Bu eser dopaminerjik nöron hücre sayıları tarafsız stereological tahmini için adım adım bir protokol fare gözlemliyorum standart mikroskobu kullanýlýyor (Yani, bir ışık mikroskobu, bir motorlu nesne tablo (x, y, z nigra içinde sunar. uçak) ve kamuya açık yazılım dijital görüntü analizi için.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Optik Fractionator ve standart mikroskobu ekipmanlar kullanarak fare gözlemliyorum Nigra dopaminerjik nöron sayısının stereological tahmin
Bu makalede
Özet
Özet
Önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma, analiz miktar gözlemliyorum nigra içinde dopaminerjik nöron kaybı da dahil olmak üzere nigrostriatal sistemi esastır. Toplam dopaminerjik nöron sayısı tahmin etmek için tarafsız stereology optik fractionator yöntemini kullanarak şu anda altın standart olarak kabul edilir. Optik fractionator yöntemi arkasındaki teori karmaşık olduğu için ve stereology özel ekipman elde etmek zor olduğu için gerekli yazılımı dahil birkaç ticari olarak mevcut tam stereology sistemleri, tamamen var hücre için nedenleri sayma. Özel stereology Kur satın alma her zaman birçok nedenden dolayı mümkün olmadığına göre bir ışık mikroskobu, dahil olmak üzere standart mikroskobu kullanýlýyor dopaminerjik nöron hücre stereological tahmini sayar için bu raporu bir yöntem açıklanır bir nesne tablosu (x, y, z uçak) görüntüleme yazılımı ve analiz için bir bilgisayar ile motorlu. Adım adım açıklama stereological miktar optik fractionator yöntemini kullanarak gerçekleştirme konusunda verilir ve önceden programlanmış dosyaları tahmini hücre sayımları hesaplanması için sağlanır. Bu yöntem doğruluğunu değerlendirmek için piyasada bulunan stereology cihaz elde edilen verilere bir karşılaştırma gerçekleştirildi. Benzer hücre sayıları bu protokol ve stereology aygıt kullanarak böylece tarafsız stereology için bu protokolü duyarlık gösteren bulundu.
Giriş
Miktar nöronal hücre sayının gözlemliyorum nigra (SN)1,2içinde ateş düzeyini belirlemek için önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma çok önemli. Bölge hücre sayısı faiz tarafsız stereological tahmini altın standart3,4,5olarak kabul edilir.
Tarafsız stereology gelişiyle önce nöronlar gelmek içine bir bölümü görünürde değişken olasılıklar için düzeltmek için sınırlı sayıda hücre profilleri manipüle ederek bölümleri nöronların sayısı değerlendirildi. En sık kullanılan yöntemlerden birini ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
bakım ve hayvanların kullanımı için ilgili tüm uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergeleri takip edildi. Protokol Regierung von Unterfranken Wuerzburg, Almanya itibariyle yerel yetkililer tarafından kabul edildi.
1. doku işleme ve immünhistokimya
- Euthanize fareler CO 2 veya başka herhangi bir onaylanmış yöntemi. 70 mL 0.1 M PBS %4 paraformaldehyde (PFA) tarafından takip
- Perfuse altı 12 haftalık C56Bl/6N erkek fare transcardially ile 25-G iğne ve bir infüzyon pompa kullanarak 0.1 M fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 10 mL.
Uyarı: İngiltere'de yılın, alerjik, zehirli ve kanseroje....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sunulan yöntemi, TH + dopaminerjik nöron 7,363 ve 7,987 hücreler arasında değişmekteydi SN sağ ve sol SN, tahmini sayısı 7,446 ve 7,904 hücreler arasında kullanarak. Böylece, dopaminerjik nöron (± SEM) ortalama sayısı SN sağ ve sol SN için 66 7,675 ± 7,647 ± 83 hücreleri idi. Her hayvan için hesaplanan CE 0,08 düşüktü (aralığı: 0,073 0.079) (Şekil 7). Bu yöntem ticari olarak kullanılabilir ve özel stereology sistemleri ile karşılaştırılabilir tespit etmek içi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Stereology doku işleme ile başlar. Seri kesim SN doku stereological Çözümleme sırasında bölümler kaybını önlemek için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. Ayrıca, sağ sol SN stereology gerçekleştirirken ayırmak için bir Yarımküre işaretlemek için bir temel adım olduğunu. Beyin sapı üst kısmında küçük bir delik yerleştirerek en iyi sonuçları sunulan çalışmada oluşturulan. Ayrıca, immünhistokimya, antikor ve diğer kuluçka sıvı doku penetrasyon sırasında daha yaygın olarak kullanılan 5-10 µm yerine yaklaşık 30-4.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
C. W. ı. Merz eczacılık, LLC ve TEVA için bilimsel kurullarında hizmet vermiştir; Ipsen, Celal eczacılık, LLC ve Allergan, Inc.'a seyahat için fon aldı; ve hoparlör honoraria dışında gönderilen iş Merz, TEVA ve Allergan, Inc aldı. J. V. Boston bilimsel, Medtronic ve AbbVie için bir danışman olarak hizmet vermiştir ve honoraria Medtronic, Boston bilimsel, AbbVie, Bial, Allergan ve GlobalKinetics dışında gönderilen iş aldı.
Teşekkürler
Yazarlar, uzman teknik yardım Keali Röhm, Louisa Frieß ve Heike Menzel için minnettarız; Helga Brünner hayvan bakımı için için; ve Chistopher S. Ward için üretim ve dağıtım ImageJ yazılım için optik disector kılavuz eklentisi için.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Paxinos fare atlası | Fare Beyni George Paxinos Keith B.J.FranklinTelif Hakkı @2001 Academic Press CD Rom tasarımı ve Paul Halasz tarafından yaratılmıştır | ||
| beyin matrisi dilimleyici fare | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehit | Merck | 1040051000 | |
| sükroz /D (+) Sakkaroz | Roth | 4621.1 | |
| izopentan | Roth | 3927.1 | |
| gliserol | Merck | 1040931000 | |
| Etanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name< | strong>Company | Katalog Numarası | Yorumlar |
| fosfat tamponlu tuzlu su malzemeleri: | |||
| sodyum klorür | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potasyum dihidrojen fosfat | Merck | 1048731000 | |
| di-sodyum hidrojen fosfat dihidrat | Merck | 1065801000 | |
| normal keçi serumu | Dako | X0907 | |
| sığır serum albümini | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | deterjan |
| 3,3-Diaminobenzidin-tetrahidroklorid/DAB tabletleri 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2Osub<>2/ Hidrojen peroksit %30 | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reaktif | Thermo Scientific | 32050 | Standart Ultra Hassas ABC Boyama Kiti, 1:100 |
| tavşan anti fare tirozin hidroksilaz antikoru | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biyotinile keçi-tavşan karşıtı IgG H+L | vektör laboratuvarları | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator sürüm 11.07 | MBF | ||
| BX53 mikroskop | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ yazılımı | NIH | Sürüm 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| kuru buz | |||
| ızgarası kaplama eklentisi | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| hücre sayacı eklentisi | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optik disektör makrosu | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N erkek fareler | Charles River, Almanya | ||
| SuperFrost Plus kaplamalı nesne slaytları | Langenbrinck, Almanya | ||
| 25G iğne Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog İnfüzyon pompası | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator sistemi | StereoInvestigator sürüm 11.07 | ||
| BX53 mikroskop | BX53 mikroskop | ||
| kendinden çeşitli stereoloji | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
Kaynaklar
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).
- Ip, C. W., ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
