Yöntem makalesi

Optik Fractionator ve standart mikroskobu ekipmanlar kullanarak fare gözlemliyorum Nigra dopaminerjik nöron sayısının stereological tahmin

DOI:

10.3791/56103

⸱

1 Eylül 2017

 ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser dopaminerjik nöron hücre sayıları tarafsız stereological tahmini için adım adım bir protokol fare gözlemliyorum standart mikroskobu kullanýlýyor (Yani, bir ışık mikroskobu, bir motorlu nesne tablo (x, y, z nigra içinde sunar. uçak) ve kamuya açık yazılım dijital görüntü analizi için.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma, analiz miktar gözlemliyorum nigra içinde dopaminerjik nöron kaybı da dahil olmak üzere nigrostriatal sistemi esastır. Toplam dopaminerjik nöron sayısı tahmin etmek için tarafsız stereology optik fractionator yöntemini kullanarak şu anda altın standart olarak kabul edilir. Optik fractionator yöntemi arkasındaki teori karmaşık olduğu için ve stereology özel ekipman elde etmek zor olduğu için gerekli yazılımı dahil birkaç ticari olarak mevcut tam stereology sistemleri, tamamen var hücre için nedenleri sayma. Özel stereology Kur satın alma her zaman birçok nedenden dolayı mümkün olmadığına göre bir ışık mikroskobu, dahil olmak üzere standart mikroskobu kullanýlýyor dopaminerjik nöron hücre stereological tahmini sayar için bu raporu bir yöntem açıklanır bir nesne tablosu (x, y, z uçak) görüntüleme yazılımı ve analiz için bir bilgisayar ile motorlu. Adım adım açıklama stereological miktar optik fractionator yöntemini kullanarak gerçekleştirme konusunda verilir ve önceden programlanmış dosyaları tahmini hücre sayımları hesaplanması için sağlanır. Bu yöntem doğruluğunu değerlendirmek için piyasada bulunan stereology cihaz elde edilen verilere bir karşılaştırma gerçekleştirildi. Benzer hücre sayıları bu protokol ve stereology aygıt kullanarak böylece tarafsız stereology için bu protokolü duyarlık gösteren bulundu.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miktar nöronal hücre sayının gözlemliyorum nigra (SN)1,2içinde ateş düzeyini belirlemek için önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma çok önemli. Bölge hücre sayısı faiz tarafsız stereological tahmini altın standart3,4,5olarak kabul edilir.

Tarafsız stereology gelişiyle önce nöronlar gelmek içine bir bölümü görünürde değişken olasılıklar için düzeltmek için sınırlı sayıda hücre profilleri manipüle ederek bölümleri nöronların sayısı değerlendirildi. En sık kullanılan yöntemlerden birini quantified hücre sayımları Abercrombie6tarafından açıklanan düzeltme yapıldı. Bu yöntem aynı hücreyi parçaları bitişik ince bölümlerde bulunursa, hücreler birden çok kez sayılabilir dikkate almaya çalıştı. Bu nedenle, Abercrombie ve diğer yazarlar şekli, boyutu ve yönlendirmesi sayılan hücreleri7,8hakkında varsayımlar gerekli denklemler oluşturulan. Ancak, bu varsayımlar genellikle değil fark etti ve bu nedenle gerçek hücre sayısı (Yani, önyargı) sistematik hatalar ve ıraksak evrim süreçleri sonucu yol açtı. Ayrıca, önyargı ek örnekleme3tarafından azaltılabilir değil.

Optik fractionator kullanarak hücre sayıları stereological tahmini için doğrudan doğrudan birimindeki bir tanımlanmış, 3 boyutlu hücre sayıları tahmin etmek için matematik ilkeleri uygulanır. Bu yöntemin avantajı şekli, boyutu ve yönlendirmesi sayılır varlık hücre hakkında varsayımlar anlamına gelmez mi. Böylece, tahmini hücre sayıları için gerçek değerleri daha yakın olan ve örnek boyutu (Yani, tarafsız)3arttıkça daha yakın olsun. Birçok kural stereology yöntemi tarafsız tutmak için kullanılırken izlenmesi gerekir çünkü, kullanıma hazır ticari stereology sistemleri geliştirilmiştir (gözden geçirme için bkz: Schmitz ve Hof, 20054). Özel stereology sistemlerinin uygulanması Tasarım temelli stereological yöntemleri ile tanımlanan bir priori sonda ve örnekleme düzenleri şekil, boyut, kayma dağıtım ve yönlendirmesi'dan bağımsızlığını yol stereological değerlendirmeler için hücreleri analiz4,9olmak. Ancak, piyasada bulunan stereology sistemleri pahalıdır; Bu yeni araştırma uygulamasında sınırlayabilir.

Bu çalışmada dopaminerjik hücre sayıları Mouse optik fractionator yöntemle contalı profillerde hem standart mikroskobu donanımları (Yani, ışık kullanarak SN, Tasarım temelli stereological tahmini için kullanışlı bir teknik geliştirmekti mikroskop, standart mikroskop bilgisayar yazılımı ve motorlu bir x, y, z sahne). Bunun için fare beyin dokusunu işlemek ve tarafsız stereology tasarım tabanlı kullanarak SN hücre sayıları tahmin hakkında adım adım yönergeler sunulmaktadır. Ayrıca, tahmini hücre sayıları hesaplama ve katsayıları hata (CE) için şablonlar sağlanır.

Burada açıklanan yöntemi SN analiz için sınırlı değildir, ancak fare ya da sıçan beyin anatomik olarak tanımlanmış diğer bölgelerinde kullanmak için adapte edilebilir. Örneğin, tarafsız stereology nöronal hücre sayıları Hipokampus10 ve11locus coeruleus tahmin etmek için kullanılan. Buna ek olarak, nöronlar, astrocytes1312 ve microglia gibi farklı hücre tipleri de değerlendirilebilir. Bu nedenle, bu yöntem tarafsız stereology onların araştırma uygulamayı istediğiniz ama çok stereology sistem satın almak için para harcamaya istekli olmayan bilim adamları için yararlı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bakım ve hayvanların kullanımı için ilgili tüm uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergeleri takip edildi. Protokol Regierung von Unterfranken Wuerzburg, Almanya itibariyle yerel yetkililer tarafından kabul edildi.

1. doku işleme ve immünhistokimya

  1. Euthanize fareler CO 2 veya başka herhangi bir onaylanmış yöntemi.
    2. 70 mL 0.1 M PBS %4 paraformaldehyde (PFA) tarafından takip
  2. Perfuse altı 12 haftalık C56Bl/6N erkek fare transcardially ile 25-G iğne ve bir infüzyon pompa kullanarak 0.1 M fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 10 mL.
    Uyarı: İngiltere'de yılın, alerjik, zehirli ve kanserojen.
  3. Bir beyin matris dilimleyici bölgesinin +0.74 mm Bregma (şekil 25, Paxinos ve Franklin fare beyin atlas 14) üzerinden, koronal düzlemde fare beynini incelememize.
  4. SN, %4 oranında dahil beyin, dorsal parçası koymak daldırma-fiksasyon için 4 ° C'de 1 d 0.1 M PBS PFA.
  5. PFA cryo-koruma için % 30 Sükroz/0,1 mol PBS çözüm için döviz ve için başka bir 2 d 4'te kuluçkaya ° C.
  6. Bir cryomold beynine dorsal parçası dolu en uygun kesme sıcaklık (OCT) ile yerine bileşik ve yavaş yavaş sıvı kuru buz-serin isopentane doku dondurmak.
    Uyarı: Kuru buz son derece soğuk (-78 ° C); Kuru buz ile çalışırken eldiven, dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (PPE), kullanın. Kuru buz CO 2 ' buharlaşır; Bu nedenle, bir duman başlık altında çalışmak.
  7. Seri olarak 30 µm cryo-bölümler koronal düzlemde kesmek ve 2,46 mm Bregma (şekil 51, Paxinos ve Franklin fare beyin atlas 14) arasında başlayan ve Bregma 4,04 mm'den at bitiş bölümleri toplamak (şekil 64, Paxinos ve Franklin fare beyin atlas 14).
  8. Dört serisi cryoprotectant (% 30 gliserol, 0 ethoxyethanol ve % 40 PBS)-20 ° C'de dolu tüpler saklayın Beyin sapı üst bölgeye küçük bir delik delme tarafından sağ hemisfer parça işlem sırasında işaretlemek.
  9. İmmunohistokimyasal boyama için fare başına bölümleri bir dizi seçin. Preincubate serbest yüzer bölümleri için 1 h % 10 normal keçi Serumda (0,1 mol bir shaker PBS NGS)/2% BSA/0.5% deterjan. Gece 4'te % 2 NGS/2% BSA/0.5% deterjan 0,1 mol PBS içinde seyreltilmiş tavşan Anti-fare tirozin hidroksilaz (TH; 1:1,000 seyreltme) antikor ile bölümleri kuluçkaya ° C.
    10. Tavşan karşı
  10. Uygula ikincil antikor IGS (1: 100 seyreltme) oda sıcaklığında 2 h için avidin/biotin reaktif (1: 100 seyreltme) tarafından takip ettim. Kuluçkaya ve 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) ve H 2 O 2 ile leke. Bölümleri kaplamalı nesne slaytlarda boyama sonra mount.
    Not: TH + dopaminerjik SN nöronlar Şekil 1a ile gösterilir. Bir seri boyama tarafından ortalama 13 SN kesitler rostral SN pars compacta (SNpc) ve reticulata, Kaudal kısımları uzanan, lekeli hayvan ( Şekil 1b). Bölümleri 120 µm (1/4 serisi) tarafından ayrılır ( şekil 1 c).
    Uyarı: DAB şüpheli bir kanserojen olduğu. İletişim ve inhalasyon tarafından zehirlidir. DAB ile çalışırken KKE kullanın.

2. Görüntüleri edinimi

  1. TH yakalamak immunohistochemically lekeli dijital mikroskop için birleştiğinde düşsel bilgisayar yazılımı kullanma SN bölümlerine. Bir dizi her bölümü ayrı ayrı analiz.
  2. Düşsel bilgisayar yazılımı inceden inceye gözden geçirmek Slayt seçeneğini kullanın. Yüksek-nitelik imge (Şekil 2) için TIFF biçiminde kaydetme.
    Not: Görüntü çözümlemesidir 312 piksel / cm.
  3. Basın " al " (şekil 2a) edinme penceresini açmak için.
  4. Ayarla binning " 2 " gri tonlamalı görüntüler için.
    Not: Renkli resimlerin yerine gri tonlamalı görüntüleri edinimi son yığın görüntü dosyası (şekil 2a) küçültür.
  5. Tıklayın " göstermek yaşamak " bölümünün canlı görüntü gösteren yeni bir pencere açmak için edinme pencerede (Şekil 2 bir ve b).
  6. Tıklayın " sahne " edinme penceresinde. Seçin " tarama slayt " açılır menü ve onay kutusu (Şekil 2 c).
    Not: Bu satın alma ve son derece büyütülmüş SN görüntüleri (630 X büyütme) x, y-uçak gibi üst üste görüntüleri düzlemde z-13 µ toplam aralığını kapsayan, 1 µm arasındaki mesafe ile yığın görüntüleri edinimi hizalamasını sağlar m.
  7. SN için aramak için 2.5 X hedefi seçin.
  8. 63 amacı değiştirmek
  9. Yanında tıkırtı üstünde sol üst köşesinde (TopLeft) (Şekil 2 c) ve sağ alt köşesinde (LowRight) (şekil 2B) bölümü tanımlar " kümesi. "
  10. Tıklayın " Z-serisi " ve kontrol " Z-uçak serisi " kutusu (şekil 2e).
  11. Belirleme gerçek takılı kalınlığı üç rasgele seçilen sayma, bölümlerin siteleri görüntüleme yazılımı kullanarak bölüm başına. Bunun için tıklayın " görünümü üst kayan " (şekil 2e) bölümünün üst tanımlamak ve o zaman tıkırtı üstünde " durdurmak görünümü üst " (şekil 2f). Bundan sonra tıklayın " görünümü alt ofset " (şekil 2f) ve o zaman tıkırtı üstünde " durdurmak görünümü alt " (Resim 2 g). Bölüm kalınlığı yazmak.
  12. Baştan çıkarma 3 µm (guard zone) ofset ve sonuç en iyi mahsup yuvaya (Şekil 2 h) yazın. 13 µm (optik disector yüksekliği) üst mahsup numaradan çıkarma ve sonucu alt mahsup yuvasına (şekil 2i) yazın. Aşağıdaki parametreleri seçin: adımlar, 14; Boyut, 1.00 (şekil 2i).
    Not: Bu ardışık görüntüler arasında 1 µm mesafe ile 13 µm, z-bir düzlemde bir kalınlığı karşılık gelir.
  13. (Şekil 2j) dosyayı kaydetmek istediğiniz dizini seçin.
  14. Tıklayın " sıra " edinme (şekil 2j) başlatmak için.
  15. Tıklayın " işleme " ve aşağıdaki parametreleri seçin: " tüm uçaklar, " üzerinden " sıra; " " montaj; " ve " hızlı " ve " dikiş " kutuları, resim örtüşen % 10 (Şekil 2 k). Yanında tıkırtı üstünde belgili tanımlık imge dikiş başlamak " başlatmak ".
    Not: Bu analiz için yığın görüntü oluşturur (Şekil 2 l, şekil 3a -e).

3. Stereological değerlendirme sırasını

  1. SN yığını görüntüleri NIH ImageJ yazılım sürümü 4.7 kullanarak Çözümlemeyi gerçekleştirmek.
  2. ImageJ.nih.gov web sitesinden gerekli olan iki eklentileri download: " kılavuz yerleşimi " eklenti 15 ve " hücre Counter " eklenti 16. Her iki eklentileri bölümünde açıklandığı gibi yükleyin.
  3. Tarafsız stereological değerlendirmesi için sayım parametreleri aşağıdaki gibi tanımlayın: ızgara boyutunu, 130 x 130 µm; sayım çerçeve, 50 x 50 µm; ve optik disector yükseklik, 13 ve #181; m.
  4. Açık görüntü yanında tıkırtı üstünde " dosya " → " açık " (şekil 4a) kullanarak görüntü ölçeği ayarlayın " analiz " → " ölçeği ayarla " komut (şekil 4b). Bu adımda, tanımlı boyutunu piksel uzakta µm (şekil 4 c) değiştirmek.
    Not: analiz görüntülerde 425 piksel karşılık gelen için 100 µm.
  5. Select " eklentileri " → " kılavuz " → " ızgara türü: satır " rasgele bir kılavuz eklemek için komut. Kontrol " rasgele ofset " kutusu. 130 µm x 130 µm kılavuz (kılavuz-kare) içinde bir kare boyutunu define = 16.900 µm 2 (şekil 3b ve şekil 4 d ve e).
  6. Değiştir resim türü üzerinden 16-bit RGB renk için (tıklayın " resim " → " türü " → " RGB renk ") (şekil 4f). Baquet vd tarafından açıklandığı gibi SNpc bulun 17. SNpc ile çembere " Boya Fırçası aracını " (fırça genişliği: 11) ( şekil 3 c ve şekil 4 g -ı).
  7. Geri alma " ölçeği ayarla " komutunu tıklatarak " analiz " → " ölçeği ayarla " → "'ı tıklatın Kaldır Ölçekle " (şekil 4j -l) piksel hesaplamalarda performansını oldukça etkinleştirmek için µm daha.
  8. Bir ekran görüntüsü (şekil 4 m) yapmak, kurtarmak imge eğe ve ImageJ (şekil 4n) ile yeni bir dosya açın. Seçin " noktası " (şekil 4o) ve fırça genişliği 25 (şekil 4 p). Her kılavuz-kare için bir optik disector (şekil 4q) yerleşimini SN o kartvizitleri iþaretleyin. Tam yerelleştirilmiş tüm optik disectors veya kısmen Seviyelendirilmiş SN içinde cep numarasını analizini gerçekleştirmek.
  9. SN bölümlerini içeren bir kılavuz-kare seçin. Bu kare x ve y tanımlamak için ImageJ içindeki imleç ile sol üst köşesinde koordinatları (4r rakam ile) başlatmak için ölçü.
    Not: Koordinatları kullanarak konumlandırma optik disector için eklenir " optik disector konumu " (Adım 4'te açıklandığı gibi şekil 4'ler),.
  10. Optik disector pozisyon başlıklı elektronik tablo şablonu kullanarak hesaplama " optik disector pozisyon, " adım 4'te açıklandığı gibi.
  11. Kalibre optik disector (Christopher S. Ward, Ek dosya tarafından yazıldı makro) yanında tıkırtı üstünde " eklentileri " → " makroları " → " düzenleme " (şekil 4t), açık " opt_dis_ Grid.txt " dosya (4u rakam) ve boyutunu define " usergrid " x ile y boyut-in görme duyusuyla ilgili disector (şekil 4v) karşılık gelen piksel cinsinden. Usergrid bir tarafı boyutunu 212.5 piksel (50 x 4.25 piksel) tanımlanan 50 µm x 50 µm, boyutunu seçin.
  12. Optik disector (şekil 4v) ortasına tanımlayan ImageX ve ImageY koordinat ekleyerek yığın görüntü optik disector konumunu belirleyin. Makroyu çalıştırmak (" makroları " → " Makro Çalıştır ") (şekil 4w).
    Not: Kılavuz ( 3d şekil ve 4 x rakam) yığın görüntüden kaybolur olacaktır. Optik disector z-düzlemde ( 3e anlamaya ve 4 x rakam) taşırken devam edecek.
  13. Select " eklentileri " → " hücre Counter " hücre sayaç eklentisi (şekil 4y) başlatmak için. Hücre Sayacı başlatmak ve bir işaret türü (şekil 4z) seçin. Resmi yakınlaştırmak (tıklayın " + ") ve % 200 bir büyütmede hücre sayıları stereological değerlendirmesi gerçekleştir.
  14. Tespit dopaminerjik nöron perikarya onların yuvarlak veya oval şekil ve hücre boyutuna göre ( Şekil 1a). Stereological kuralları kullanarak hücre sayısını ölçmek.
    Not: optik disector 3 boyutlu küp ( şekil 5a) olduğundan, dışlama taraf olarak ön, sol ve küp (kırmızı) üst kenarlarında tanımlayın. Bu nedenle, don ' t sayısı TH + hücreleri (sağ ve sol açık) kırmızı çizgi ya da üst yan temas geliyor. Hücre sayımları sonuçlarını başlıklı hazırlanmış elektronik tablo dosyasına ekleyin " hücre sayısı hesaplanması " (5. adım).
  15. Göre SN resmi, sonraki kılavuz-kare sonraki hücre sayısı için optik disector yerleştirileceği hesaplamak kullanarak x, y adımlar örten kılavuz ( şekil 5b) boyutunu ve " optik disector pozisyon " elektronik tablo şablonu, adım 4'te açıklandığı gibi.
  16. Kullanarak hücre bir tahmini gerçekleştirmek " hücre sayısı hesaplanması " elektronik tablo (5. adım).

4. Optik Disector konumunu kullanarak hesaplama " optik Disector konumu " elektronik tablo şablonu

  1. hesaplamak, boyutunu ve konumunu SN (anahat içinde örten kılavuz içine yerleştirilmesini optik her disector şekil 5b) kullanarak " optik disector position.xlsx " elektronik tablo dosyası (Ek dosya).
  2. Ekle µm, her piksel için dönüşüm tarafından tanımlanan " ölçeği ayarla " komutu, sarı işaretli konumlarını içine " optik disector position.xlsx " dosya ( şekil 6a ve ek dosya ).
  3. INSERT optik disector planlanan boyutunu ve kılavuz-kare (µm), bir tarafta uzunluğu tarafından tanımlanan üstteki kılavuzunun boyutunu portakal işaretli pozisyonlar.
    Not: Sonuçları turuncu kutu yanındaki kırmızı kutuları içinde tasvir edilmektedir.
  4. Başlangıç noktası olarak belirlendi SN anahat içinde kılavuz Meydanı ile başlar (bir kılavuz-kare seçildi, adım 3.9, olduğu gibi yukarıda).
  5. x ve y koordinatları, adım 3.9, dosyanın yeşil kutularına (bu değerleri, x, y koordinatları için bu ilk kare içinde optik disector ortasına hesaplanır ve sonuçları mavi kutu içinde tasvir edilmektedir kullanarak) ölçülen ekle. Opt_dis_grid.txt (Ek dosya) makroyu.
  6. Hesaplamak x, y koordinatları ardışık optik disectors (kareler cinsinden ölçülür) kılavuz-kare mesafe ilk kılavuz-kare (kahverengi kutular) göre ekleyerek.
    Not: + x: Kılavuz-kare sağda yer alır; -x: Kılavuz-kare sola; bulunur + y: Kılavuz-kare için alt yer alır; -y: Kılavuz-kare başına bulunur. Sonuçlar gri kutularında gösterilir.

5. Cep numarasını kullanarak tahmini " hücre sayısı hesaplama " elektronik tablo

  1. hesapla TH + SN hücre formülü kullanarak hayvan (N) başına tahmini sayısı Yayınlandı tarafından Batı ve ark., 1991 3, nerede ∑ Q - bir beyin bölümü tüm optik disectors içinde sayılan TH + nöronlar toplam sayısı olarak tanımlanır.
    Not: Optik disector (h) ile ilgili olarak ölçülen kalınlığı (t) bölümünün yüksekliğini denklemde dahildir. Alan örnekleme kesir (asf) optik disector (optik disector) çerçeve boyutu kılavuz (x, y adım) kare boyutunu içinde alan (A) oranı olarak tanımlanır (optik disector/A x, y adım) ( şekil 3b) ve Bölüm örnekleme kesir (ssf) bütün seri olarak kesilmiş beyin bölümlerini oranı tanımlanır:
    figure-protocol-1
    yüksek kaliteli nicel sağlamak, tahminleri katsayısı hata (CE) 0,10 düşük olmalıdır. Keuker ve ark tarafından formülü kullanarak CE belirlemek., 2001 10:
    figure-protocol-2
  2. her hücre sayısı içinde belgili tanımlık SN stereological tahmini için fare, fare başına oluşturulan serisi toplam sayısı, optik disector, x, y alan optik disector (optik bir disector, µm 2), x, y alan kılavuz kare (x, y adım yüksekliği ile ilgili olarak belirtilen bilgileri ekle µm 2), ve ortalama ölçülen kalınlığı bölümünde (µm) kullanarak sarı kutulara " hücre count.xlsx hesaplanması " elektronik tablo dosyası ( şekil 6b ve ek dosya ).
  3. Analiz her SN bölümüne aynı hayvan, adım 5'te açıklandığı gibi.
  4. Insert Hücre sayar optik her disector gri kutularındaki için her satır bir SN bölümüne atıfta, kullanarak " hücre count.xlsx hesaplanması " elektronik tablo dosyası (Ek dosya).
    Not: Tahmini cep telefonu numarasını ve hesaplanan CE mavi kutu ( şekil 6b) tasvir edilmektedir.

6. Bir ticari olarak kullanılabilir Stereology sistem kullanarak hücre sayının tahmin

  1. Başlangıç dopaminerjik SNpc tahmini cep numarasını tıklayarak " sondalar " → " optik Fractionator iş akışı " optik Fractionator açmak için İş akışı pencere.
    Not: Yeni bir pencere olacaktır SN yeni bir dizi sayılması olup olmayacağını belirlemek için açılır pencere.
  2. Tıklatarak TH + SN bölümleri yeni bir seri başlatmak " yeni bir konu başlatmak " açılan pencerede.
  3. Optik Fractionator iş akışı farklı adım adım gitmek. İlk adım konu ayarlayın. Bunun için araştırmacı Ekle ' s adı, konu ' s adı (SN grubu) ve diğer yararlı bilgiler. Bu SN için saymak için bölümlerin numaralarını ekleyin. Kesme doku bölümleri kalınlığı yerleştirin. Bu durumda dörttür bölüm aralığı ekleyin. Rastgele belirlenen bölüm numarası ile başlamak ekle.
  4. İkinci adımda, mikroskop büyütme (2 X amaç) düşük ve seçmek için ayarla " 2 X Mag mercek " menüsünden.
  5. Adım 3'te, faiz Baquet ve ark tarafından açıklandığı gibi SNpc olan sol fare tuşu ile bölgenin izini., 2009 17.
    6. 4. adımda yüksek büyütme için mikroskop
  6. ayarlayın. Bunun için hedefi 100 X değiştirmek ve seçin " 100 X Mag objektif " açılır menüden.
  7. Odaklanarak adım 5'te üst ve alt kısmındaki kısmına monte kalınlığı ölçmek.
  8. Adım 6, 50 x 50 µm sayım çerçeve boyutu tanımla; bu optik disector (x, y) boyutudur.
  9. 7. adımda sistematik rastgele örnekleme (SRS) kılavuz boyutu 130 x 130 µm ayarlayın.
  10. 3-µm koruma bölgesi 8. adımda girin.
  11. Adım 9 ayarları kaydetmek.
  12. Son olarak, her optik disectors içinde adım 10 optik Fractionator iş akışı SRS kılavuzunda TH + dopaminerjik hücreleri saymak. Bunun için yanında tıkırtı üstünde başlamak " Counting " düğmesini.
  13. Bir bölümü bitirdikten sonra tıklayın " sonraki bölüme başlar " aynı SN serisi sonraki SN bölümünün optik Fractionator iş akışını başlatmak için düğmeyi.
  14. Sayısal bir SN serisi son SN bölümünü ne zaman tıkırtı üstünde " ben ' ve tamamlandı sayım. "
  15. Tıklayın " sonuçları göster " stereology örnekleme sonuçlarını görüntülemek için düğmeyi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan yöntemi, TH + dopaminerjik nöron 7,363 ve 7,987 hücreler arasında değişmekteydi SN sağ ve sol SN, tahmini sayısı 7,446 ve 7,904 hücreler arasında kullanarak. Böylece, dopaminerjik nöron (± SEM) ortalama sayısı SN sağ ve sol SN için 66 7,675 ± 7,647 ± 83 hücreleri idi. Her hayvan için hesaplanan CE 0,08 düşüktü (aralığı: 0,073 0.079) (Şekil 7). Bu yöntem ticari olarak kullanılabilir ve özel stereology sistemleri ile karşılaştırılabilir tespit etmek içi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stereology doku işleme ile başlar. Seri kesim SN doku stereological Çözümleme sırasında bölümler kaybını önlemek için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. Ayrıca, sağ sol SN stereology gerçekleştirirken ayırmak için bir Yarımküre işaretlemek için bir temel adım olduğunu. Beyin sapı üst kısmında küçük bir delik yerleştirerek en iyi sonuçları sunulan çalışmada oluşturulan. Ayrıca, immünhistokimya, antikor ve diğer kuluçka sıvı doku penetrasyon sırasında daha yaygın olarak kullanılan 5-10 µm yerine yaklaşık 30-4...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. W. ı. Merz eczacılık, LLC ve TEVA için bilimsel kurullarında hizmet vermiştir; Ipsen, Celal eczacılık, LLC ve Allergan, Inc.'a seyahat için fon aldı; ve hoparlör honoraria dışında gönderilen iş Merz, TEVA ve Allergan, Inc aldı. J. V. Boston bilimsel, Medtronic ve AbbVie için bir danışman olarak hizmet vermiştir ve honoraria Medtronic, Boston bilimsel, AbbVie, Bial, Allergan ve GlobalKinetics dışında gönderilen iş aldı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, uzman teknik yardım Keali Röhm, Louisa Frieß ve Heike Menzel için minnettarız; Helga Brünner hayvan bakımı için için; ve Chistopher S. Ward için üretim ve dağıtım ImageJ yazılım için optik disector kılavuz eklentisi için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Paxinos fare atlasıFare Beyni George Paxinos Keith B.J.FranklinTelif Hakkı @2001 Academic Press CD Rom tasarımı ve Paul Halasz tarafından yaratılmıştır
beyin matrisi dilimleyici fareZivic InstrumentsBSMAS 001-1
paraformaldehitMerck1040051000
sükroz /D (+) SakkarozRoth4621.1
izopentanRoth3927.1
gliserolMerck1040931000
EtanolSigma Aldrich32205-1L
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıYorumlar
fosfat tamponlu tuzlu su malzemeleri:
sodyum klorürSigma Aldrich31434-1KG-R
potasyum dihidrojen fosfatMerck1048731000
di-sodyum hidrojen fosfat dihidratMerck1065801000
normal keçi serumuDakoX0907
sığır serum albüminiSigmaA4503-100G
Triton X-100Sigma AldrichX100-100mldeterjan
3,3-Diaminobenzidin-tetrahidroklorid/DAB tabletleri 10mg pH 7.0Kem En Tec4170
H2Osub<>2/ Hidrojen peroksit %30Merck1072090250
avidin/biotin reaktifThermo Scientific32050Standart Ultra Hassas ABC Boyama Kiti, 1:100
tavşan anti fare tirozin hidroksilaz antikoruabcamAb1121:1000
biyotinile keçi-tavşan karşıtı IgG H+Lvektör laboratuvarlarıBA-10001:100
StereoInvestigator sürüm 11.07MBF
BX53 mikroskopOlympus
VisiviewVisitron Systems GmbH3.3.0.2
Axiophot2Zeiss
ImageJ yazılımıNIHSürüm 4.7
Tissue-TEK OCTSakura4583
kuru buz
ızgarası kaplama eklentisiWayne Rasbandhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
hücre sayacı eklentisiKurt de Voshttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
optik disektör makrosuChristopher Ward
C57Bl/6N erkek farelerCharles River, Almanya
SuperFrost Plus kaplamalı nesne slaytlarıLangenbrinck, Almanya
25G iğne Microlance 3BD300400
REGLO Analog İnfüzyon pompasıIsmatecISM 829
StereoInvestigator sistemiStereoInvestigator sürüm 11.07
BX53 mikroskopBX53 mikroskop
kendinden çeşitli stereolojiVisiview
Axiophot2Axiophot2
potasyum klorür Merck 1049360500

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).
  2. Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
  3. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
  4. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  5. Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316(2011).
  6. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
  7. Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
  8. Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
  9. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  10. Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
  11. Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
  12. Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881(2011).
  13. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
  15. Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
  16. De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
  17. Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
  18. Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
  19. German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
  20. Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare BeyniTirozin HidroksilazTarafs z StereolojiH cre Say mG r nt Analizi

İlgili makaleler