° C sıcak taze orta ek önce.
   8. 27 ° C'de hücreler kuluçkaya Kuyu her ~ 12 h viral enfeksiyon belirtileri için düzenli olarak kontrol edin. Tüm Sf9 bakım ve ifade 27 ° C'de yürütmek
   9. 5. gün: hücreleri 60-72 h sonrası enfeksiyon içeren orta al. 500 g ve 4 ° c x 5 dk santrifüj Süpernatant kaydedin; P1-virüs hisse senedi bu. Küçük aliquots-80 ° C'de dondurmak
2. P1 virüs klon ifade etmek belgili tanımlık en iyi seçme.
   1. 1.1. adımda açıklandığı gibi benzer şekilde plaka hücreleri.
   2. Kaplama, sonraki gün veya ~ 6 h mesaj farklı wells 20 µL ve 50 µL stoklarının farklı P1 virüs klon hücreleri üzerine ekleyin.
   3. Nazik pipetting tarafından yapışık hücreleri çıkarmak ve 500 g ve 4 ° c x 5 min için centrifuging tarafından enfekte hücreleri 60-72 h sonrası enfeksiyon hasat Süpernatant kaydedin. P2 virüs stok bu. Küçük aliquots-80 ° C'de stokunun depolamak
   4. 2 x Laemmli SDS arabelleği 100 µL hasat hücre Pelet ekleyin. Isı > 95 ° C 10 dk santrifüj için (genellikle 10.000 > x g) 5 min için.
   5. Alt jel boya açık ulaşır kadar 10-15 µL her örneğinin % 8-10 SDS-sayfa 120-160 V, çalıştırın.
   6. Elektro-devret Standart Yarı kuru tarafından çözümlenen proteinler aktarım iletişim kuralı (20 V, 30-45 dk) nitroselüloz/PVDF membran üzerinde.
   7. Leke ile anti-IKK1 antikor (seyreltme ~ 1:2, 000, optimize edilmiş olması gerekir) veya anti-PentaHis antikor (seyreltme ~ 1:3, 000, optimize edilmiş olması gerekir) ifade için.
   8. En iyi P1 virüs klon rekombinant IKK1 ifade karşılaştırarak seçin.
3. Büyük ölçekli P3 virüs stok hazırlanması.
   1. 25-30 mL Sf900 III orta içeren bir 15 cm tabak 1.1 adımda açıklandığı gibi benzer şekilde plaka hücreleri.
   2. ~ 6 h kaplama sonrası, 150-300 µL hücreleri üzerine en çok ifade P1 virüs stokunun ekleyin.
   3. 72 saat sonra enfeksiyon sonrası, uygun tüp (steril) plaka dikkatle ortamından Aspire edin ve Tüp, 500-1000 X g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Eğer (bir oluşur) hücre Pelet atmak ve süpernatant kaydetmek. P3 virüs stok bu.
4. Büyük ölçekli protein ifade için en iyi virüs titre belirleme
   1. Plaka hücrelerde 1.1, bir 6-şey tabak içinde açıklandığı gibi Sf900 III orta, 2 mL.
   2. 20, 30, 40 ve 50 µL virüs stok ayrı ~ 6 h sonrası kaplama kuyuları P3 ekleyin. Hastalık bulaşmamış tek bir denetim içerir.
   3. Her iyi 48-60 h sonrası enfeksiyon hücrelerden hasat.
   4. 2 X Laemmli SDS arabelleği 100 µL ekleyin. Isı > 95 ° C 10 dk. 5 min için (genellikle, 14.000 x g) santrifüj için.
   5. 10-15 µL % 8-10 SDS-sayfa jel içinde her örneğinin gidermek.
   6. Çözülmüş protein 1.2.6 içinde belirtildiği gibi bir nitroselüloz/PVDF membran aktarın.
   7. Leke ile anti-IKK1 antikor (seyreltme ~ 1:2000, optimize edilebilir) veya anti-PentaHis antikor (seyreltme ~ 1:3000, optimize edilebilir).
   8. Titre büyük ölçekli ifadeler için ifade en iyi virüs kullanın.

2. büyük ölçekli ifade 6 x-O'nun insan IKK1^29,33 öğesini

1. Büyük ölçekli ifade bir süspansiyon kültürü yerine getirir. Bir 2 L Erlenmeyer şişesi Bacalı kapaklı bir ortamda Sf900 III 1 litre hücreleri bölün. Hücre yoğunluğu ~ 5 x 10⁵ hücre/mL olması gerekir.
2. Bu hücreler bir shaker 27 ° c ~ 100 rpm'de süspansiyon ~ 2 gün 1-2 x 10⁶/mL bir yoğunluğuna ulaşır kadar büyür. Hücre yoğunluğu 2 x 10⁶/mL aşmamalıdır.
3. P3 virüs, istenilen miktarda 1.4 içinde değerlendirilen gibi ekleyin.
4. 48-60 h ~ 100 rpm bir shaker 27 ° C'de için virüslü kültür büyümek.
5. Santrifüjü tarafından hücre hasat < 1.500 x g 4 ° C'de
6. Hücre Pelet kaydetmek ve orta atın.
7. Protein arıtma için doğrudan devam edin. Flaş sıvı azot ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de store hücre Pelet dondur.

3. IKK1 O'nun³³ saflaştırılması

1. Gün 1, hücre Pelet lizis arabellek 40 mL resuspend (25 mM Tris pH 8.0, % 0,2 NP-40, 200 mM NaCl, 10 mM imidazole, %10 gliserol, 5 mM β-mercaptoethanol ve proteaz inhibitörü kokteyl).
   Not: Islak Cep Pelet kitle tespit. Genellikle, ~ 2 L kültürünün bu adım için kullanıldı.
2. % 60-70 görev döngüsü, 30 s süre 5-10 Bakliyat, zaman aralığı sırasında sonication tarafından hücreleri parçalayıcı > hücre süspansiyon tutmak 1dk buzda soğutulmuş.
   Not: Optimizasyon sonicator her modeli ile bu adımı gerektirir. Örnek 10 ° c üzerinde ısınmak izin vermeyin
3. Santrifüjü ≥ 28.000 x g 4 ° C'de 45 dk için de tarafından lysate açıklamak
4. 4 üreticinin protokol sonrası mL Ni-NTA özel reçine ile lizis tampon ve mix açıklık lysate (süpernatant) equilibrate.
5. 4 ° C oda döner bir karıştırıcı 2 h için kuluçka tarafından reçine bağlamak protein sağlar.
6. Reçine içeren 30 mM imidazole lizis arabellek ile iyice yıkayın. Bradford tahlil kullanarak periyodik yıkama kesir protein konsantrasyonu kontrol edin. Bu protein konsantrasyonu yıkama kesir 0.1 mg/mL ulaşıncaya kadar yıkayın. Genellikle > 20 yatak yıkama arabellek hacmi bu noktaya ulaşmak için gereklidir.
7. O'nun öğesini IKK1/α protein 20 mL elüsyon arabelleği (250 mM imidazole içeren lizis arabellek) kullanarak yerçekimi akışı altında elute. 1-1.5 mL kesirleri toplamak.
8. Bir 8 veya % 10 SDS sayfa jel eluted protein saflığı tüm kesirler ile Laemmli tampon karışık üzerinden 5-10 μL örnek yükleyerek kontrol edin.
9. Tepe kesirler (konsantrasyon ≥ 2 mg/mL) havuz ve protein konsantrasyonu Bradford tahlil kullanarak ölçün.
10. TEV (1:30-50 (TEV proteaz: IKK1)) proteaz gecede (≥12 s) 4 ° C'de ile sindirmek
    Not: TEV proteaz için gerekli miktarı Optimize (≥ % 95) sindirim bir temanın6 X-O'nun etiketi tamamlamak. TEV proteaz içinde ev saflaştırıldı.
11. 2. gün sabahı, protein 1 mM ATP huzurunda 20 mM MgCl₂, 20 mM β-gliserofosfat, 10 mM NaF ve 1 mM sodyum orthovanadate 27 ° C'de 1 h için kuluçkaya
12. Protein çözüm ile 0,45 veya 0,22 mikron filtre.
13. 6 mL örnek bir otomatik sıvı kromatografi sisteme bağlı ~ 120 mL partiye hazırlık boyutu-dışlama sütuna yerleştirin. Arabellek A sütununda equilibrate (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, % 5 gliserol), protein örnek uygulamadan önce.
    Not: Daha küçük bir sütun Ni-NTA benzeşme arıtma adımdan sonra protein verim bağlı olarak kullanılabilir. Ayarlamak/sütun hacmi %5 için yük hacmi hesaplamak).
14. Boyut-dışlama Kromatografi 1 mL/dk debi çalıştırın ve 280 ve 254 nm, elüsyon izleme. Kesirler 2 mL boyutta toplamak.
15. Tepe kesirler saflığı kontrol (genellikle çevresinde ~ 60-70 mL) bir % 8-10 SDS-sayfa jel üzerinde.
16. Saf kesirler (≥0.5 mg/mL bir konsantrasyon ile saflık ≥95%) havuz ve konsantre bir 10 kDa veya 30 kDa molekül ağırlığı kesme santrifüj protein yoğunlaştırıcı üreticinin yönergeleri izleyin.
17. Düzenli olarak protein konsantrasyonu konsantre Bradford yöntemi tarafından kontrol ve örnek 8-12 mg/mL kadar konsantre.
18. 25 μL aliquots ve sıvı azot flaş dondurma dağıtmak. Bu flaş Donmuş numuneler-80 ° C dondurucuda saklayın.

4. ekran IKK1 durumunu kristalizasyon için

1. Aşağıda açıklanan yöntemleri takip kristalleri için ekran için gerekli protein (cilt tarafından) toplam tutarını hesaplar.
2. Farklı inhibitörleri deneyin (genel kinaz inhibitörleri: AMPPNP ve Staurosporine; IKK-specific inhibitörleri: MLN120B, bileşik A ve IKK-inhibitörü XII) kristalizasyon için tarama gerçekleştirmek için. Üreticinin yönergelerini izleyerek bu bileşiklerin hisse senedi çözümler olun. Bahçedeki hisse senedi çözümünün içinde maksimum konsantrasyon 20 mikron aşmaz olun.
3. Karmaşık IKK:inhibitor IKK1 karıştırma 100 mikron 200 mikron inhibitörü ile kristalizasyon ekran için hazırlayın ve 30-40 dk santrifüj kapasitesi için bu karisimin 18-20 ° C'de kuluçkaya > Oda sıcaklığında 2 dak için 15.000 x g. Süpernatant kristalizasyon ekran için kaydedin.
4. (Bkz. Tablo reçetesi) ticari olarak mevcut kristalizasyon ekranlarını kullanın.
5. Her kristalizasyon reaktif (rezervuar çözümleri), 80-100 μL bir çok kanallı pipet veya bir robot, bir 96-şey plaka göle kullanarak pipette. Plaka şimdi damla kadar ayarlamak hazırdır. Böylece 2-3 inhibitörleri tek bir tabak içinde ekranlı plaka 2-3 kristalizasyon damla barındırır emin olun.
6. Kristalizasyon robot kullanarak, dağıtmak ve 0,2-0,25 mix IKK1:inhibitor karmaşık μL rezervuar çözüm aynı hacmi ile.
   Not: Tarama daha büyük damla birimleri kullanarak el ile gerçekleştirilen (0.5-1.0 IKK1:inhibitor karmaşık μL rezervuar çözüm aynı hacmi ile). Ancak, bir robot kullanımı değerli reaktifler yardımcı olacaktır.
7. Hemen buharlaşma önlemek için optik net filmleri ile damla ayarladıktan sonra plakalarının. Düzgün uygun aplikatör kullanarak kapatın. Yineleme plakaları her inhibitörü kümesi için yapmak. 18 ° C ve diğer soğuk oda (sıcaklık aralığı ~ 4-6 ° C) bir tabak kuluçkaya. İnkübatörler titreşim tarafından etkilenmez emin olun.
8. Bir stereomicroscope bir polarize ile görünüm içinde her damla kristallerinin her gün ilk yedi gün boyunca ve daha sonra daha uzun aralıklarla denetlemek için kullanın. Sistematik olarak unutmayın ve bu gözlemler atabilirsin.
   Not: büyüme ekranlarda kristaller bulunan görsel olarak değerlendirilebilir böylece bir polarize ile bir stereomicroscope kullanın. Burada, kristaller bir durumda rezervuar çözüm %3 w/v Dextran sülfat sodyum tuzu M_r 5.000, 0.1 M bulunduğu BICINE pH 8,5, % 15 w/v Polietilen glikol 20.000 ortaya çıktı. IKK1 kristalleri sadece IKK-inhibitörü XII huzurunda büyüdü.

5. kristal büyüme optimizasyonu^29,33

1. Hisse senedi çözümleri hazırlanması.
   1. Farklı molekül ağırlığı (ortalama MW 5.000, 8.000, 15.000, 40.000 Da) deiyonize H₂0,22 mikron filtre kullanma O. filtre çözüm Dextran sülfat % 30 w/v çözümleri hazırlayın.
   2. 1 M veya 0,5 M stokları 6.5-9 pH aralığında farklı arabellekleri hazırlayın. Çözümleri 0,22 mikron filtre kullanarak filtre.
   3. PEG çözümleri farklı molekül ağırlığının % 25 veya %50 (w/v) hazırlamak (ortalama MW:1000, 1500, 3.350, 4000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, 20.000 Da). Çözümleri 0,22 mikron filtre kullanarak filtre.
   4. Bir kılavuz ekran sistematik olarak pH, ara bellek türü, konsantrasyon ve PEG ve Dextran sülfat türünü değiştirerek gerçekleştirin.
2. Tarama 18 ° C'de hem soğuk oda (sıcaklık aralığı ~ 4-6 ° C) en iyi duruma getirme.
3. İyi çözüm ile karmaşık IKK1:Inhibitor eşit miktarda karıştırın ve kapalı bir ortamda iyi çözüm üzerine kuluçkaya. Bu adımı el ile yapılabilir veya bir dağıtım robot kullanarak.
   Not: Burada, aşağıdaki koşullar altında (Tekdüzen büyüme gösterilen polarize altında tek tip renk tarafından değerlendirildi gibi) büyük ve iyi tanımlanmış kristalleri elde edilmiştir: 100 mM BisTris pH 7,0, Dextran sülfat (ortalama MW 15 kDa), 8,5-%10 20 PEG 2.8-%3.5 kDa soğuk odada.

6. çok sayıda büyüyen kristalleri

1. Aşağıdaki hisse senedi çözümleri hazırlamak ve onları 0,22 mikron filtre ile filtre.
   1. 0, 5 M BisTris pH 7,0 ve BisTris propan pH 7,0 ve 7,5 hazırlayın.
   2. %30 (w/v) Dextran sülfat (ortalama MW ~ 15 kDa) hazırlayın. 4 ° C'de mağaza
   3. % 50 hazırlamak PEG (ortalama MW ~ 12 kDa).
2. Kullanım 24 iyi açılan tabak asılı.
3. Dolgu macunu yağ her şey büyüdü Yüzüklerin uygulanır.
4. En iyi çözüm (son konsantrasyonu) aşağıdaki gibi hazırlamak: 100 mM BisTris pH 7,0-7.5, 2.8-%3.5 Dextran sülfat ~ 15 kDa, % 8,5-10 ~ 12 kDa PEG. 1 mL iyi çözüm 1.5 mL tüpler hazır olun.
   Not: Kristalizasyon durumda küçük bir varyasyon protein ve/veya Dextran sülfat dizi bağlı olarak gözlendi, böylece a duruşma-in dar aralığı önerilir. BisTris ve BisTris aynı pH aralığı propan arabellek verim tek kristalleri.
5. İyi çözümleri ve yağlanmış plakalar en az 1 h için soğuk oda tutun.
6. IKK1:Inhibitor 4,3 açıklandığı gibi karmaşık hazırlayın. En iyi çözümleri 1,5 mL tüpler için 24 iyi plaka wells bireysel aktarın.
7. Temiz silikonlu (ticari veya şirket içi (siliconization/silanization)) cam kapak hav bırakmayan mendil kullanarak paket fişi ve kesin olarak belirlemiş basınçlı hava modeller piyasada mevcut aerosol toz bezi kullanarak uygulayabilirsiniz.
8. 1 – 1,5 μL iyi çözüm bir temiz kapak fişinde yer. Pipet eşit IKK1:inhibitor karmaşık hacmi, mix yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından 3 - 4 kez. Cam kapak notu açmak ve de forseps ile ilgili yerleştirin ve kuyu üzerinde yağ basarak kapatın.
9. 24-şey plaka tüm damlaları ayarladıktan sonra soğuk oda karanlıkta plaka kuluçkaya. Zaman zaman damla bir mikroskop görünüm ve büyüme kristallerinin altında kontrol edin.
   Not: kristal plakaları ışığı altında kuluçka sonucunu değiştirecek olup olmadığını bu test edilmemiştir. Bu, ancak, tabakları en düşük/Hayır titreşim olan bir ortamda inkübe önemlidir.

7. Cryo koruma kristaller

1. Cryo çözümleri hazırlanması.
   1. Cryo A hazırlamak (~ %2 Dextran sülfat, ~ %10 PEG 12000, 60 mM BisTris propan (Toplam aynı pH amaçlanan iyi çözüm olarak), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, % 2.5 gliserol).
   2. Cryo B hazırlamak (~0.3% Dextran sülfat, ~ %10 PEG 12000, 60 mM BisTris propan (Toplam aynı pH amaçlanan iyi çözüm olarak), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 20 veya % 25 gliserol veya 20 veya % 25 etilen glikol).
      Not: farklı cryo-protectants gliserol ve etilen glikol (Örneğin, PEG 200, 400 PEG, MME 550 PEG, PEG 1000) ek olarak sınayın.
2. Yavaşça cam kapak kristal içeren notu çıkarın ve yukarı bakacak şekilde kristal damla ile sağlam bir yüzeye yerleştirin. Yavaşça 10 μL Cryo bir çözüm üstünde tepe-in belgili tanımlık damla ekleyin ve karışımı yavaşça böylece kristal dokundu pipetting tarafından.
   Not: Bu enkaz kristal yüzeyini temizler ve ilk soğuk arabellek ile kristal equilibrate yardımcı olur. Kristal için mekanik ve termal stres kaçının. Kristal için herhangi bir zarar görmemesi için mikroskop altında sonraki adımları uygulayın.
3. Yavaş yavaş bazı sıvı kristal kaldırın ve hakkında tutun 5-8 μL çözüm. Kristalin kurutma önlemek. Mekanik stres ve kristal sonraki adımda susuzluktan önlemek için aşırı dikkatli.
4. Yavaşça, karışımı çok yavaşça pipetting tarafından 2.5-4 μL Cryo B çözüm üzerine damla ekleyin. Kristal üzerinde doğrudan hava akışı önlemek için küçük bir petri kapak. 5 dk. için beklemek her zaman kristal hızlı değişiklikler ozmotik basınç ya da su kaybı acı değil dikkatli olun.
5. Adımı yineleyin 7,4 kristal cryo çözüm içine yavaş yavaş parkenizin için dört kez.
6. 10-20 μL cryo çözümün bu aşamada tutmak (yani, yaklaşık 20-25 %'i banyo kristal izin cryo-koruyucu içeren çözüm). Farklı bir süre için (5 dk 1 h) son cryo-çözüm içinde bekletin.
7. Birden çok kristalleri farklı zaman noktalarda dondur.
8. Dikkatli bir şekilde uygun Bankası ve dalma-sıvı N₂dondurucuda monte uygun bir soguk döngü içinde açılan tek bir kristal seç. Sorunsuz ve hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirmeniz Kristal buz oluşumunu önlemek için.
   Not: kullanılan Gelişmiş foton kaynak, Argonne Ulusal Laboratuvarı Robot Gonyometre içinde monte edilebilir kristal en uzun eksen biraz daha büyük bir döngü çapı kullanarak kristal seç.
9. Cryo-döngüler içinde sıvı N₂' batırma adam içeren kristal saklayın. Kadar sinkrotron, x-ışını kırınımı için sevkiyat için hazır bu adam sıvı N₂ ' Dewar flask saklayın. X-ışını kırınım veri toplama ve (Bölüm 8 ve 9) işleme devam edin.
   Not: her ne kadar sinkrotron taranması için kristalleri kalitesini belirtilen kırınım veriler ev x-ışını kaynaklarından IKK1 kristallerinin yapı belirlenmesi denemeler için yeterince yüksek çözünürlük değildi. Tüm kırınım veri önceden foton kaynak, Argonne Ulusal Laboratuvarı, ABD farklı beamlines (öncelikle 19ID) toplanmıştır.

8. x-ışını veri toplama

1. Uzak veri toplama yazılımı³⁴kullanarak APS sinkrotron kaynak ID19 beamline x-ışını kırınım veri toplamak.
   Not: yukarı 100 kristal kırınım özellikleri için test edildi. Kristalleri rutin olarak 7-11 Å, nadiren çözünürlük için 5 diffracted kristalleri diffracted Å 4.5 diffracted gözlenen ve tek bir büyük kristal vardı Å. Bu yana kristalleri hızla veri koleksiyon sırasında çürüdü, veri kümeleri, farklı kısımlarını aynı kristal toplanmıştır. Kristalleri büyük olduğundan bu mümkündü (400 µm daha büyük), ve kullanılan ışın çapı 100 µm yapıldı.

9. x-ışını veri işleme

1. Aynı kristal³⁴farklı yerlerinden toplanan tüm veri kümeleri birleştirme.
   Not: yedi veri kümeleri en iyi kristal birleştirildi ve sonuç veri %93 tamamlanmış oldu. Genel ben / σ ~ 6,8) ve Rmerge (5.4-4.5 Å) en yüksek çözünürlük Kutusu'ndaki % 89.
2. İşlem veri kümeleri ile alan grup, birim hücre boyutları, solvent içerik ve asimetrik biriminin makul kompozisyon elde etmek için HKL2000³⁴ .

10. yapı çözüm

1. Arama modelleri hazırlanması
   1. Mevcut yapısal hIKK2 modellerde dayalı (pdb kimliği 4E3C ve 4KIK³⁵), dimer bir dizi farklı yönelimleri N-terminal KD ile oluşturmak (Bu bir açılış 30 ve 62 işler Å, iki KD dimer P578 arasında). Bu modellerin hiçbiri çok çalışmadan sonra bir moleküler yerine arama çözüm getirdi.
   2. IKK1 haritası tek-parçacık cryo-EM veri³³oluşturur.
   3. İnsan IKK1 bir model IKK2 en yüksek çözünürlük yapısından oluşturmak (pdb kimliği 4KIK).
   4. Bireysel etki alanları insan IKK1 modelinin COOT³⁶kullanarak cryo EM yoğunluğu Haritası insan IKK1 yerleştirin. Bu KD yönlendirme yaklaşık 24 derece döndürülmüş ve 58 ~ Å açılış N-terminal değiştirilebilir.
   5. Cryo-EM ile donatılmış modeli (monomer) KD yönünü 10.1.1 son içinde oluşturulan tüm dimer uygulanır.
2. Moleküler değiştirme
   1. Dimer 10.1.1 son ve 10.1.5 arama modellerinde programları fazer³⁷, MOLREP³⁸ ve CNS^39,40olarak kullanın.
      Not: Burada, bir dimer 10.1.5 (52 Å açılış)--dan a arama model olarak kullanarak, altı dimer (iki hexamers) asimetrik biriminde MOLREP kullanarak bulunmaktaydı. Arama modelinde açılış 52 Å zarif yapısı dimer (tüm altı dimer) 49-50 Å açılış benzer.

11. yapısı arıtma

1. Yapısı arıtma yordamı
   1. Oryantasyon ve bu ilk model konumunu CNS (cns_solve_1.3)^39,40katı vücut arıtma sabitleyin.
   2. Daha fazla pykał ve maksimum olabilirlik hedef işlevi ve bir daire toplu solvent düzeltmesi CNS sistem^39,40kullanarak simule edilmiş tavlama kullanarak yapısı rafine.
   3. 2F_O-F_C temel model oluşturmak ve Fo-Fc Xtalview⁴¹kullanarak eşler.
      Not: DEN destekli arıtma⁴² geçerli ve NCS model daha iyi doğruluk için ayrıntılandırmaları sırasında dizginlemek. Nitekim, DEN arıtma önemli ölçüde geometrileri ve R-faktör yapısı, geliştirmek ve R faktörü %22,2 ve ücretsiz R faktörü %27,8 son modelinde için oldu. R ücretsiz dramatik gelişme nedeniyle yüksek doğruluk modeli IKK2 modeli (4KIK) oluşturulan IKK1 etki alanlarının olması gerekir.

Klonlama ve ifade IKK1/α farklı yapıları
İnsan IKK1/α baculovirus ifade vektör pFastBacHTa bir N-terminal hexa-histidin elde etmek için onun EcoRI ve NotI kısıtlama siteleri içinde içine klonlanmış tam uzunlukta IKK1 etiketli. Etiketi TEV proteaz sindirim tarafından kaldırılmış olabilir. Tam uzunlukta IKK1/α her iki ucundaki esnek bölgeleri içeren ve esnek bölgeler genellikle bir protein kristalize zor render beri IKK1/α pFastBacHTa vektör yukarıda belirtilen siteler içinde çeşitli kesilmiş parçaları klonlanmış. IKK1/α, çeşitli kesme mutantlar vahşi-tipi (wt) ve S176E, 180E ile oluşturulan (EE) omurgalarına. IKK1/α EE fosforile kinaz yapısal etkin form mimetic için anlamına gelir. Rekombinant baculovirus üretim ve protein ifade küçük değişiklikler43 ile (Şekil 1) kullanarak daha önce yayımlanmış bir protokol yapıldı.

IKK1/α kristalizasyon zorluk
İnsan IKK2/β ve IKK1 homolog ve insan IKK2/β birkaç farklı koşullar altında farklı sürümlerini kristalize bu yana, biz benzer stratejileri kullanarak benzer koşullarda kristalize için IKK1/α bekleniyor. Ancak, birkaç farklı IKK1 türevleri ile çok çalışmadan sonra biz kristalleri tek kesilmiş yapı (IKK1 10-667 EE) ile elde edilen (resim 2) ve aynı zamanda yalnızca uygun görüntülenen IKK inhibitörü XII44 varlığında X-ışını kırınım özellikleri.

Yapı çözüm
IKK1/α kristalleri çok sayıda büyüme sorunları acı ve görüntülenen veri genellikle çok yüksek mosaicity. Zayıf kristal ambalaj büyük solvent içerikle ilişkili ve IKK1 monomer/dimer dinamik doğası bu arkasındaki olası nedeni vardır. Bu sorunları aşmak için özenli çabalarının en iyi olası kristalleri elde etmek için alınmıştır ve cryo-koruma yordamı ile çeşitli koşullar altında son derece dikkatli ve ile çeşitli cryo-koruyucu tampon gerçekleştirildi. Veriler ayrıca ışın hasarı en aza indirmek için nihai hassasiyetle toplanmıştır. Kristaller (genellikle 400 mikron aşan büyük en büyük boyut) olduğundan, aynı kristalleri farklı alanlarda birden çok veri toplamak için röntgen ışını maruz bırakıldı. Bu farklı DataSet'lerdeki ölçekli ve makul tam veri kümesi ile daha yüksek artıklık edinmek için etkin ve hata simge durumuna küçültülmüş. Ağır atomlar veya ağır atom kümelerini (Örneğin, TaBr ve TAMM), yeterli ölçüde diffract kristaller neden sırılsıklam. Biz-ebil yerini öğrenmek TaBr kümeleri konumunu türev verileri, verilerin yanı sıra sigara isomorphocity düşük kaliteli küçük, varsa, faz bilgi verilse.

Biz HKL2000 ile çeşitli kullanılabilir parametreleri kullanarak veri işleme. Kristal birim hücre boyutlarına sahip alanı Grup P21 ait olduğu kırınım deseni ortaya bir 174.51, = b 186.94, c = 275.83 = Å ve β = 98.84 derece. Ben esas olarak kullandığımız / σ kesme tahmin etmek için ve çeşitli kesintileri veri kümeleri için test edilmiştir. Biz Å Çözünürlük 4 7 kırınım veri kümesi, bir kristalde toplanan 4.5 birleştirilmiş veri kümesi elde. Son yoğunluk Haritası görsel denetim 4.5 Å kadar veri tutmaya karar verdi. CC1/2, kullanmadan önce analitik CC CC *45kullanarak doğru (genellikle ölçülemez) yoğunluklarda karşı birleştirilmiş veri kümesinin tahmin edebilirsiniz faydalı olabilir. Alan grup düşük simetri ile birlikte büyük birim hücre nedeniyle 12-24 molekülleri çözücü içeriğine, 70 @ göre içerecek şekilde asimetrik birim beklenen.

Düşük çözünürlük x-ışını veri zayıf yoğunluklarda (yani, veri önemli hatalar) ile Birleşik etkisi (Şekil 3), asimetrik birim ve IKK1 monomeric/dimerik modelinin konformasyonal değişim IKK1 molekülleri çok sayıda (12) bilinen IKK2 karşılaştırıldığında modelleri, başlangıçta engelledi bizden bir moleküler yerine çözüm IKK1 alma ve böylece yapısını belirleme.

IKK1/α ve IKK2/β kinaz etki alanı (KD), Ubikuitin benzeri etki alanı (ULD) ve bir a-helisel iskele dimerization etki alanı (SDD) içerir. IKK1 yapısını IKK2 benzer şekilde dimer SDD distal bölgesinin hemen hemen aynı arası alt birimi arabirimi kullanan formlar saptandı. Bununla birlikte, IKK1 dimer bir önemli ölçüde farklı göreli konumlandırma-N-terminal KD SDD + ULD bilinen IKK2 dimer kıyasla göreceli olarak görüntülenir. Böylece dört farklı dimer modelleri iki KD P578 Alfa Karbonlar arasındaki mesafeleri çeşitli 39 ve 61 Å arasında farklı IKK2 yapıları daha önce onun dimer (Şekil 4paneli A), içinde farklı intermonomer yönelim belirtti. Çünkü bu iki kinaz dizisi çok benzer ve artıkları dimer arabirim aynıdır, IKK1/α benzer bir dimer kuracaktı beklenen; Ancak, artıkları KD-SDD arabiriminin önemli farklılıklar olduğundan (Örneğin, W424 ve IKK2 F111 V ve P sırasıyla) vardır, belki de bir daha farklı KD yönlendirmede IKK1 beklenen. Gerçekten de, IKK1/α yapısı KD SDD için ilgili yönelimleri benzersiz olduğunu ve tüm bilinen IKK2/β modellerden sapma göstermiştir. Yüz dimer aşan modelleri programları fazer, MOLREP ve CNS moleküler değiştirme denemeler, özellikle düşük çözünürlüklü verilerimiz başarısı için oldukça doğru arama modeli için ihtiyaç gösteren herhangi bir başarı olmadan arama modelleri olarak kullanılmıştır. Bir monomer model 12 monomerler içeren büyük asimetrik biriminin zayıf kırınım verilerdeki herhangi bir çözüm almak için çok az kütleye sahip. Ayrıca, dahil veya su arama modelindeki ihmal moleküler yerine arama, hiçbir fark özellikle zayıf kırınım veriler nedeniyle yapılmış. CC1/2 ve CC * veri 4.5 Å kadar oldukça hassas olduğunu gösterir. 4.5 muhafazakar çözünürlük cut-off kullanılan ben Å dayalı / σ 1.5. Veri kümeleri farklı çözünürlük kesintileri ile moleküler yerine arama işlemleri sırasında herhangi bir stark fark yoktu ve bu veri kümeleri karşı rafine son haritalar çözünürlük uzanan harita özellikleri içinde farklı herhangi bir iyileşme belli etmedi kesintileri. Modelinin sonda gelen kurmak oldukça doğrudur, ne yoğunluk yalnız, inşa edilecek daha fazla ilk moleküler değiştirme modelleri modelleri inşa edilmiş bu yana büyük olasılıkla yüksek çözünürlüklü bir veri ile elde edilen ve cryo-EM harita/yoğunluğu için kullanılan özellikle nerede haritalar belli bölgelerde harita özelliklerini kontrol edin.

Gez, olası bir kullanışlı arama modelinin elde sadece nedeniyle düşük çözünürlüklü cryo-EM harita kullanılabilirliğini ve oldukça yüksek doğruluk modeli temel alan, yüksek çözünürlüklü IKK2 yapısı (Şekil 4 oluşturulabilir IKK1 etki alanlarının panel B). Oldukça yakın dimer modeli elde etmek için IKK1 cryo-EM Haritası IKK1 etki alanları-limana. Başlangıç modeli bir yönünü KD 24 derece göre bu bir IKK2 monomer ve 58 N-terminal açılış döndürülmüş belirtilen Å (arasında bir dimer iki br P578). Farklı IKK2/β dimer yapıların bizim ön bilgi (ve onların varyasyon) arama modeli a arama modeli 30-62 Å. kullanma bir dimer (52 Å açılış) arasındaki açıklıklar değiştirerek ince ayar yapmak için bize etkin, biz altı dimer kullanarak asimetrik biriminde bulunan Program MOLREP46. Bu altı dimer asimetrik birimi iki hexamers halinde düzenlenir ve hesaplanan çözücü % 68'i bir hacmi vardır.

Şekil 1: arıtma IKK1. (A) ifade, IKK1 (10-667) böcek hücrelerinde. (B) IKK1 arınma için bir akış şeması; (C) IKK1 saflığı Ni-NTA benzeşme Kromatografi adımdan sonra gösterilen bir SDS-sayfa jel. (D) IKK1 dimer gösteren boyutu-dışlama profil. (E) IKK1 saflığı en yüksek boyut-dışlama kesirler üzerinden gösterilen SDS-sayfa jel. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Morfoloji ve boyut IKK1 kristallerinin. (A) IKK1 kristal 10-667 oluşturmak; kristalizasyon bırak da iyi diffract değil başka bir morfoloji (ince levhalar) kristalleri gösterir. (B) 5 diffracted kristal görünümünde yakınlaştırılmış Å. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Crystallographic veri IKK1 kristalleri elde. (A) bir x-ışını kırınım profili tipik IKK1 kristalleri zavallı kırınım özelliklerini gösteren bir IKK1 kristal. (B) HKL2000 IKK1 yapısı belirlenmesi ve artıklık veri için kullanılan birleştirilmiş veri kümesi ölçekleme istatistikler. R doğrusal = topla (ABS (ı - < ı >)) / SUM (ı), R kare = topla ((ben - < ı >) ** 2) / toplamı (Ben ** 2), Chi ** 2 = topla ((ben - < ı >) ** 2) / (hata ** 2 * N / (N-1))), CC1/2 = korelasyon katsayısı, CC * gerçek yoğunluklarda karşı birleştirilmiş veri kümesinin korelasyon katsayısı =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: ara modeller hazırlanması. KD (iki KD arasında farklı ayrımına sebebiyet veren); SDD göre farklı yönelimleri gösteren IKK2 dimer (A) farklı modeller Bu modeller başlangıçta herhangi bir başarı olmadan bir moleküler yerine çözüm bulmak için test edildi. (B) IKK1 üretimi arama modelleri - 11 Å çözünürlükte IKK1 dimer Cryo-EM Haritası; EM-harita başlangıç IKK1 arama modeli ile donatılmış, bireysel etki alanları (4KIK); IKK2 modele dayalı IKK2 modellerden değerlendirilecektir gibi çeşitli olanaklar dayalı daha da güzel tweaked bir IKK1 arama modeli (uygun KD yönlendirme) 4Ayukarıda tarif; EM-harita süperpozisyon moleküler yerine çözüm vermiştir arama modeline donatılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirin.