Yöntem makalesi

Su Macroinvertebrates kullanma gruba özel rDNA astar genetik Gut içerik analizleri için laboratuvar iletişim kuralı

DOI:

10.3791/56132

⸱

5 Ekim 2017

 , 
1Institute for Environmental Sciences, University of Koblenz-Landau, 2Institute of Integrated Natural Sciences, University of Koblenz-Landau, 3IV 2.5 (Trace Analysis, Artificial Pond and stream system), Federal Environment Agency

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En yaygın bağırsak içeriği macroinvertebrates, görsel analizlerdir. Av organizmaların morfolojik çeşitlilik hakkında yoğun bilgi gerektiren, onlar yumuşak gövdeli yırtıcı özledim ve, nedeniyle güçlü ezme yırtıcı solungaçlarınızı de dahil olmak üzere bazı organizmalar için neredeyse imkansız. Biz macroinvertebrate için detaylı, yeni genetik yaklaşımlar diyet tanımlaması solungaçlarınızı av sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gıda ağları analiz daha iyi ekosistemler anlamak için önemlidir. Örneğin, gıda web etkileşimleri yerli olmayan türler tarafından işgal kaynaklanan şiddetli değişikliklerin uygulayabilir. Ancak, tam tanımlayıcı alan avcı-av etkileşimlerin çoğu zaman zordur. Bu analizler kez bağırsak içeriğinin görsel bir değerlendirme veya kararlı izotop oranları (δ15N ve δ13C) analizine dayalı. Morfolojik çeşitlilik veya bireysel av organizmalar, av organizmalar tam tanımlaması engelleri önde gelen izotopik imzadan, yaklaşık, sırasıyla, kapsamlı bilgi tür yöntemler gerektirir. Maserasyon, sindirim ve sindirim av organizmalar belirli türler tanımlaması zor yapmak çünkü görsel gut içerik analizleri özellikle yumuşak gövdeli yırtıcı organizmalar, hafife. Bu nedenle, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dayalı stratejiler, örneğin gruba özgü astar kullanımını ayarlar, gıda web etkileşimleri soruşturma için güçlü bir araç sağlar. Burada, nükleer ribozomal deoksiribonükleik asit (rDNA) için gruba özgü astar kümeleri kullanarak alanından macroinvertebrate tüketici gut içeriğini incelemek için ayrıntılı iletişim kurallarını açıklar. DNA olabilir tüm örnekler (söz konusu olduğunda küçük takson) ya da hulâsa ya da bağırsak içeriği alanında toplanan örneklerin dışında. Varlığı ve fonksiyonel etkinlik DNA şablonları doğrudan test bireysel onaylanması gereken evrensel astar kullanarak ayarlar DNA'ın ilgili alt birimi hedefleme. Biz de tüketilen av türler düzeyine PCR ile değiştirilmemiş gruba özgü astar ile daha da polyacrylamide Jeller kullanarak sonraki tek iplikçik uyum çok biçimlilik (SSCP) analizleri ile kombine belirlenebilir göstermek. Ayrıca, biz farklı floresan boyalar etiket olarak DNA parçaları farklı av gruplarının otomatik parça analizi yoluyla birden fazla gut içerik örnekleri için paralel tarama sağlar gösterir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trofik etkileşimleri ve gıda web dynamics çoğunluğu teşkil, avcı-av etkileşimleri Cerayanlar madde ve enerji gıda ağları içinde ve ekoloji ana hedeflerinden biri, ekosistemler arasında boyunca karakterize etmek için önemli yönleri vardır 1. kaynak belirlenmesi ve karbon ve besin akışını ekolojik bağlantı ekosistemler2arasında anlayışı sürdürmek. Ancak, ekosistemler nehirler ve onların popülasyonuna gibi sadece tozlar organik madde ve besin aynı zamanda organizmaların3hareketleri bağlantılı değildir. Böylece, bu sistemleri bağlantı kaynak akışının kesintiye uğratmasını habitat değişiklikler şiddetle her iki ekosistemlerin gıda ağları sadece doğrudan ama aynı zamanda dolaylı olarak avcı-av topluluklar ilgili kompozisyon değiştirerek değiştirebilirsiniz. Örneğin, gıda ağları değişiklikleri tek avcı türler (örneğin, gökkuşağı alabalığı)4hareketleri için bağlanacak şekilde gösterilmiştir. Bu tür değişiklikleri potansiyel biyolojik çeşitlilik ve sucul ekosistemler işleyişini tehdit. Bu nedenle, alan avcı-av etkileşimleri analiz su yönetimi uygulamaları, sucul ekosistemlerin doğal biyolojik çeşitlilik gibi insan kaynaklı çevresel değişikliklerin etkisini belirlemek için önemlidir.

Trofik bağlantıları izleme karmaşık sistemlerinde zor olduğu için birkaç yaklaşım bu etkileşimleri alan5' te beslenme değerlendirmesi etkinleştirmek kurulmuştur. Geleneksel olarak, araştırmalar alanında etkileşimleri beslenme disseke cesaret av kalıntıları görsel tanımlama temel alır ve morfolojik av çeşitlilik hakkında geniş bir bilgi gerektirir. Görsel gut içerik analizleri anlayışlar kaynak kullanımında tüketiciler (Örneğin, mevsimsel değişimi diyet ıstakoz6 ve balık7,8 ya da beslenme tercihleri kopepodların) çeşitli gruplar hazırladık. Ancak, fiziksel sindirim sürecinin görsel gut içerik analizleri zor yapar ve genellikle yumuşak gövdeli yırtıcı-organizmalar9özlüyor. Türler tarafından sıvı sindirim besleme veya yoğun bir şekilde yemek yeme, solungaçlarınızı gibi önce comminute omurgasız bazı tüketiciler için görsel avcı türlerin bağırsak içeriği imkansız10tanımlamasıdır. Bu sınırlamalar nedeniyle, moleküler analiz umut verici bir alternatif sağlar.

Moleküler analiz şimdi hızlı ve hassas bir av algılama bağırsak içeriği sağlayan ortak bir araç haline gelmiştir. Bu tür teknikler farklı aralığıdır: monoklonal antikorlar veya Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) temel stratejileri sıkça kullanılır, onların yüksek özgüllük ve duyarlılık11yüzünden. Yeni monoklonal antikorlar geliştirme zaman ve maliyet yoğun, antikorlar zaten11mevcut bu nedenle, diğer moleküler tekniklerin uygulanması daha yararlıdır. Başka bir ortak yaklaşım deoksiribonükleik asit (DNA), ribozomal ribonükleik asit (RNA) genleri evrensel astar kullanarak çoğu türler içinde mevcut gibi bölgelerinde amplifikasyon12,13çalıştırabilmenizdir. Bu tekniği kullanırken, sık sık av organizmaların DNA14karışık kaynakları içinde bütün dizi tanımlamak mümkün değildir. Böyle bir dezavantajı önlemek için etkili bir yaklaşım gruba özgü astar kullanmak için genetik gut içerik analizleri için ayarlar olduğunu. Belirli hedef gruplar yalnızca DNA bölgelerinde yükseltmek veya tüm diğer türler15,16çıkartmak için tasarlanmış, gruba özgü astar kimlik belirtilen gruplardan taksonomik düzeyde av organizmaların etkinleştirmek zaman ve maliyet yoğun ikincil analizleri. Ancak, tüm içerik analizi gut gibi bu tür analizleri beslenme davranışı yalnızca anlık görüntü sağlar. Bu nedenle, moleküler gut içerik analizleri zaman entegre doğal tarayıcıları (Örneğin, kararlı izotop) analizleri ile birleştirerek yararlı1,2olarak kabul edilir.

Burada, aynı numune kararlı izotop analizi ile birleştirilmek üzere nükleer ribozomal DNA (rDNA) bölgeleri için gruba özgü astar kümeleri kullanarak avcı-av etkileşimlerin PCR tabanlı araştırmalar için detaylı bir yöntem açıklanmaktadır. Biz tek av grupları özel Jel Elektroforez ile DNA tespiti tanımlamak. Ayrıca, daha yüksek taksonomik çözünürlüğe primerler özgüllüğü daha gerekli olduğunda daha da aşağı akım analizleri böyle gruba özgü astar geçerli PCR ürünleri için bir fırsat sunuyoruz. Tek iplikçikli DNA (ssDNA) onların birincil sıra17tarafından belirlenir formu Tersiyer biçimler parçaları çünkü böyle gruba özgü astar tarafından güçlendirilmiş parçaları küçük değişimler konformasyon değişikliklere yol açar. Bu tür değişiklikleri tek iplikçik uyum çok biçimlilik (SSCP) analizleri ile polyacrylamide jeller17,18(tür düzeyine) av organizmaların daha kesin bir kimlik etkinleştirme, tarafından tespit edilebilir.

Özel Jel Elektroforez DNA parçalarının görselleştirmek ve onların yaklaşık uzunluğu19, çözünürlüğünü belirlemek için yaygın ve ucuz bir araç DNA miktarına bağlıdır ve boyama boya20kullanılan iken. Genellikle, görselleştirme yalındır saf DNA örnekleri ile çalışırken olmakla beraber av potansiyel olarak düşük miktarda özel Jel Elektroforez sonuçlarını puanlama DNA tüketici gut içeriğini karmaşık hale getirebilir. Yine de, bu algılama yöntemi alanından tüketici örneklerin düşük bir sayı için bir ekran için uygun veya birkaç grupları av, ama komplikasyon puanlama yapar örnekler çok sayıda tarama için birden çok av takson son derece zaman yoğun ve böylece uygulanamaz. Daha duyarlı bir algılama yöntemi parçaları ayrıca parçaları21tam olarak uzunluğunu tayini sağlar Kapiler Elektroforez ile otomatik analizidir. Birkaç microsatellite dayalı çalışmalar farklı floresan boyalar etiket olarak kullanarak, bu tespit ve karşılaştırılabilir uzunluğu farklı parçaları otomatik parça analizi22,23tarafındanbelirlemek mümkün olduğunu göstermiştir, 24. Bu nedenle, biz de detaylı bir protokol için birden çok av DNA'ın paralel algılama etiketli gruba özgü astar setleri ve algılama otomatik bir sequencer ile otomatik parça analizi yoluyla PCR kullanarak grupları mevcut. Ayrıca, otomatik parça analizi yoluyla av DNA tespiti hafızanın yırtıcı göreli bir miktar da sağlayan bir yaklaşım olduğunu gösteren bir örnek çalışma sonuçları sunmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. alandan Macroinvertebrates toplamak ve örnekleri genetik Gut içerik analizleri için hazırlamak.

  1. Toplamak macroinvertebrates her sitede tek tüpler içine ilgi tüketici türlerin bireyler çözmek ve doğrudan onları sıvı azot veya bağırsak temizleme ve DNA'ın yıkımı önlemek için kuru buz dondurmak.
    Not: bazı macroinvertebrates alkol onları öldürmeden önce kusturmak eğilimindedir çünkü örnekleri alkol, depolamak kaçının.
  2. Sadece mide-bağırsak orta ölçekli ve büyük kullanın (yaklaşık > 3 mm) macroinvertebrate türlerin genetik bağırsak içeriği örnek kalan meselesi diğer işlemleri (Örneğin, kararlı izotop kullanılacak şekilde analizleri için analizi). Bu su akarları gibi çok küçük takson soruşturma zaman uygulanabilir değildir. Bu nedenle, adım 1.2.1 ve 1.2.2-ebilmek var olmak Kaptan.
    1. Biraz bireyin defrost ve dikkatle incelemek onun mide-bağırsak ince paslanmaz çelik forseps kullanarak bir stereomicroscope altında. Madde kaybını önlemek için mide-bağırsak delmek değil emin olun.
      2. DNA ve RNA contaminations her mide-bağırsak hazırlanması sonra kaldırmak için dekontaminasyon çözüm kullanarak
    2. temiz forseps. Bu nedenle, forseps dekontaminasyon çözüm 10 min için kuluçkaya. Daha sonra kalan izleri ve bir hav bırakmayan kağıt havlu ile silin için steril su ile yıka.
    3. 2.0 mL güvenli kilit tepki disseke gastrointestinal sistem aktarmak tüp içeren 440 µL (450 µL mümkün tekrarlayan pipet kullanımı için) tuz çıkarımı arabellek [SEB; 0.4 M Sodyum Klorür (NaCl), 10 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethane hidroklorür (Tris-HCl) pH 8.0 ve 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit disodyum tuzu (EDTA) pH 8.0 kurutmak]. Mağaza örnekleri, hazırlanan − hemen DNA ekstraksiyon kadar 20 ° C. DNA birkaç gün içinde elde edilebilir olun.
  3. DNA ayıklamak için değiştirilmiş yüksek tuz ayıklama protokolü 25 kullanın.
    1. Dondurucu dışarı almak örnekleri. Forseps bir 5 mm paslanmaz çelik boncuk her örnek tüp eklemek için kullanın ve oda sıcaklığında erimek için (RT) bankta Donmuş numuneler bırakın. Bir boncuk değirmen örnekleri 15 Hz, 1 dk. için homojenize kullanmak.
    2. Örnekleri ile bir santrifüj kısa bir koşmak aşağı spin. Microliter Pipetler 90 µL (100 µL için tekrarlayan pipet kullanımını mümkün) Sodyum Lauryl Sülfat çözeltisi (SDS) ve 5 eklemek için kullanın µL 10 mg/mL İndinavir K.
    3. Girdap iyice örnekleri ve karışımlar için 1 h 60 ° C'de sabit bir thermomixer üzerinde 400 rpm sallayarak ile kuluçkaya. Ayrıca, iyice girdap daha fazla lizis desteklemek için her 10 min örnekleri.
    4. Spin örnekleri ile bir santrifüj kısa bir koşmak aşağı 5'te 16,200 x g 5 M NaCl iyice 40 dk için yaklaşık 0,5 - 1 dakika santrifüj örnekleri için girdap bir microliter pipet ile 350 µL eklemek ° C.
      Not: birden çok üst üste yapılması gereken varsa, santrifüj sıcaklık ayarı SDS sıcaklığı çok düşük ise flocculate eğilimindedir çünkü biraz (değil daha yüksek 10 ° C) yükseltilmiş olması gerekir.
    5. Kullanım microliter Pipetler yaklaşık 600 µL süpernatant yeni 1,5 mL tepki tüp içine aktarmak için. Bir şey Pelet kaldırmak değil dikkatli olun.
    6. Ucu paslanmaz çelik boncuk tepki tüpler içine bir paslanmaz çelik çay süzgeç dışarı akan su ile temiz ve steril dekontaminasyon Çözümle kapalı 10 dk. iyice durulayın için onları bir petri dekontaminasyon solüsyonu içinde kuluçkaya su ve temizlenmiş boncuk etanol depolamak (> % 99, sahne sanatları sınıf) veya yeniden kadar kuru.
      Not: boncuk temizlik Bu adımda doğrudan yapılması gerekli değildir, ancak aşağıdaki adımlarda bekleme süresi ne zaman oldukça yapılabilir.
    7. Buz gibi isopropanol (PA grade) süpernatant ile bir microliter için eklemek 600 µL pipet ve dikkatle tüp birkaç kez tersine çevirin. Saklamak örnekleri gecede, -20 ° c
    8. Dondurucudan örnekleri almak ve onları 16,200 × g ve oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj kapasitesi. Dikkatle süpernatant atmak ve tüp dikkatle hav bırakmayan kağıt mendil ile kurulayın. Çevredeki sıcaklık (fazla 25 ° C), yüksek ise 5 ° C'de süpernatant atma sırasında kayma granül önlemek için santrifüj kapasitesi unutmayın.
    9. Yıkama % 70 etanol ile içeren DNA unsurlardandır. Bunu yapmak için buz gibi soğuk etanol (% 70, sahne sanatları sınıf) 200 µL ekleyin bir microliter pipet ve santrifüj kullanarak örnekleri 10 dk 16,200 x g ve oda sıcaklığında (ya da 5 ° C, gerekirse) az için. Dikkatle süpernatant atmak ve tüp dikkatle hav bırakmayan kağıt mendil ile kurulayın. Kullanım 10 µL pipet dikkatle kalan süpernatant pipet için yaklaşık 8 µL göre düzeltilir. Pelet bozmamaya dikkat edin.
    10. Tüm etanol buharlaşan kadar yaklaşık 60 ° c veya tezgah, oda sıcaklığında 5-20 min için Pelet Makinası.
    11. Erime Pelet (etki olmaksızın buharla sterilize ve tedavi DEPC) 50-100 µL nükleaz ücretsiz olarak su (GKD 2 O), en az 1 (daha iyi sonuçlar gecede 4 ° C'de elde edilir rağmen) s için bekleyin.
    12. Üreticiye göre DNA mikro-cilt Spektrofotometre ile her örnekte yer alan miktarını ölçmek ' s yönergeleri. Yaklaşık 2-10 ng DNA içeren her örneğinin çalışma seyreltme yapmak / µL. dondurucuya hisse senedi çözüm tutun. Çalışma çözüm buzdolabında tutmak ve daha fazla örnek sağlamak işleme kısa bir süre yapılır.

2. Son zamanlarda alınan av sonraki tespiti için DNA-özler fonksiyonel etkinlik doğrulayın.

  1. Varlığı ve şablonları, fonksiyonel etkinlik testi her DNA özü (Adım 1.1-1.3.11) emin olmak için evrensel astar kullanarak ilgili besin kaynağı için uygun ayarlar (Örneğin, omurgasızlar 16 , 26) av 25 , 27 sonraki tespiti için kullanılan gruba özgü primer olarak aynı nükleer alt birimi hedefleme. Aşağıdaki adımları evrensel astar kümeleri NSF1419/20 ve NSR1642/16 16 ve LSU D1, D2 fw1 ve LSU D1, D2 rev2 veya LSU D1, D2 rev4 26 kullanmak için başvurun. PCR reaksiyonu başarılı olmuştur ve hiçbir kirlenme meydana geldi kanıtlamak için bir pozitif kontrol zaten başarılı bir şekilde güçlendirilmiş DNA içeren ve GKD 2 O içinde çalıştırmak her PCR DNA yerine içeren bir denetimi örneğini kullanın.
    1. İçine astar astar son konsantrasyonu 10 µM içeren, ilgili astar hisse senedi çözüm ve GKD 2 O (bağlı olarak hisse senedi çözüm konsantrasyonu) uygun miktarda pipette çalışma çözümleri hazırlamak için bir MİKROPİPETLER kullanarak taze 1,5 mL tepki tüp.
    2. Astar, deoxynucleotide mix (dNTPs), reaksiyon arabellek, Taq DNA polimeraz ve GKD 2 O (işlenecek örnekleri sayısı) bağlı olarak 1.5 veya 2.0 ml tepki tüp sonra girdap bu karışıma ekleyin. Detaylı birimler için standart reaksiyon karışımı 10 µL PCR reaksiyon için Tablo 1 ' de verilmiştir (Ayrıntılar kullanılan, kimyasalların için bkz: Tablo reçetesi).
    3. Kullanım microliter Pipetler DNA'ın her 1 µL aktarmak için th 9 µL ayıklamake standart reaksiyon karışımı bir PCR tüp (ya da bir şey PCR plaka) içinde. Tepki tüp veya plaka (kap çizgili) tepki kuyu kapatın.
    4. Program thermocycler: NSF1419/20 ve NSR1642/16 16 astar kümesi için standart protokoldür: 94 ° 94 ° C 30 döngüleri için 30 ardından C 4 dk (denatürasyon), s, 50 ° C (tavlama sıcaklığı) 30 s, 72 ° C 90 s ve 10 dk 72 ° C'de son uzantısı için. LSU astar 26 ayarlar için aşağıdakileri kullanın: 94 ° C 4 dk, ardından 45 94 ° C devredir 20 s, 52,5 ° C 20 s, 72 ° C için 90 s ve son uzantısı 8 dk. 72 ° C'de
    5. Yer PCR tüpleri veya thermocycler, kalıplara cycler kapağını kapatın ve ilgili programını başlatın.
    6. Hazırla % 1.5 özel bir arabellek çözüm Tris temel içeren, Borik asit ve EDTA (TBE tampon) ve özel kullanarak jel. 10 cm × 7.5 cm × 3 cm, genel boyutları ile bir jel döküm tepsi kullanarak bir % 1.5 özel jel hazırlanması için 0,45 g özel konik bir şişesi tartmak, 30 mL 1 x TBE arabelleği (89 mM Tris ölçmek için bir ölçüm silindir kullanın pH 7,6, 89 mM Borik asit ve 2 mM EDTA, pH 8.0) ve konik şişe dökün. Bir mikrodalga kullanarak karışım ısı. Büyük hava kabarcıkları olduğunda mikrodalga durdurmak ve çözümü tek bir aşama var kadar dikkatle şişeye girdap.
    7. Çözüm yaklaşık 60 ° c, sakin bir su banyosu şişeye girdap. Hızla çözüm bir jel döküm tepsiye dökün, hava kabarcığı çıkarıp tarak yerleştirin. Jel sertleştirilmiş kadar yaklaşık 20 dk bekleyin.
    8. Dolgu Elektroforez ünitesi ile 0.5 x TBE ve özel jel içeren INSERT jel döküm tepsi. Jel Yuvaları hava kabarcıkları ücretsiz olduğundan emin olun.
    9. Mini (plaka) santrifüj kısa çalışma seçeneğini kullanarak PCR ürünleri spin. Microliter pipet her 3 µL PCR ürününün boya (% 40 sukroz ve % 0.25 bromophenol mavi) yükleme x 6 1 µL karıştırın ve özel jel jel yuvalarına yüklemek için kullanın. 1,5 µL 100 bp DNA merdivenin her satırın bir yuvaya microliter pipet ile standart boyutta pipet. Doğru Elektroforez ünitenin kapağını yerine takın ve müşteri adayları bir güç kaynağına bağlayın. Jel 100 V/cm 35 dakika süreyle çalıştırın
    10. Boyama banyo hazırlamak için 1 1000 mL dökün x TBE içine bir kare şeklinde plastik kutu ışık geçirmez. Etidyum bromür microliter pipet ile 50 µL eklemek, plastik kutu kapağı kapatın ve etidyum bromür eşit dağılımını sağlamak için salla.
    11. Jel Elektroforez birimden çıkartın ve yaklaşık 10 dakika için boyama Banyosu içine yerleştirin. Sonra jel boyama Banyosu dışarı almak ve bir jel dokümantasyon sistemi yerleştirin ve rehberine göre görselleştirmek.
    12. Varlığı ve şablonları sonraki son zamanlarda alınan av algılanması için fonksiyonel etkinlik açısından olumlu sonuçlar (yeterli boyutta özel jel görsel parçaları) gösterdi tek örneklerini.
< t d > 0,25 μl
PCR-Mixkonsantrasyon çalışma çözümMix 10 için µL PCR reaksiyonPCR son konsantrasyon
Astar FW10 µM0.5 μl0.5 µM
Astar RW10 µM0.5 ve #956 ; l0.5 µM
reaksiyon arabellek (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16 mM (NH4) 2SO4 ve 2 mM MgCl2 son konsantrasyonları)1 µM1 μl1 µM
dNTP10 mM0,25 mM
Taq polimeraz5 U0.1 μl0.05 U
GKD 2 06,65 μl
< stro NG > toplam tutarı tepki karışımı9 μl
DNA1 μl

Tablo 1: ayrıntılı bir 10 µL PCR reaksiyon için standart reaksiyon karışımı hazırlanması için protokolü.

3. Jel Elektroforez kullanarak gruba özgü Primer setleri ile son zamanlarda alınan av/gıda maddeleri tespit.

  1. Yapmak PCR DNA'ın çalışma çözüm ayıklar (1.1-1.3.11 adımları göre hazırlanmış) kullanarak ve gruba özgü astar set (etiketsiz, Yani, değişiklik yapmadan) gibi hedef av grubu için uygun açıklanan 2.1.1-2.1.3 adımlar (reaksiyon karışımı ilgili astar kümesi için farklı için Tablo 2 bakınız). 2.1.4. adımda verilen standart protokolü kullanılarak PCR çalıştırmak (ilgili astar set sıcaklıkları tavlama için bkz tablo 2).
    1. Bir denetim ile ilgili hedef grubu (pozitif kontrol) ve bir negatif kontrol saf DNA ile çalıştırmak her PCR tüketici türlerden ait bir örnekten saf DNA kullanın.
  2. Özel Jel Elektroforez açıklanan adımları 2.1.6 2.1.11 kullanarak PCR reaksiyon başarısı kontrol edin. PCR reaksiyon uygun uzunlukta bir parçası (bkz. Tablo 2) görünür durumdaysa başarılı pozitif kontrolü için ama negatif kontrol için değil. Bir ya da iki ölçütü yerine getirilmemiş ise, PCR yineleyin.
  3. Kullanım özel Jel Elektroforez, hedef av grubu (uygun uzunluk parçası görünür olup olmaması, yargı yolu ile) test farklı tüketici numunelerin tarafından tüketilen olup olmadığını tespit etmek için 2.1.6 2.1.11, adımlarda açıklandığı gibi. Parçaları ile düşük görsel kararlılık kaçırmayın emin olun.
  4. Mağaza PCR ürünleri 4 ° c, eğer daha fazla analizleri sonraki 24 saat içinde bitmiş, ya da -20 ° C-analizleri daha sonra gerçekleştirilecek varsa,.

4. Daha sonra daha da aşağı Polyacrylamide jel ile SSCP analizi ile tüketilen av belirlemek.

  1. % 9 Akrilamid jel SSCP Elektroforez için hazır olun. Bir laboratuvar başlıklı çalışma çözümleri hazırlayın.
    1. 200 mL Akrilamid çalışan bir çözüm hazırlamak, bir ölçüm silindir 10 ile 20 mL doldurmak için x TBE (109 g Tris tabanının, 55 g Borik asit ve 0.50 M EDTA, 1000 mL GKD 2 O çözünmüş pH 8.0 40 mL) ve başka bir 45 mL ile @ (29:1) Akrilamid karışımı. TBE ve Akrilamid mix (200 mL işareti bulunan mezun cam şişe de burada uygundur) mezun bir şişe dökün ve GKD 2 O kadar 200 mL işareti ekleyin. Çözüm buzdolabında (4 ° C) ihtiyaç kadar çalışmaya devam et. Bir haftadan daha eski çalışma çözüm kullanmayan.
      2. 1 mL volumetric flask ve GKD 2 O kadar mezuniyet ekleyerek işaretle bir % 10 APS hisse senedi çözüm hazırlamak için erime
    2. tartmak 0.1 g amonyum persülfat (İlişkilendir; kullanım ile en az 0,01 g hassasiyetle bir denge). Aliquots (yaklaşık 350 µL) taze tepki tüpler içine transfer.
      Not: Bir aliquot her polyacrylamide jel için gereklidir. Mağaza kalan aliquOTS-20 ° C'de ve gerekli kısa bir süre önce sadece aliquots defrost.
    3. Bir jel kaset iki cam tabak, bir boşluk ve bir çentikli cam levha (her 20 cm x 20 cm), aralarındaki mesafe tutucular (1,5 mm kalınlığında) ile tehlikeye montajı cam kenarlarına kadar çalıştırıyor. Her üç kat geri klip (32 mm) sağ ve sol tarafta jel kaset ( şekil 1) bağlamak için kullanın.
    4. Mix 5 g özel ve çözüm için % 2 özel hazırlamak için konik bir şişesi 1 x TBE arabellekte 250 mL jel. Isı ve daha sonra karışımı 2.1.6 ve 2.1.7 adımlarda açıklandığı gibi serin. Hızla çözüm bir kare şeklinde plastik kutu dökün (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) ve özel çözüm içine jel kaset (Adım 4.1.3) alt sonuna yerleştirin. Onlar kare şeklinde plastik kutu ( şekil 1) kenarında oturup bir yükseklik için jel kaset alt sonuna kat geri klibe ayarlayın. Özel tak tamamen sertleşmiş kadar yaklaşık 20-30 dk bekleyin.
    5. 100 mL kadar 60 mL işareti silindir Akrilamid çalışma çözüm (Adım 4.1.1) ile ölçme doldurulması ve bir ölçek solüsyonu dökün. Bir micropipette bir aliquot APS hisse senedi çözüm (Adım 4.1.2) 300 µL eklemek ve daha sonra tetramethylethylenediamine (TEMED) 37,5 µL eklemek için kullanın. Hızla, jel kaset cam plakanın arasında solüsyonu dökün. Alternatif olarak, çözüm şırınga enjeksiyon başkanı ayarlanmış bir 1000 µL pipet ucu 100 mL tek kullanımlık şırınga ile cam plakalar arasında enjekte.
    6. 1.5 mm kalınlığında standart fırça cam plakanın arasında üst sonunda dikkatlice yerleştirin. Tarak polyacrylamide çözüm tarafından alınmalıdır. Polyacrylamide jel polimerli kadar yaklaşık 1 saat bekleyin. Jel polimerize gereken süreyi artırır çünkü havalandırma mümkün olduğunca polimerizasyon sırasında kaçının.
      Not: 3 gün buzdolabında ıslak mendil ile mühürlü plastik torbalar içinde döküm jelleri stok ilâ mümkündür.

figure-protocol-1
Resim 1: resim gösteren İnşaat polyacrylamide jeller dökün. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. polyacrylamide hazırlanan, bir Dikey Elektroforez birimde jel içeren jel kaset yerleştirin. Dolgu Elektroforez birim 0.5 x TBE ve serin aşağı 10 ° C soğuk hava sirkülatörün kullanarak birimi uygun miktarda (Elektroforez birimi türüne).
  2. DNA denatürasyon için bir termal-blok /-cycler 96 Onceden ° C. Prepare denatürasyon arabellek % 95 formamide (% 99.5 sahne sanatları sınıf) ve % 0.25 bromophenol mavi ve % 40 (w/v) Sükroz içeren %5 sulu çözüm.
  3. Buzdolabı ya da derin dondurucu PCR ürünleri alın ve onları defrost. Bir mini (plaka) santrifüj kısa çalışma seçeneğini kullanarak PCR ürünleri spin. Sonra her 4 µL PCR ürününün denatürasyon arabellek 4 µL ile karıştırın. Isı karışımları 10 dakika süreyle buzlu su soğutma bir adımda hemen ardından 96 ° C'de 5 min için
    Not: Örnekleri polyacrylamide jel (Adım 4.5) hemen bundan sonra yüklü olmalıdır.
  4. Tarak polyacrylamide jel (Adım 4.1.6) çıkarın ve bir micropipette tamamen her örnek bir jel yuvasına yüklemek için kullanın. Elektroforez jel başına 8 W çalışmasını sürekli gerekli 10 ° c süre Elektroforez birimine soğutma ayrılması parçasının boyutuna bağlıdır. Parça boyutları yaklaşık 210 için bp, yaklaşık 3,5 saat çalışan bir zamanı olarak kabul edilir uygun.
  5. Boyama banyo hazırlamak için 1000 mL 1 x TBE kare şeklinde plastik içine ışık geçirmez kutu ve boya (tek iplikçikli DNA leke için uygun) Boyama 30 µL ekleyin dökün microliter pipet ile. Plastik kutu kapağı kapatın ve boyama boya eşit dağılımını sağlamak için salla.
  6. Jel kaset Elektroforez odasından kaldırın ve çentikli cam levha jel dikkatle ayırın. Polyacrylamide jel boş cam tabaktan boyama banyo içine kaydırın. Sürekli titriyor ile 20-30 dk için titreyen bir platform ve leke jel üzerine boyama Banyosu yerleştirin.
  7. Jel boyama banyosu dışında dikkatlice alıp bir belgelendirme sisteminin UV masaya yerleştirin.
    Not: jel istikrarsızlık nedeniyle önceki adım iki kişiyle işlemek için tavsiye edilir. Bir kişi UV tablosunun yanındaki boyama Banyosu tutun ve bir tane jel iki eliyle altında ulaşmak, dışarı almak ve UV masaya slayt.
  8. Kapağı veya dokümantasyon sisteminin kapıyı kapatın ve üreticiye göre fotoğraf çekmek ' s kullanım kılavuzu.

5. Birden çok son zamanlarda yutulur av grupları otomatik parça analizleri kullanarak paralel olarak algılamak.

  1. Analiz DNA bağırsak içeriğini ayıklar 16 gruba özgü astar kullanarak ayarlar tablo 2., bir boyama boya ile değişiklik nedeniyle etiketli bir kümesinin bir astar ile verilen (bkz. Tablo 2 sütun değiştirme başlıklı) ve paralel algılama yöntemleri kullanın otomatik bir sequencer,.
    1. (1.1-1.3.11 adımları göre hazırlanmış) DNA özleri ve kuralları çalışma çözüm her astar gibi ayarlamak için PCR ayırmak kullanma adımları 2.1.1 için (karışım değişimler Tablo 2 verilen) 2.1.5 açıklandığı. En az bir denetim ile ilgili hedef grubu (pozitif kontrol) ve bir negatif kontrol saf DNA ile çalıştırmak her PCR tüketici türlerden ait bir örnekten saf DNA kullanın.
      2. Tablo 2 ' de verilen ayarla her astar için
    2. çalıştırmak PCR adım 2.1.4, verilen standart PCR protokolü kullanılarak thermocycler içinde düzeltilmiş ilgili tavlama sıcaklığı (ve döngü sayısı).
      Not: PCR ile her sonraki PCR ürünlerinin havuzu toplanmış için basitleştirmek için 16 farklı astar ayarlar otomatik parça analizleri için tepki wells aynı DNA tahsisi kullanın.
    3. Mağaza PCR ürünleri-20 ° c kadar tüm PCR otomatik parça analizleri (bkz. Tablo 2) bitti mi için bir toplu işlemine ait. PCR ürünleri karanlıkta bırakın ve onları parça analizleri önce 1 haftadan uzun tutmayın.

figure-protocol-2
Tablo 2:, 15 gruba özgü astar çiftinin 2 toplu işlemleri ayrıntılarını Koester ve ark. tarafından kurulan (2013) ve yeni tasarlanmış Jae28S astar çift su macroinvertebrates 16 hedef grupları üzerinden 18S veya 28S rDNA bölgelerinde yükseltecek. f, ileri astar; r, ters astar; 18s, astar 18S rDNA alt birim hedefleri; 28s, astar 28S hedefler. rDNA alt birim. " Hydrobiologia, Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) olan bir ' katil karides ' Ren Nehri sistemi?, 768, 2016, tablo S1, takıma giren malzeme sayfa 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© sıçramak Uluslararası İsviçre 2015 yayımlama) " Springer izniyle. Bu tablo daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    tüm 16 astar kümeleri güçlendirilmiş parçaları tespit etmek için
  1. Tablo 2'de verilen 2 gruplar halinde otomatik parça analizleri yapmak. Bir iç boyutu standart kullanın (DNA boyutu standart Kit - 400 [toplu B] ve - 600 [toplu iş A], sırasıyla) parçası uzunluğu belirlemek için. Sıralama plaka ve Otomatik Sekanslama aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde hazırlayın. Bu yordamı Eğer bu malzemeler tabloda verilen daha başka bir platform kullanarak ayarlanması gerekebilir Not.
    1. Toplu örnekleri çalıştırmak için örnek yükleme çözümü (SLS) ve standart ilgili boyutu içeren bir karışım hazırlamak. SLS 21,6 µL ve DNA boyutu standart Kit - örnek toplu iş a ve, sırasıyla, SLS 21,7 µL ve DNA boyutu standart Kit 0.3 µL başına 600 - 0.4 µL pipet örnek toplu iş b başına 400
    2. Dondurucu dışında ilgili toplu ait 8 PCR PCR ürünleri alın ve onları defrost. Onlar hala karanlıkta tutulur emin olmak.
    3. Her 22 µL 5.2.1. adımda açıklanan ilgili karışımı ile gerekli bir sıralama plaka (çözümlenmesi için örnekleri sayısı) kuyu sayısı yüklemek için bir microliter pipet kullanın. PCR ürünlerinin her bir mini (plaka) santrifüj kısa çalışma seçeneğini kullanarak 8 PCR spin. Sıralama plaka microliter pipet ile ilgili kuyu içine her 1 µL PCR ürün her 8 PCR birinin başına transfer.
    4. Dikkatle bu karışımı bir mini plaka santrifüj kısa bir çalışma ile sıralama plaka içinde aşağı spin ve her bir damla mineral yağ ile kullanılan Wells yerleşimi. DNA ayrılık arabellek 250-300 µL ile ilgili tepki Kuyu yapımı bir arabellek tabak doldurun.
    5. Bir örnek kurulum üretici göre oluşturmak için kılcal sequencer yazılımı kullanın ' s yönergeleri. Örnek ayarlar kontrol ve (Tablo 3 bkz: Malzemeler tablo verilen boyutu standart ile kullanım için yeterli koşulları çalıştırmak için) verileri işlemek için kullanılan yöntemleri sırasını belirlemek için yöntemleri atamak. Örnekleri örnek Setup içerisinden tahsisi (dahil olmak üzere pozitif ve negatif, bkz adım 5.1.1) sıralama plaka örnek tahsisini eşleşip eşleşmediğini ve parça için yeterli yöntemi ile ilgili inceliyor çok önemli olduğunu unutmayın boyutu standart seçilir.
    6. Bir ıslatma tepsi deiyonize su ile doldurun ve sıralama plaka, tampon plaka ve ıslatma tepsi kapiller sequencer yerleştirin. Örnek çalıştırmak için gerekli olan taze DNA ayrılık jel yeterli miktarda içeren bir jel kartuşu takın. Hazırlanan örnek Kurulumu kullanarak sıralama plakayı araştırmanı.
denatüre ayrı Kılcal damar enjekte
Sıcaklıkzamangerilimzamangerilimzaman
boyutu standart 60090 ° C120 s4,8 kV60 dk50 ° C Temp için bekleyin: Evet2.0 kV30 s
boyutu standart 40090 ° C120 s6 kV45 dk50 ° C Temp için bekleyin: Evet2.0 kV30 s

Tablo 3: belirli koşullar için parça analizleri malzemeleri tabloda verilen boyut standartları kullanarak Otomatik Sekanslama üzerine.

    sonuçları analiz etmek için
  1. ham verileri verme ve bu verileri bir parçası analysis program yüklemek. Standart boya boya renk kanalları ayarlamak için renk siparişleri ilgili üreticinin seçin.
    1. Tek Kişilik gruba özgü astar tarafından güçlendirilmiş parçası uzunluğu beklenen dizi özetleyen bir Panel ayarlar içinde bir toplu iş programının kullanıcı kılavuzuna göre oluştur.
      2. Verileri işlemek için
    2. ilgili Panel, uygun boyutu standart, Standart renk ve analiz türü seçin ve yordamı çalıştırın. Floresan sinyal yoğunluklarda Kapiler Elektroforez cihazları üzerinden bir tek satır izleme için her boya renk olarak görüntülemek için electropherogram seçeneği seçin. İşaretleri/astar kümeleri ilgili parça aralığı belirten görüntülenir ve algılanan parçasının her denilen zirve merkeziyle ilişkili tam uzunluğu (çoğu program tarafından renklendirme veya atanan ad) vurgulanır otomatik olarak.
    3. Ne kadar yakından her örnek için hesaplamak örnek ' s iç boyutunun çift boyutu arama başarısını güvence vermek için seçili boyutu standart aynı. Çoğu parçası analizleri program otomatik olarak hesaplamak ve bu maç görselleştirmek için bir seçenek var. Boyutu arama başarısız olursa, bu örnekleri için parça analizleri yineleyin.
    4. Görsel olarak her örnek electropherogram yeniden denetleyin ve Onayla/unconfirm ayrı olarak ayarlayın her işaretleyici/astar için denilen her tepe. El ile bir işaretleyici/astar kümesinin ölçütlere uyan veya kullandığınız programın kullanıcı kılavuzuna göre yanlış olanları silmek biraz beklenmedik doruklarına yerleştirin. Baz çifti boyutu veya depo adı Uygula ' alleli etiket '. Hesaplamak ve en yüksek teknik özellikleri görüntülemek ' tepe tablo '.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı için diyet analizleri farklı çalışmalar içinde açıklanan adımları başarıyla kullanılır. Bu bölümde, biz protokol farklı bölümlerini uygulanabilirliği açıklayan örnekler mevcut.

Örneğin, yazarlar28 ve daha da aşağı akım analizleri PCR ürünleri SSCP analizleri tarafından potansiyel tarafından kurulan gruba özgü astar kümeleri etkinliğini göstermek için bir besleme deney. Dikerogammaru...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, avcı-av etkileşimler aynı numune moleküler olmayan diğer analizler ile kombine edilebilir rDNA bölgeler için gruba özgü astar ile alan örneklerinden PCR tabanlı tespiti için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem mevcut. Ancak, protokol içinde çeşitli kritik adımlar vardır. İlk olarak, kullanılan astar özgüllük temin esastır. İkinci olarak, mide-bağırsak hazırlanması ve DNA'ın sonraki çıkarma sırasında kontaminasyon ve gut içerik malzeme kaybı önlemek çok önemlidir. Çapraz-örnek kirlenme av DNA yanlış pozitif tespit...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Silke Classen Araştırma Enstitüsü'nden ekosistem analizi ve değerlendirmesi (gaiac), bu protokol için kullanılan gruba özgü astar kümeleri kurulmasında yardımını RWTH Aachen için teşekkür ederim. Biz de teşekkür Peter Martin ve Laura Schynawa Kiel Üniversitesi işbirliği için gelen su akarları deneyler. Biz de sorunsuz çalışmasını ve şirketler ve Katalog numaraları kayıt hazırlık lab teknik laboratuar görevlileri tutmak için teşekkür ederiz. Bu eser (DFG; proje GE 2219/3-1) Alman Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
sıvı nitrojenHerhangi birNAMakro omurgasızların saha örneklerinin laboratuvara taşınması için.
1,5 ml reaksiyon tüpleri - SafelockAnyNATüketici numunelerinin sahada toplanması ve ardından sıvı nitrojen reaksiyon tüplerinde muhafaza edilmesi için mutlaka PCR temiz olması gerekmez. Tüplerin patlamasını önlemek için, tüplerin kapağı bir iğne ile delinmelidir.
StereomikroskopHerhangi birNAİlgilenilen tüketicinin boyutunun gastrointestinal sistemini hazırlamak için büyütmenin uygun olduğundan emin olun.
Petri kaplarıHerhangi birNAStereomikroskop altında tüketici örneklerinin gastrointestinal yolunu incelemek için.
Paslanmaz çelik foceps: Dumont forseps No. 7BioformB40dBu kavisli paslanmaz çelik forseps, bazen mide-bağırsak yolunu delmeden eğri kısım arasına sabitlenmiş numuneyi tutmak için çok helezon olabilir.
Paslanmaz çelik foceps: Dumont forseps Elektronik No. 5BioformB40bBu ince paslanmaz çelik forseps, tüketici numunelerinin mide-bağırsak yolunun hazırlanması için idealdir.
DNA-ExitusPlusAppliChemA7409,1000RFDNA ve RNA kontaminasyonlarının giderilmesi için dekontaminasyon solüsyonu
tüysüz kağıt havluHerhangi birNA
Lab terazisiHerhangi birNAHassasiyetinin en az 0,01 g olması gerekir.
Mikrolitre pipetler (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)Herhangi birNA
Güvenli Kilit Tüpü 2.0 mlVWR211-2165Bu raksiyon tüplerinin DNA, DNaz, RNaz ve PCR inhibitörleri (PCR temiz) içermemesi çok önemlidir!
Güvenli Kilitli Tüpler 1.5 mlVWR211-2164Bu raksiyon tüplerinin DNA, DNaz, RNaz ve PCR inhibitörleri (PCR temizliği) içermemesi çok önemlidir!
Sodyum klorür & % 99,5, pa, ACS, ISOcarlroth3957.3Tuz ekstraksiyon tamponu (SEB) ve DNA'nın ekstraksiyonu için gerekli 5M NaCl çözeltisi için.
Tris (hidroksimetil) -aminometan Triscarlroth4855.2Tuz ekstraksiyon tamponu (SEB) ve TBE tamponu için
Mikrolitre pipetler (0.5-10 / 10-100 / 50-200 / 100-1000 & mu; L)carlroth8043.1Tuz ekstraksiyon tamponu (SEB) ve TBE tamponu Borik
asit &ge için; TBE tamponu için %99,8, pa, ACS, ISOcarlroth6943.2. Ticari olarak temin edilebilen TBE arabelleği elde edilirse gerekli değildir.
Sodyum dodesil sülfat (SDS)carlroth4360.1liyofilinin ekstraksiyonu için
.carlroth7528.110 mg / ml içeren bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
TissueLyser IIQuiagen85300Numunelerin homojenizasyonu için boncuk değirmeni.
Paslanmaz Çelik Boncuklar, 5 mmQuiagen69989Numunelerin homojenizasyonu için.
Isıtma TermoshakerHerhangi birNA
Vorteks KarıştırıcıHerhangi birNA
Soğutmalı santrifüj: himac CT 15 REHitachiNADNA ekstraksiyonu sırasında santrifüjleme için kullanılan soğutmalı santrifüj (Protokol 1).
İzopropanolcarlroth6752.5
Etanol %99,8, pabirNA
Su Moleküler biyoloji sınıfı (ddH2O)AppliChemA7398,1000nükleaz içermeyen (akışla sterilize edilmiş ve DEPC ile muamele edilmiş) su DNA'nın yeniden süspansiyonu için kullanılır ve el yazması içinde ddH2O'ya atıfta bulunulduğunda
Değiştirilmemiş OlegonükleotidlerEurofins MWGOperon NAPrimerler etiketlenmemiş
Modifiye olegonükleotidlerMetabion International AGNAPCR
peqGOLD Taq her şey dahilVWR etiketli primerler Peqlab01-1000Taq her şey dahil (reaksiyon tamponu Y ve S, dNTP'ler ve MgCl2)
Primus 96 gelişmiş gradyan termodöngüleyici veya peqStar96x Evrensel GradyanPeqlabNAAstar setleri orijinal olarak bir Primus 96 gelişmiş gradyan termocycler üzerine kurulmuştur. Bu döngüleyici oldukça eski olduğu için, peqSta96x'i (eski modeli de simüle edebilir) kullanarak astar setlerimizin aynı koşullar altında verimli ve spesifik olup olmadığını kontrol ettik. Bununla birlikte, testler, astarlarımızın iyi çalıştığını ve eski makinenin simülasyonunu kullanmadan hala spesifik olduğunu gösterdi (bakınız Koester et al. 2013).
Standart 96 Kuyulu PCR PlakalarıVWR Peqlab732-2879PCR reaksiyonları için kullanılır.
Düşük Profilli Tüp Şeritleri 0.15 ml Düz Kapaklı ÇizgiliVWR Peqlab732-3223PCR plakalarını kapatmak için kullanılan kapak şeritleri.
AgarosePeqlab35-1020Jel elektroforezi için kullanılır.
MikrodalgaHerhangi birNA
Konik şişeHerhangi birNA
Ölçüm silindiriHerhangi birNA
Yatay elektroforez ünitesi ve dişli ilgili taraklarHerhangi birNAAgaroz jel elektroforezi için.
Elektroforez Güç Kaynağı PS3002Yaşam TeknolojileriNA
Etidyum bromür çözeltisi 1 %carlroth2218.1Agaroz jelleri için boyama banyosu hazırlamak için kullanılır.
Formamidcarlroth6749.1SSCP analizleri için denatürasyon tamponu için gereklidir.
Bromphenol blueAppliChemA3640.0010Agaroz jel elektroforezi için yükleme boyası için gereklidir.
Sükrozcarlroth4621.1Agaroz jel elektroforezi için yükleme boyası için gereklidir.
100 bp-DNA-Merdiven uzatılmışcarlrothT835.1Agaroz jel elektroforezi için boyut standardı olarak.
UV Dokümantasyon sistemiHerhangi birNAJel elektroforez sonuçlarını görselleştirmek için.
Rotiphorese NF-Akrilamid/Bis-çözeltisi %40 (29:1)carlrothA121.1Poliakrilamid jellerin hazırlanması için.
Amonyum peroksidisülfatcarlroth9592.2Poliakrilamid jellerin hazırlanması için.
katlanır klipsler (32 mm)Herhangi birNAPoliakrilamid jellerin hazırlanması için.
kare şeklinde plastik kutu (21 & kez; 6,5 & kez; 5 cm)Herhangi birNAPoliakrilamid jellerin hazırlanması için.
Tetrametiletilendiamin (TEMED)carlroth23.67.1Poliakrilamid jellerin hazırlanması için.
BeherAnyNA
RC 10 Dijital soğutucuVWR462-0138Poliakrilamid jel elektroforezi kullanan SSCP analizleri için.
Dikey elektroforez ünitesi P10DS (OWL Ayırma Sistemleri)VWR700-2361Poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak yapılan SSCP analizleri için.
Çentikli cam plakaVWR730-0261Poliakrilamid jel elektroforezi kullanan SSCP analizleri için.
Boş cam plakaVWR730-0260Poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak yapılan SSCP analizleri için.
Ara parçalarVWR730-0262Poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak SSCP analizleri için.
25 dişli tarakVWR730-0294Poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak yapılan SSCP analizleri için.
Sallama platformuHerhangi birNABoyama banyosunun sürekli sallanması için.
GelStar Nükleik Asit Lekesi (Lonza Rockland, Inc.)Biozym850535 (50535)Poliakrilamid jellerin boyanması için.
GenomeLab DNA Boyutu Standart Kiti 400bpAB Sciex608098Otomatik parça analizleri için. Parti B için boyut standardı.
GenomeLab DNA Boyutu Standart Kiti 600bpAB Sciex608095Otomatik parça analizleri için. Parti A için boyut standardı.
Numune Yükleme Çözümü (SLS)AB Sciex608082Otomatik parça analizleri için.
Sıralama plakası - 96 Kuyulu Polipropilen PCR MikroplakaCostar6551Otomatik parça analizleri için.
Plaka santrifüjü, PCRVWR PeqlabNAmini plaka santrifüjü.
Tampon plakası - 96 Kuyulu ÇED/RIA Şeffaf Düz Tabanlı Polistiren İşlem Görmemiş MikroplakaCorning9017Otomatik parça analizleri için.
GenomeLab Ayırma tamponuAB Sciex608012Otomatik parça analizleri için.
Ayırma Jeli - LPAIAB Sciex608010Otomatik parça analizleri için.
Sequenzer - CEQ8000 Genetik Analiz SistemiBeckman CoulterNAOtomatik parça analizleri için.
GeneMarker V1.95SoftgeneticsNAOtomatik parça analizlerinin sonuçlarını analiz etmek için.
DNA Proteinaz K Herhangi reaksiyon karışımları için ürünlerini döndürmek için kullanılan PerfectSpin P

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
  2. Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
  3. Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
  4. Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
  5. Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
  6. Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
  7. Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
  8. Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
  9. Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
  10. Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
  11. Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
  12. Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
  13. Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
  14. Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
  15. Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
  16. Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
  17. Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
  18. Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
  19. Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
  20. Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
  21. Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
  22. Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
  23. Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
  24. Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
  25. Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
  26. Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6(2007).
  27. Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
  28. Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
  29. Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
  30. Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831(2007).
  31. Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501(2014).
  32. Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
  33. Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12(2008).
  34. Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ba rsak eri i AnaliziGruba zg PrimerlerDNA EkstraksiyonuPCR AmplifikasyonuSSCP AnaliziOtomatik Fragment AnaliziTrofik EkolojiBesin A Etkile imleriPrimer Spesifitesi

İlgili makaleler