Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

7.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56092

⸱

10 Ocak 2018

 , 
1Chemical Biology, Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 2Department of Physiology, Anatomy, and Genetics, University of Oxford, 3Trans-synaptic signaling, European Neuroscience Institute

Bu makalede

Özet

Burada açıklanan AWESAM iletişim kuralı diğer beyin hücreleri izolasyonu fare astrocytes bir hızlı, basit ve ucuz şekilde kültür için en iyi yöntemdir. AWESAM astrocytes spontan Ca2 + sinyal, morfoloji ve gen ifade profilleri için astrocytes vivo içindebenzer sergi.

Özet

AWESAM (bir low- easy stellate birstrocyte malınan mal) protokolü üzerine kuruludur vivo içindebüyük miktarlarda üretmek için hızlı, basit ve ucuz bir yol-fare ve sıçan astrocyte monocultures hangi tarihlerde : Beyin hücreleri farklı beyin bölgelerden izole olabilir ve hücre kültürü bir hafta sonra astrositik olmayan hücreleri bir shaker kuluçka 6 h için Tarih kültür yemekleri yerleştirerek sarsılmış. Kalan astrocytes sonra yeni kalıplara (NB + H olarak adlandırılan) bir astrocyte özgü orta ile pasajlı. NB + H heparin bağlama EGF benzeri büyüme faktörü (HBEGF), serum orta yerine kullanılan düşük konsantrasyonlarda içerir. NB + H içinde büyüyen sonra AWESAM astrocytes Yildiz Seklinde bir morfoloji ve özellik iyi işlemler var. Dahası, bu astrocytes daha fazla vivo içindevar-tarihlerde gen ekspresyonu daha önceden yayınlanmış yöntemlerle üretilen astrocytes. CA2 + görüntüleme, vezikül dinamikleri ve diğer olaylar membran yakın böylece iyi astrositik süreçleri vitroiçinde canlı hücre confocal veya TIRF mikroskobu kullanarak örneğin, okudu olabilir. Özellikle, AWESAM astrocytes da astrocytes içinde vivoiçin benzer sinyal spontan Ca2 + sergi.

Giriş

Astrocytes trofik desteği, kan akımı, sinaptik sinyal ve plastisite ve hücreler arası iletişim - tüm bunların etrafında ince astrositik süreçleri Merkezi mekanizmalar aracılığıyla beyin fonksiyonlarını etkiler. Burada açıklanan AWESAM Protokolü nöronlar ve yararlı örneğin, birçok protein ve hatta Ca2 + sinyal ifadesi farklı beyin hücre boyunca örtüşme olan diğer glia müdahale olmadan bu süreçlerin çalışma sağlar türleri. Ayrıca, bu yöntem daha önce kullanılan tekniklerin sınırlamalar üstesinden gelir. Özellikle, vivo içindebizim iletişim kuralı sağlar-Morfoloji (Yildiz Seklinde astrocytes ince süreçleri ile) ve bir hızlı, kolay, gen ekspresyonu ve ucuz şekilde gibi.

Doğrudan hücre morfolojisi, gen ekspresyonu ve birçok diğer düzenleyici işlemler çevre tarafından etkilenmiştir. Bir kültür tabak içinde bu faktörler tarafından çevreleyen hücreleri, aynı zamanda hangi hücreleri yetiştirilmektedir orta serbest ifade eder. Astrocytes, HBEGF bir Yildiz Seklinde Morfoloji1 ikna etmek için daha önce bildirildi ancak aynı zamanda astrocytes2de-ayırt etmek için bulunamadı. Ancak, düşük konsantrasyonlarda HBEGF, daha sonra daha fazla vivo içindeoluşturmak için kullanılmıştır-RNA sıralama iki farklı protokol3,4ile tanımlandığı gibi hangi tarihlerde astrocytes. Ayrıca, bağımsız olarak protokolü4orta bileşimi ile astrocyte Morfoloji değiştirir: Neurobasal orta HBEGF bir düşük konsantrasyon ile diğer Orta besteleri (örneğin, süre Yildiz Seklinde astrocytes yetiştirmek için en uygun Serum DMEM içeren) poligonal hücrelerde (hatta astrocytes taze immunopanning tarafından izole) üretmek.

AWESAM Protokolü dezavantajları astrocyte monocultures4büyüyen için önceki teknikleri üstesinden gelir. Astrocyte monocultures büyüyen için önceki teknikleri var aşağıdaki dezavantajları: Yildiz Seklinde astrocytes vivo içinde (MD yöntemi)5/; alışılmadık poligonal Morfoloji uzunluk ve maliyet (astrocytes İndüklenmiş pluripotent kök hücreler alır üzerinden üç ay hazırlık ve pahalı büyüme faktörleri de dahil olmak üzere birçok reaktifler gerektirir) Protokolü'nün6; malzeme (immunopanning yöntemi)3düşük miktarda; ve astrocytes de-farklılaşma ve gereksinimi 3D matris (Puschmann ve ark.) 1 , 2. buna ek olarak, AWESAM Protokolü sağlar: vivo-tarihlerde Morfoloji (ince süreçleri ile Yildiz Seklinde astrocytes); hızlı, kolay ve ucuz yöntemi; malzeme büyük miktarlarda; ve en vivo içinde-gen ekspresyonu immunopanned ve MD astrocytes ile karşılaştırıldığında hangi tarihlerde. Ayrıca, Ca2 + sinyal ve vezikül ince işlemler ve olaylar membran yakın geri dönüşüm çalışması için 2D kültür sağlar (örneğin, TIRF mikroskobu 3D kültürlerde mümkün değildir).

MD yöntemi yayımı 19805poligonal astrocyte monocultures teknik bir basit ve hızlı sunan, beri yaygın olarak kullanılmış. Kısacası, MD yöntemi (FCS) fetal buzağı Serumda büyüyen karışık beyin hücreleri üzerine kuruludur-DMEM, içeren takip (olarak diğer tüm beyin hücresi türleri çanak ayırmak) için astrocytes zenginleştirmek ve daha fazla kültür aynı ortamda basamaklarının sallayarak. FCS ile desteklenmiş DMEM farklı kanser hücre satırlarına tüm bunların MD astrocytes kültür tarafından sergilenen poligonal Morfoloji paylaşmak, fibroblastlar ve adiposit arasında değişen birçok hücre tipleri için kullanılır. Kadar erken 2000'lerde7, küçük düşünce olmuştu astrocytes için uygun bir ortama verilen, özellikle onların tipik Yildiz Seklinde Morfoloji lehine içinde vivobuldu. 2011 yılında yayınlanan bir protokol ulaşmak böyle Yildiz Seklinde Morfoloji: immunopanning yöntemi olarak adlandırılan, serum-Alerjik orta astrocytes3kültür için en iyi duruma getirilmiş kullanır. Bu yöntemi kullanarak, taze izole beyin hücreleri bir dizi hücre türüne özgü hücre yüzey proteinleri astrocytes için zenginleştirmek için hedef antikorlar ile kaplı yemekleri sunulur. Daha fazla vivo içinderağmen-immunopanned astrocytes morfoloji ve ifade profil gibi vitro çalışmalar çoğunluğu hala MD astrocyte yönteme güvenmek. İmmunopanning yöntemi daha karmaşık ve zaman alıcı adımlar kültür ilk gününde kapsar MD yöntemi basit ve hızlı, iken (uzun enzim sindirim süre gibi çözümleri farklı yoğunluk, immunopanning kendisi, dikkatli katmanlama ve çeşitli aralıklarla adımlar - kaplama tüm önce). Ancak, daha özel orta kullanarak, AWESAM yöntemi her iki hızını MD yöntemi ve in vivosunar-tarihlerde immunopanning Protokolü morfolojisi.

Genel olarak, AWESAM Protokolü daha fazla vivo içindeçalışmak için yararlıdır-tarihlerde astrocytes 2D monocultures neurons ve diğer glia (immunostainings, immunoblots ve RNA sıralama tarafından daha önce karakterize4 ) olarak izole içinde. Bu ince astrositik işlemler çalışma için izin verir ve spontan Ca2 + sinyal ve olaylar (tarafından TIRF mikroskobu görüntüsüörneğin,) membran yakın görüntülenmesi için büyük erişilebilirlik sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri Alman hayvan refahı için kurallar uyarınca gerçekleştirilmiştir.

Not: Zaman çizelgesi ve protokol ana adımları şekil 1' de gösterilmiştir.

1. hazırlıkları

  1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
    1. DMEM + poligonal MD astrocytes kültür için hazırlamak: % 10 FCS, 100 U penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile DMEM.
    2. NB + H Yildiz Seklinde astrocytes kültür için hazırlamak: 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 ek, 1 x glutamin takviyesi, 100 U penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile neurobasal orta.
      Not: HBEGF daha yüksek konsantrasyonlarda Aliquots hazırlanan ve gerektiğinde Orta olarak eklenecek-20 ° C'de depolanan.
    3. Diseksiyon orta (10 mM HBSS HEPES) hazırlayın.
    4. Aliquots 6-7 ml % 0.05 tripsin-EDTA ve 6-7 mL % 0.25 tripsin-EDTA 15 mL tüpler hazır olun. Bunlar-20 ° C'de depolanan ve bir 37 ° C su Banyosunda çözdürülen.
  2. İletişim kuralı, başlamadan önce gün 10 cm doku kültürü tedavi bulaşıkta %0,04 polyethylenimine (PEI) her 5 mL kat.
  3. Ertesi gün, PEI kaldırmak ve iki kez deiyonize, distile su ile bulaşık. DMEM + 12 mL her plakasına ekleyin ve hücreleri kaplama daha önce 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka için en az 30 dk önceden equilibrate.
  4. Diseksiyon alan hazırlamak: bir laminar akış diseksiyon başlık, yer iki 10 cm Petri yemekler diseksiyon orta buz dolu. Her beyin alanını için izole (örneğin, korteks, Hipokampus), 15-tüp 14 mL diseksiyon orta ile dolu hazırlamak ve buz üzerinde tutun. Diseksiyon araçları (iyi makas, Dumont #3 ve #5 forseps) % 70 etanol ve yere karar diseksiyon mikroskop kapüşonlu ile sprey.

2. fare veya fare beyin diseksiyon

Not: Her iki fareler ve sıçanlar-ebilmek var olmak kullanılmış. P8-da var olmak kullanılmış daha yaşlı hayvanlar (biz P12 kadar test), ama meninkslerde kaldırma giderek daha zor olacak. Beyin hücreleri büyük hayvanlardan karmaşık işlemler ve doku ayrılma, artan hücre ölümüne giden sırasında kırılabilir bağlantıları kurdu beri Ayrıca, hücre verim ve sağlık, azalacak. Kortikal hazırlıkları burada açıklanan, ancak diğer beyin bölgeleri de kullanılabilir.

  1. % 0.05 tripsin-EDTA bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin.
  2. Hayvanlar (gebe rats E19 pups veya P0-P8 hayvanlar için) yavaş yavaş CO2 konsantrasyonu yükselterek ötenazi ve beyin yalıtır. Aşağıdaki adımları steril tekniği gerektirir.
  3. Eğer embriyonik dokuyla çalışma, önce embriyoların rahim kaldırın ve embriyonik keseleri açın sonra hemen kafalarını makasla kesme. Tüm başkanları kesilir, onları önceden soğutulmuş diseksiyon orta aktarın.
    1. Bir kez belgili tanımlık mezartaşı ortamda batık, forseps ve beyincik kapalı çimdik cilt ve kafatası (her ikisi de çok genç hayvanlarda yumuşak) açın. Dikkatle kolu yukarı ve dışarı kafatası beyin geri kalanı.
      Not: 2-4 E19 embriyo kortikal astrocytes çanak başına 500.000 hücre, diseksiyon gününde kaplama, en az sekiz 10 cm yemekler için yeterince doku verim.
  4. Eski veya yeni doğan yavruları için kafalarını makasla kesmek ve hemen cilt kafasının arkasından düz bir çizgi burnun ucu için kesim tarafından beyin yalıtır. Kafatasının sol ve sağ, sonra kafatası kemik Asansör bir kenara ve dikkatle kesilmiş deri çek. Beyincik kesme ve yukarı ve dışarı kafatası beyin diğer kol.
    Not: 2-3 P0-P8 pups kortikal astrocytes çanak başına 500.000 hücre, diseksiyon gününde kaplama, en az sekiz 10 cm yemekler için yeterince doku verim.
  5. Korteks temel orta yapısından ayrı. Forseps hemisferlerin arasında boyuna çatlak içinde yer sonra hareket forseps bir Yarımküre (boyuna çatlak dikey) korteks ve orta yapıları arasında her hemisphere ücretsiz çimdik için.
  6. Forseps kullanarak her hemisphere (ve onun Hipokampus) tüm meninkslerde çıkarın, sonra hippocampi ayrı. Hipokampal astrocytes gerekiyorsa, her Hipokampus 14 mL diseksiyon orta buz dolu bir 15 mL tüp içine taşıyın.
  7. Özel bölgeler gerekli (örneğin, frontal korteks) daha fazla alanlarda her hemisphere'nın korteks kaldırın. 1 mm3daha büyük parçalara astrocytes oluşturmak için kullanılacak kortikal herhangi bir doku kes. Diseksiyon orta buz dolu ayrı bir 15 mL tüp kortikal doku tüm parçaları toplamak.

3. doku sindirim ve ayrılma

  1. Bir kez tüm doku parçaları toplanır, tüp altına yerleşmek bekleyip sonra mümkün olduğu kadar orta Aspire edin.
  2. 2-3 mL % 0.05 tripsin-EDTA serolojik pipet kullanarak ekleyin ve 20 dakika 37 ° C su banyosu tüplerde kuluçkaya.
    Not: tüm tripsin-EDTA hızla doku parçaları karıştırın ve tekrar yerleşmek için izin vermek için pipet üzerinden yayın.
  3. Dikkatle tripsin-EDTA, tüpün dibinde mümkün olduğunca küçük sıvı olarak doku parçalar halinde bırakarak Aspire edin.
  4. Kalan tripsin EDTA yıkamak için önceden soğutulmuş diseksiyon orta 5 mL ekleyin. Üst kısmındaki doku parçaları karıştırma ulaşmak için tüp tarafına pipet.
  5. Diseksiyon orta Aspire edin ve doku parçalar halinde mümkün olduğunca küçük sıvı olarak bırakın. Önceden soğutulmuş diseksiyon orta iki kez daha fazla ile bu çamaşır tekrarlayın.
  6. Son yıkama adımdan sonra istimal DMEM + (oda sıcaklığına kadar ısındı) 1.000 µL pipet ucu ve triturate pipetting tarafından doku ve kabarcıklar tanıtımı olmadan aşağı 1 mL ekleyin.
    Not: bu-ebilmek değişmek belgili tanımlık eriyik, hangi astrocytes oldukça duyarlı olan pH gibi bu kabarcıklar, üreten önlemek önemlidir.
  7. 50 mL tüp açılış 100 µm hücre süzgeç koyun ve önceden soğutulmuş DMEM + 4.5 mL filtresiyle önceden ıslak.
  8. Disosiye doku süspansiyon hücre süzgeç üzerine 1 mL pipette ve başka bir 4.5 mL ekleyin önceden soğutmalı hücreleri hücre süzgeç aracılığıyla yıkamak için + DMEM.

4. hücre kaplama Passaging tarafından Astrocyte zenginleştirme için

  1. Örneğin, hücreleri hücre süspansiyon 10 µL trypan mavi ile 10 µL sulandrarak ve karışımı bir hemasitometre üzerine pipetting saymak.
  2. 12 mL DMEM + 10 cm çanak başına 500.000 hücrelerde plaka.
    Not: DMEM + astrositik büyüme için yararlıdır nöronlar veya microglia için daha çok. Sallayarak sırasında cam coverslips kuyu içinde hareket eden fiziksel güçleri çok bu 10 cm yemekleri (coverslips) olmadan oyunculuk daha güçlü. Hücreleri 24-şey Tabaklarda sarsıldı, onlar sağlıksız hale veya ölmek. Sadece plaka astrocytes sallayarak sonra 24-şey plakaları.
  3. Hücre kültürleri da kuluçka makinesine 37 ° C ve % 5 CO2 ' de yedi gün boyunca tutun.
  4. Gün 6, adım 5'te açıklandığı gibi kültür PEI kaplı plakalar gün sallayarak ve hücreleri, passaging önce hazırlayın.

5. passaging hücreleri

  1. Bir gün önce passaging, hücre kültürü plakaları %0,04 PEI ile kat.
    1. İmmunocytochemistry, viral iletim veya plazmid transfection (her bir steril 12 mm veya 25 mm cam coverslip, sırasıyla içeren) 24-şey veya 6-şey tabak kullanın.
    2. Cam coverslips % 70 etanol en az 1 h için kuluçka tarafından sterilize etmek, sonra üç kere coverslips wells yerleştirmeden önce deiyonize, distile suda yıkayın.
    3. En az 70 µL %0,04 PEI başına 24-şey tabak 12 mm coverslip ve 600 µL %0,04 PEI 25 mm coverslip 6-şey tabak içinde başına ekleyin.
    4. Western blot ya da RNA-Seq analiz için zaten sonra diseksiyon hücreleri içeren 10 cm yemekleri kullanmaya devam edebilirsiniz. Yemekleri sadece sarsılmış gerekir, sonra hücreleri 1 x PBS ile yıkanmış ve NB + H ile tedavi (yeni yemekleri aktarmak).
  2. Gün vitro (DIV) 7 sonra diseksiyon, 10 cm yemekleri hücreleri ile DMEM + bir laboratuvar shaker kuluçka üzerine yerleştirin ve yemekleri 6 h için 110 rpm'de sallamak.
  3. PEI deiyonize, distile su ile kaplı coverslips üzerinden kapalı iki kez yıkayın. NB + H orta plakaları (24-şey plakaları için ve iyi 6-şey plakaları için başına 2 mL başına 500 µL) ekleyin. Plakayı kuluçka 37 ° C ve 10 cm yemekleri titriyor iken % 5 CO2 veya en az 30 dk önceden equilibrate.
  4. 20-30 dk 6 h sallayarak sona ermeden önceden 1 x PBS, DMEM +, NB + H ve % 0.25 tripsin-EDTA 37 ° c su banyosunda ısıtın.
  5. 6 h sallayarak, kültür yemekleri shaker almak ve (içeren nöronlar sarsılmış kapalı, oligodendrocytes ve microglia) orta ile 10 mL yerini alması sonra çanak başına 1 x PBS önceden ısıttı.
    Not: Hemen yeniden bağlama astrositik olmayan hücreleri önlemek için ayrılmış hücreleri içeren eski orta Aspire edin önemlidir.
  6. PBS kaldırın ve 3 mL Önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çanak başına ekleyin. Her yemeğin 4 dk. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka için kuluçkaya.
    Not: Western blot veya RNA-Seq için numune hazırlama, tripsin-EDTA ekleyerek değil. Bunun yerine, eski yerine koymak PBS 12 mL ile NB + H, sonra da kuluçka makinesine kültürler yerleştirilebilir önceden ısındı.
  7. 5 Önceden ısıtılmış DMEM + 3 mL tripsin-EDTA her için çanak, hücreleri 5 mL serolojik pipet kullanarak çanak dışına pipette ve hücre süspansiyon 50 mL tüp içinde toplamak mL ekleyin.
    Not: Pipet çanak - altından doğrudan kat yemeğin hücreleri ayırmak gibi daha net hale gelmelidir. Serum tripsin inaktive gibi sadece serum içeren orta (yerine DMEM +), kullanın.
  8. Hücre süspansiyon 3,220 x g 4 dk 20 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
  9. Süpernatant kaldırmak ve resuspend hücre Pelet 1 ml NB + H önceden ısıttı.

6. hücre kaplama son Astrocyte kültürler için

  1. Hücreleri saymak.
  2. 6-iyi tabak (ortamda 2 mL NB + H iyi başına) bir kuyu başına 20.000 hücre veya 24-şey tabak (ortamda 500 µL NB + H iyi başına) bir kuyu başına 5000 hücre plaka.
  3. Hücre kültürleri da kuluçka makinesine 37 ° C ve % 5 CO2 de daha ileri tedavi veya analiz kadar tutun.
  4. Yarım orta haftada bir değişimi.
    Not: Düşük besin ortamlarda Proliferasyona astrocytes durmak ama her ne kadar (deneyim, yok microglia AWESAM kültürde ortaya çıktı) kalan herhangi bir microglia çoğalırlar. Yarım orta bir kez bir hafta herhangi bir potansiyel olarak kalan microglia8zenginleştirme engeller ve monocultures en az üç hafta boyunca sağlıklı kalmak alışverişi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Nöronlar ile birlikte kültürlü ve NB + ortamda yetiştirilen astrocytes 2 hafta sonra kültür (Şekil 2) Yildiz Seklinde görünür. NB + orta ek olarak, ortak kültür astrocytes de büyük olasılıkla onların hayatta kalma ve Morfoloji katkıda bilinmeyen nöron kaynaklı faktörler maruz kalır. Buna ek olarak, MD astrocytes DMEM + (diğer hücre tipleri geçiş önce kapalı sallayarak sonra) monocultures yetiştirilen 2 hafta sonra poligonal görünür. AWESAM astrocytes sallayar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Protokol içinde dört adım kritik: 1) konsantrasyonu küçük artışlar olgunlaşmamış kültürler için örneğin, neden olabilir beri tam 5 ng/ml, HBEGF konsantrasyon hazırlanıyor 10 ng/mL HBEGF astrocytes4; de-ayırt 2) doku veya pH değiştirebilir ve astrocyte sağlık engel hücreleri içeren çözümler kaçınmak kabarcıkları; 3) en uygun pH ve sıcaklık sağlıklı astrocytes büyüyen için elde etmek için ortam sıcaklığına önceden; 4) (hiçbir microglia bulundu, ancak AWESAM kültürlerde defa) sadece yarısı o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Avrupa Araştırma Konseyi (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 ve SFB889) fon kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 tripsin-EDTAGibco2530005437 &m'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
%0.25 tripsin-EDTAGibco25200-05637 & Kullanmadan önce C su banyosu
B-27 takviyesiGibco17504-04450X stok
GlutamaxGibco35050-061100X stok
Penisilin / streptomisinGibco15070-06350 stok; penisilin: 5000 U/ml; streptomisin: 5000 ve mikro; g/ml
Nörobazal ortamGibco21103049L-glutamin
DMEMGibco41966029
HBEGFSigma4643
HEPESGibco15630080
FCSGibco10437028
PBSGibco100100491X
100 μ m naylon hücre süzgeciBD352360
Tripan MaviSigmaT8154 
Hücre kültürü inkübatörüThermo Fisher ScientificHera Cell 240i hücre kültürü inkübatörü
Laboratuvar çalkalayıcıHeidolphRotamax 120 Hücre kültürü inkübatörünün içinde kullanın
SantrifüjEppendorf5810 R 
HBSS Gibco 14170112

Kaynaklar

  1. Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
  2. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
  3. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  4. Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
  5. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  6. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  7. Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
  8. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26(2007).
  9. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
  10. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
  11. Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).
  12. Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
  13. Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
  14. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
  15. Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  16. Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
  17. Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Astrosit K lt rFare AstrositleriH cre zolasyonuDoku DiseksiyonuTrypsin EDTANB H MedyumuKalsiyum G r nt lemeKonfokal MikroskopiStelat Morfoloji
Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.