Doğal olarak kadın Suriye hamster davranışları ödüllendirme sırasında hücre dışı nörotransmitter ölçüm Vivo içinde değişimler

Özet

Bu kağıt dopamin ve Glutamat yüksek zamansal çözünürlük ile serbest bırakılması sırasında doğal tatmin edici davranışlara ölçmek için karbon fiber elektrotlar ve enzimatik Biyoalgılayıcı teknoloji kullanarak sabit potansiyel amperometric kayıtları kullanımı detayları kadın hamster.

Özet

Nörotransmitter yayın bir hızlı zaman ölçeğinde ölçmek için yeteneği belirli davranışları veya manipülasyonlar bağlanacak şekilde neurotransmission şekillerinin sağlar; temel mekanizmaları ve devre elucidating güçlü bir araç. Microdialysis tekniği beyin ilgi hemen hemen her analit ölçmek için yıllardır kullanılan iken, bu teknik de geçici çözüm sınırlıdır. Alternatif olarak, hızlı tarama çevrimsel voltammetry geçici kesin ve son derece hassas biri; Ancak, teknik olarak zor bu yöntem ilgi analitin electroactivity üzerinde kullandığından, nonelectroactive maddeler (örneğin, nörotransmitter Glutamat) algılamak imkanı ortadan kaldırmıştır. Bu kağıt sabit potansiyel amperometry ve electroactive ve nonelectroactive nörotransmitter zamansal hassasiyetle ölçmek için enzimatik biosensing bir araya getiren bir anahtar teslim sistemi ayrıntıları. Bu iki güçlü teknikleri eşleştirme tonik ve phasic neurotransmission ölçüm için göreli kolaylıkla sağlar ve aynı anda birden fazla nörotransmitter kayıt izin verir. Bu yazının amacı görüntüleme nihai hedefi ile kadın hamster içinde doğal olarak tatmin edici davranış (Yani, cinsel davranış) kullanarak dopamin ve Glutamat neurotransmission in vivo ölçme işlemi göstermektir Teknik fizibilite diğer davranışları ve deneysel paradigmalar incelenmesi için bu testin.

Giriş

Nörotransmitter yayın davranıyor uyanık hayvanlarda ölçmek için yeteneği belirli davranışlar mekanizmaları ve her ikisi de temel devresi araştırmak için güçlü aracı neurotransmission bir kayma ve temporal desenleri ile bağlamak araştırmacılar doğal izin verir ve gerçek zamanlı olarak operant davranışları. Tarihsel olarak, microdialysis beyin¹ekstraselüler ortamında hem elektrikle reaktif ve tepkisiz maddeler ölçmek için istihdam edilmiştir. Bu teknik ekstraselüler sıvı, benzer iyonik kompozisyon sulu bir çözüm, sürekli bir akış küçük bir şaft bir semipermeable hollow fiber membran²/ yapılan bir ucu ile oluşan bir microdialysis sonda aracılığıyla kullanır. Sonda eklemeden sonra nörotransmitter veya diğer analitler ilgi semipermeable membran daha sonraki analiz için aralıklarla yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC), tarafından toplanmakta önce pasif Difüzyon tarafından çapraz olabilir bir analitik kimya teknik ayırmak için yaygın olarak kullanılan tanımlamak ve heterojen karışım³bileşenlerinde ölçmek.

Microdialysis hemen her analit ilgi ölçmek için kullanılan hassas bir teknik olmasına rağmen zamansal çözünürlük ile dakika dakika^1,2onlarca sırasına en yüksek örneklendirme oranı düşüktür. Hızlı tarama çevrimsel voltammetry (FSCV), electroactive türleri, redoks potansiyeli dayanır bir teknik icadı ekstraselüler sıvı ilgi analit anlık konsantrasyonları yakınındaki aydınlatmak. Kısaca (bkz: Robinson vd. ⁴ için kapsamlı bir inceleme), bir elektrot yükseltmek ve daha düşük bir üçgen dalga moda hızlı zaman ölçeği⁴gerilim uygulanır. Gerilim daha doğru varsa, bileşik faiz art arda okside azaltılmış ve. Küçük bir alternatif akım oluşturur bir hareket elektronların bu oksitlenmeye ve azaltma sonuçları. Oranları gerçekleşecek oksitlenmeye ve bileşikleri mikrosaniye cinsinden meydana gelen azalma ile alt ikinci ölçekte tarama. Arka plan geçerli elde edilen geçerli yoklama tarafından oluşturulan çıkararak, bir vs geçerli çizim her bileşik için benzersiz bir gerilim oluşturabilir. Gerilim salınımlarını zaman ölçeğini bilinir, bu veri geçerli bir arsa bir fonksiyonu olarak hesaplamak için kullanılabilir. Böylece, bileşik göreli konsantrasyonları aktarılan toplam elektron sayısı her oksidasyon ve Redüksiyon tepki⁴bilinen olarak belirlenebilir.

Bu kimyasal özgüllük ve yüksek zamansal çözünürlük FSCV kimyasal konsantrasyonu vivo içindedeğişen algılamak için güçlü bir teknik olun. Ancak, bu manifoldu avantajlara rağmen bu teknik kapsamlı teknik uzmanlık ve pahalı ekipman ve kurulum gerektirir. Ayrıca, nonelectroactive nörotransmiterler (örneğin, Glutamat) bu tekniği kullanarak ölçülen olamaz. Neyse ki, elektrokimya⁵, hem de ticari kullanım bu buluşlar alanında teknolojik gelişmeler electroactive sigara nörotransmitter davranıyor uyanık hayvanlarda ölçmek için nispeten basit bir yaklaşım tanıttı hassas bir enzimatik Biyoalgılayıcı teknoloji olarak bilinen zamansal tekniği ödün vermeden. Bu tekniği kullanan bir uygulanan potansiyel^{5 tarafından oluşturulan bir amperometric oksidasyon geçerli olarak belirlenen electroactive hidrojen peroksit biri enzimatik nonelectroactive nörotransmitter ilgi içine dönüşüm iki yüzeylerde,} . Piyasada bulunan Biyoalgılayıcı sondalar (bkz. şekil 1) seçerek analitler ilgi rekabetçi endojen interferents katkısını azaltarak ölçmek. Glutamat durumunda, ortak interferent askorbik asit (AA) katkısını rekabetçi ölçülen geçerli AA oksidaz AA sigara electroactive için dönüştürme sensörün aktif enzimatik yüzeyine co yerelleştirme tarafından azalır dihydroascorbate ve su. Buna ek olarak, bir olumsuz ücret Nafion polimer tabaka enzim tabakasının altında mevcut endojen iyonik bileşikler içermez.

Bu aynı Biyoalgılayıcı deneysel kurulum-ebilmek ölçü electroactive nörotransmiterler olduğu gibi FSCV ama bunun yerine bir sabit-potansiyel kayıt⁶kullanır. FSCV içinde uygulanan salınım voltaj aksine, bir sabit-potansiyel kayıt gerilim Redoks faiz analit için potansiyel tutulur. Birden çok nörotransmitter ezici bir çoğunlukla doğru bir nörotransmitter çarpık beyin alanlarda aynı Redoks potansiyeli olabilir gibi FSCV daha az kimyasal olarak seçime bağlı olsa da, bu yaklaşımın komple doğa kimyasal eksikliği daha ağır basar özgüllüğü.

Electroactive ve nonelectroactive nörotransmitter sürümde yakın gerçek zamanlı ölçmek ve belirli davranış olaylara bağlamak için yakınsak nörotransmitter yayın incelemek için bir fırsat sağlar. Bu el yazması yanıt uyanık davranan hamster doğal ödül olarak dopamin ve Glutamat neurotransmission sorguya çekmek için bu sistemi ayrıntıları. Bu kağıt bu nörotransmitter yayın sırasında diğer davranışları ve deneysel paradigmalar incelenmesi için onun fizibilite gösteren amacı ile kadın hamster cinsel davranışlara Ölçme işleminin detay amaçtır.

Elektrokimyasal kayıtları kullanmak için ideal bir model hamster are
Tarihsel olarak, sıçan ve fareler modelleri cinsel davranış çalışmada istihdam edilmiştir. Bu kemirgen türler atlamalı, darting ve kulak kovalamak ve sonuçta mount kadın⁷erkek ikna için kıpır kıpır dahil çok sayıda kadın talep davranışları içeren bir dinamik çiftleşme sırayla meşgul. Erkek (veya vajinal penetrasyon olmadan) tarafından montaj sırasında etkin talep davranışları sürdürme önce sadece birkaç saniye için ( lordozdenir) onun cinsel davranış duruş da dişi yürütmektedir yalnızca birkaç saniye sürer. Bu davranış, hareketsizlik, kısa süreler ile serpiştirilmiş etkinliği yüksek düzeyde oluşan hayvanlar davranışlar içinde neurotransmission ölçmek için sorunlu kalıptır. İlk olarak, sinirsel aktivite ile ilgili olmayan amperometric kayıtları hareketi eserler olabilir. İkinci olarak, hareket bazı beyin bölgelerinde belirli nörotransmitter sürümü ile ilişkilidir. Örneğin, dopamin yayın dorsal ve ventral striatum^8,9, psikostimülan takiben dopamin microdialysis ölçümleri için temel bir bulgu Lokomotor aktivite birleştiğinde Yönetim¹⁰. Çünkü erkek tipik talep davranış ecek içindet kemirgenler Lokomotor aktivite düzeyi yüksek içerir ve bir 10 dakika cinsel davranış testi toplu tarafından temsil edilir, bu zor neurotransmission değişimler topluca sadece son açık bileşenleri cinsel davranış için atfetmek yapar dakika.

Nörokimyasal profil sahibi kadın cinsel davranışı çözümlemek için bu laboratuvar cinsel davranış eşlik eden en az Lokomotor aktivite olduğu bir tür aradı. Suriye hamster (Mesocricetus hava) çiftleşme sırayla talep davranışları genellikle görülen sıçanlar ve fareler¹¹eksikliği nedeniyle nörokimyasal kayıtları için idealdir. Sonuç olarak, kadın hamster girmek ve korumak için lordoz duruş 10 dakikalık oturum¹²test 9 dakika yukarı. Lokomotor hareketlerle yabancı kadın, in vivo eksikliği ile erkek ile cinsel etkileşimlerin bileşenlerle ilişkili olabilir elektrokimyasal kayıtları elde edilebilir.

Çiftleşme nöbetleri hamster içinde
Test odasına erkek uyarıcı hayvan giriş sonra erkek başlangıçta onun (Şekil 2A) montaj önce anogenital soruşturma (AI) kadın meşgul olacak. Sırayla bağlamaya erkek, dişi bir alıcı cinsel duruş içinde onu geri kemerler ve montaj erkek penis vajinaya erişebilirsiniz böylece kuyruğunu saptırır lordoz, olarak bilinen varsaymalıyız. Erkek her iki paws (Şekil 2B), ile onun hindquarters clasping erkek, dağ ve penil sıra (Şekil 2C) elde etmek için bir girişim sokmak başlar. Erkek erkek (olmadan ekleme) mount yanı sıra sonunda boşalma ulaşmak daha önce birkaç kez intromit. Bu bağlar ve boşalma için önde gelen intromissions dizisi "çiftleşme ne dersin" olarak adlandırılır. Erkek-ecek-si olmak birkaç çiftleşme nöbetleri içinde tek bir oturum.

Protokol

burada açıklanan tüm yordamlar kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Minnesota Üniversitesi tarafından onaylanmıştır ve uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları Guide olarak vardır ¹³ .

1. hayvanlar ve Cannulation cerrahi

1. elde edilir Suriye hamster yaş yaklaşık 55 gün bir ortak hayvan tedarikçiden.
   Not: hayvan yaş nedeniyle çeşitli deneysel paradigmaların kısıtlamalarını değişir, cinsel davranış için tüm yaklaşık aynı yaşta cinsel olgun hayvanlar elde etmek önemli olsa.
2. Ev hayvanlarda kontrollü bir sıcaklık (22 ° C) ve (14 10 h ışıklar, 13:00 h ile karanlık ardından h ışık) aydınlatma çevre, gıda ve su kullanılabilir ad libitum dönemlerde deneysel test ile.
   Not: hamster sezona göre yeniden beri bu 1410: açık/koyu döngüsü taklit eden kendi doğal üreme koşulları.
3. Laboratuvar 1 haftalık calıştıkları aseptik ikili ovariectomies ve kafa içi stereotaksik cannulations (örneğin, Fentobarbital) genel anestezi altında yapmak ve yönetmek uygun kurumsal olarak onaylı Post-Operatif analjezik ve antibiyotik tedavisi daha önce açıklandığı gibi ^{14 , 15}.
   Not: cinsel davranış çalışma için ovariectomies hayvanlar düzgün eksojen hormon uygun olarak deneysel zaman çizelgesi ile cinsel algılama için indüklenen cinsel hormonları önemli endojen kaynağı kaldırmak gereklidir.
   1. Dopaminerjik ve glutamatergic sonda implantasyonu, Stereotaxic Kılavuzu Kanüller (0.7 mm çap; implant şekil 3) ilgi alanı içine (örneğin, bu laboratuvar doğru nucleus accumbens (NAc) hedef) ¹⁵ başka bir yerde kademeli ayrıntılı olarak açıklandığı gibi.
      Not: bir Glutamat veya dopamin sondası hayvan başına tek sensör kayıtları üzerinden sunulan veriler olmasına rağmen tek bir hayvan 4 sensörler aynı anda kayıt için bu sistemi sağlar; Böylece, 1-4 Kanüller istenen deneysel tasarım ve sonuçları bağlı olarak implante.
      1. Bölge stereotaksik atlas kullanarak ilgi implant koordinatlarını belirleyin (örneğin, Altın Hamster Brain Morin tarafından & ahşap), sensör 1 mm kanül altında beyin dokusu içine uzanır akılda tutulması.
   2. Sonra bir kanül Stereotaxic istediğiniz ventral dorsal yere indirdi, bir kap diş akrilik, paslanmaz çelik kemiği vida ve plastik bir kafa ile güvenli inşa kullanarak kafatası yapıştırmayın mount ( şekil 3 ; ¹⁵ daha fazla bilgi için bkz:).
   3. Karbon fiber test etmek için bir referans elektrot (350 mikron çapında, 7.5 mm toplam uzunluk) kontralateral Yarımküre takın.
      Not: Bir belirli konum veya kanül mesafeden gerekli değildir; referans elektrotlar yer yerleştirilebilir herhangi bir yerde uygun kontralateral Yarımküre.

2. Biyoalgılayıcı ve karbon Fiber test

1. 1 haftalık Cerrahi Kurtarma, cinsel algılama ikna etmek için hormon astar rejimi yönetmek.
   1. Estradiol benzoat ayçiçek yağı 0.1 ml 10 µg subkutan enjekte (SC), yaklaşık 48 saat ve cinsel davranış, cinsel algılama erkek ¹¹ doğru ikna etmek için test önce 24 saat.
   2. Enjekte 500 µg, progesteron ayçiçek yağı, SC, erkek cinsel algılama ¹¹ ikna etmek için giriş önce 4 h 0.1 ml.
2. Beyaz ve kırmızı ışığı koşulları ^{16 , 17} test altında değişiklik tabi kemirgenler sosyal davranışlarını olduğu gibi onların günlük döngüsü, karanlık aşamasının başında bütün hayvanlar test ^{, 18}.
3. enzimatik Biyoalgılayıcı Glutamat sınama, sensörler vitro ( şekil 4) ^{15 ,} daha önce açıklandığı gibi kullanımdan önce kalibre ¹⁹.
   1. yapmak kalibrasyon çözüm 20 mL cam test gününde taze tüpler santrifüj kapasitesi. Analit çözüm için 7.4 mg L-glutamik asit yavaşça tüp ters çevirme tarafından ultra-saf H ₂ O 10 mL geçiyoruz. İnterferent çözüm 176.1 mg AA 10 ml ultra-saf H ₂ O. çözülerek olun
   2. Kurmak için bir temel laboratuar yüzük stand temel alınarak bir manyetik karıştırıcı yerleştirerek kalibrasyon. 20 mL ceketli kabı manyetik karıştırıcı üstüne yerleştirin ve bir orta 2 prong kelepçe kullanarak yerde kelepçe.
      1. Ekle manyetik heyecan bar ve 100 mM fosfat 20 mL serum fizyolojik (PBS) ceketli kabı arabelleğe alınmış. Arabellek çözüm 37 ısıtmak için dolaşan bir su banyosu ceketli kabı bağlanmak ° C.
         Not: enzimatik aktivite sıcaklığı ile etkilenir bu yana enzimatik Biyoalgılayıcı kalibrasyonlar vücut sıcaklığında gerçekleştirilmelidir.
   3. Yer sensör kalibrasyonu tutucu üzerine ceketli kabı ve bir dik açılı mengene kullanarak yerde güvenliğini sağlama üstte 4 kanallı kalibrasyon Pre amplifikatör ayarla. Pre amplifikatör veri klima ve satın alma aygıtı kayıt kalibrasyon verilerine bağlanın.
   4. Her enzimatik Biyoalgılayıcı Glutamat (veya diğer analitler için diğer ticari olarak mevcut Biyoalgılayıcı sondalar örneğin, glikoz ilgi) duyarlılığını test önce deneysel kayıt kalibrasyon tutucusuna sonda yerleştirerek bir ceketli kabı, algılama kavite ve gümüş klorür (AgCl) başvuru tel tampon çözelti içinde bir kısmı batış.
      1. Bir bağlantı noktasına bir 4 kanallı kalibrasyon Pre amplifikatör test edilen her sensör (en fazla 4) bağlanmadan önce ücretsiz indirilebilir satın yazılım kullanan bilgisayar arayüzü yeni bir kayıt başlatmak. Alıcıları çok istikrarlı bir temel ulaşmak izin.
   5. Sensörler istikrarlı bir temel ulaştığında analit enjeksiyonları eklemeye başlamak. Delik kalibrasyon tutucu pipet ucu arabellek çözüm tanıtmak için kullanın. Bir enjeksiyon yapıldığında açıklama eklemek için kayıt yazılımı hızlı anahtar ek açıklama aracını kullanın.
      1. Olun 10 µM eklemeler Glutamat pipetting 40 μL analit çözüm arabellek çözüm içine. Eklemeler stabilize etmek sensör için bekleyin. İnterferent AA çözümden (50 μL enjeksiyon hacmi 250 Mikron değişim konsantrasyon için) tek bir enjeksiyon eklemeden önce analit çözüm 3 enjeksiyonlari ekleyin.
         Not: Kalibrasyon (Adım 2.12 enzimatik deneysel kayıt sırasında görülen) amperometric sinyal değişiklikleri dönüşüm Glutamat konsantrasyonu, değişikliklere istenirse sağlar. Başvuru ¹⁵ kademeli yönerge için bkz:. Bu laboratuvar tarafından kullanılan dopaminerjik probları üretim sürecinde ticari sağlayıcı tarafından kalibre. ¹⁹ enzimatik bileşenleri aşağılamak gibi zaman içinde onların hassasiyeti düşürebilir gibi Glutamat probları kullanım zaman ayarlanması gerekir. Karbon fiber elektrotlar bozulması tabi olmayan, şirketin Sevkiyat öncesinde gerçekleştirdiği kalibrasyon t yeterli boyunca çünküİşte ek işleme aracılığıyla ince karbon fiber (350 mikron çapında) zarar bir artış olasılığı.
4. Test odası ile yatak hayvandan alınan satır ' s ev kafes.
   Not: Bu dişi artırır ' test ile s aşinalık odası, yanı sıra cinsel uyarıcı estradiol tedaviye yanıt kadın tarafından dağıtıldı koku çiftleşme ipuçları erkek ortaya koyar.
5. Hafifçe isoflurane ya da başka bir uçucu anestezi indüksiyon odasında hayvanlar sonda ekleme öncesinde anestezi.
6. Tıkayıcı obdurator Kılavuzu kanül çıkarıp karbon fiber elektrot veya rehber şaft aracılığıyla enzimatik sonda takın.
7. Sonda eklemeden sonra hayvan test odasında yerleştirin.
   Not: Bu laboratuvar 10-gal cam akvaryum (24,5 x 48.9 x 29.4 cm) kullanır, ancak eşit alan yuvarlak odaları-da var istihdam.
8. Video ve zaman kilitli amperometric sinyal kayıt bir ticari yazılım programı, Begin açıklanan ayrıntılı olarak başka bir yerde ¹⁵.
9. Bağlanmak duyumsal için kayıt sistemi: elektrikle korumalı bir kablo ve bir elektrik döner üzerinden potansiyostat. Sensör bağlantı bir PIN eki baş bağlama üzerine vidalama ile sabitleyin. Gerekirse laboratuvar film kullanarak bağlantı güçlendirmek.
   Not: Özelleştirilmiş bir bağlayıcı enzimatik Glutamat sensörleri doğrudan potansiyostat için bağlı olma varken potansiyostat için karbon fiber elektrot ve referans elektrot eklemek gereklidir.
10. İzin deneysel test etmeden önce beyinde equilibrate sensörü.
    Not: Denge saatleri kayıt sensör bağlı olarak farklılık gösterir (örneğin, enzimatik sensörler gerektirir 2-4 h denge, karbon-fiber elektrotlar sadece yaklaşık 30 dk gerektiren süre). Her iki tip sensörler implante edilir, enzimatik sensör uzun equilibrate.
11. Sensör denge sonra bir uyarıcı erkek test odasına tanıtmak.
12. Uyarıcı erkek tarafından penis ekleme (adlandırılan sıra) ile ilk mount, kayıt için ek bir 10-30 dakika bağlı olarak deneysel gol devam.
13. Davranış test, takip kesin dişi ' s sensörü.
14. Her iki hamster test odasından kaldırın. Yatak çıkarmak ve % 70 etanol kullanarak odası temiz.
    Not: karbon fiber kayıtları için gerekli kısa denge nedeniyle adımları 2.3-2,14 aynı gün içinde birden fazla hayvan test etmek için tekrar edilebilir. Enzimatik sensörler yaklaşık 4 h denge gerektirdiğinden, hayvanların farklılıkları nedeniyle mümkün arası konu varyasyon sınırlamak için günlük sadece bir hayvan buna ek olarak, test ' test sırasında sirkadiyen saat.

3. Fedakarlık ve perfüzyon

1. test sürelerin takip derin anestezi kadın denek bir euthanizing maddesi ile (örneğin, laboratuar kullanır 0.2 mL fenitoin ve Fentobarbital çözüm mayi bir enjeksiyon) .
2. Transcardially sıvı 25 mM %4 paraformaldehyde-PBS kullanarak 20 dk saplantı tarafından takip tüm dolaşımdaki kan kaldırmak için PBS pH 7,6, hayvanla.
3. Beyin kaldırmak ve içinde postfix ~ 30 mL 50 mL konik tüp gecede %4 paraformaldehyde çözeltisi.
   1. Mağaza % 10 beyinde Sükroz PBS çözüm hazır seri bölümüne kadar.
      Not: Beyin kirletici potansiyel büyüme önlemek için haftalık Sükroz çözüm değişiklikleri ile 2 hafta için depolanmış olabilir.
4. Seri Bölüm 40 µm beyinde dilim ile ikisinden biri implant bölgesi boyunca buz gibi bir microtome ya da cryostat daha önce açıklandığı gibi ¹⁹.
5. Dilimleri seri olarak piyasada bulunan Yapışkan kaplı slaytlarda mount (veya yapmak için ²⁰ bakın). En az bir gecede kurumaya izin.
6. Kresil Mor boya, açık, slaytlarla leke ve coverslip daha önce açıklandığı gibi ²⁰.
7. Görüntü sensörünün anatomik yerleşim onaylamak için parlak alan mikroskobu kullanarak slaytları.

4. Davranışsal kodlama

1. görünümü ve videoları ücretsiz ticari olarak indirilebilir yazılım kullanarak açıklama (Tablo malzemeleri görmek) tam kod davranışları amperometric sinyal zaman kilitli yavaş çekimde.
   Not: MATLAB kodu kullanabilmek için (bkz: ), başlangıcı ve sonu her kadın açıklama ' s ve erkek ' s davranışlar.
   1. Açıklama Ekle startLordosis kadın onu geri dorsoflexion başlatır ve kuyruğunu yukarıya doğru kusurları çerçeve içinde. Dişi dişi test odasında başka bir konuma readjusts bağlandığınızda sık sık oluşur bu duruş, sonlandırıldığında endLordosis açıklama.
   2. Açıklama startAI dişi lordoz duruş ve erkek onun burun dişi doğru hamle olduğunda ' s anogenital bölge, nerede koklama, yalama veya onun perineal bölgesini koklaşmaya oluşabilir. Ne zaman erkek dişi yakın bir mesafede onun burun kaldırır endAI açıklama ' s anogenital bölge.
   3. Erkek yaklaşımlar ve Bağlama girişimi (örneğin, yan, kıç) yönünü ne olursa olsun bir montaj duruş kadın onun forepaws koyar startMount açıklama.
   4. Açıklama startIntromission ne zaman başarılı agresif bağlı erkek penis dişi erişir ' s vajina.
      Not: Bir sıra bağlı olarak erkek gözle görülür onun üst bacaklarda bedeni doğru çeker onun pelvis ileri bindirmeler ve kuyruğunu yukarıya doğru penetrasyon gösteren bukleler sıra önce oluşan agresif üzerinden davranışsal ayırt (bkz < güçlü sınıfı "xfig" = > şekil 4 C).
      1. Uygun olduğunda ek açıklama boşalma.
         Not: bir çiftleşme butik ve başarılı bir sıra ile birlikte sonunda, erkek boşalmak olacaktır. Bir gerçek emisyon görselleştirmek mümkün olsa da, ortaya çıkışı, boşalma ayak hareketi açıklama onların arka ayak hareketlerle bir sıra ²¹ sırasında böylece ayakla basma karakteristik bir erkek hamster var.
   5. Açıklama endIntromission ve endMount aynı anda çerçeve içinde erkek onun açık iki pençesi kaldırdığı ve böylece dişi ile hiçbir temas vardır. Görselleştirmek için sık yetersizlik nedeniyle kararla, eşzamanlı kod nöbetleri çiftleşme arasında tutarlılık ve güvenilirlik için izin vermek için bu iki davranışlar.
      Not: Bir çiftleşme butik ya başarılı bir boşalma izler ya da dişi en az bir bağlama takip lordoz duruş kırıldığında.

5. Örnek veri analizi

Not: sabit potansiyel karbon fiber ve enzimatik kayıtları kullanımı için dopamin birND Glutamat, sırasıyla, tonik ve elektrokimyasal yayın phasic kalıpları ölçmek için yeteneği sağlar. Bu laboratuar ücretsiz, ticari kazanç sistemi kullanır ve yazılım dönüştürmek ve kaydetmek için analog sinyalleri dijital kaydedilen (0,600 V, örnekleme hızı önyargı 1 Hz =).

1. Örnek veri çözümleme protokolü açıklaması
   1. diğer programları kullanılabilse ölçmek tonik ve MATLAB kullanarak kaydedilmiş elektrokimyasal sinyal phasic (geçici) değişiklikleri.
      1. İçin sunulan veri, 50 puanlık hareketli ortalama filtre kullanarak tonik sinyali hesaplamak. Sinyal bir salt geçici normalleştirilmiş temsil ham veri tonik sinyali çıkarılarak hesaplanır. Phasic doruklarına tanımlarken, çeşitli algoritmik seçenek vardır (1'den daha fazla sinyal değişiklikleri olarak tepeler etiketleme örneğin, ortalama yukarıda SD).
      2. Bu tepeler, Yani, yerel maxima konumlarını tanımlamak, normalleştirilmiş sinyalini en az pik genlik ile MATLAB işlevi peakfinder kullanarak kök ortalama kare sinyal için ayarlayın. Normalleştirilmiş sinyalini tespit doruklarına konumunu her ayında en yüksek genlik ayıklamak için kullanıldı. Olabilir ile rastlayan, ya da göreli tepe nörokimyasal soruşturma altında sürüş herhangi bir zaman kilitli davranışların tanımlanması için zirveleri algılama yeteneğini sağlar.
   2. Kesimi (bkz. Adım 3) davranış ek açıklamalar doğrultusunda işlenen verileri; bir öğrenci ' s t-testi tonik nörotransmitter düzeyinde, geçişler oluşumunu ve genlik farklılıkları değerlendirmek için kullanılan geçişler sırasında nöbetleri çiftleşme sırasında önceden çiftleşme ne dersin lordoz lordoz karşı. Tonik desenleri elektrokimyasal sürüm değişiklikleri ölçmek için lordoz konumu (örneğin, önceden çiftleşme ne dersin lordoz) çiftleşme bir müddet önce doğrudan sırasında meydana gelen veri noktaları veri noktaları için bir çiftleşme bout sırasında karşılaştırıldı bir t-test kullanarak oturumu
2. Açıklanan veri çözümleme protokolü için ham veri hazırlanması
   Not: diğer programlar veya analizler aynı derecede uygun seçenekler olsa da belirtildiği gibi yukarıda açıklanan MATLAB kodu kullanmak için ham veri olarak hazırlanmalıdır Şu şekilde:
   1. ek açıklama ve gerilim dosyalarını verme. Altında bunun için ' dosya ' sekme, seçme ' ihracat ' işlev ve seçin ' ek açıklamaları ' ek açıklamaları kaydetmek için sekme. Altında ' dosya ' sekme, seçme ' ihracat ' işlev ve seçin " TSV ' voltaj ölçümleri TSV uzantısı dosya olarak kaydetmek için sekme.
   2. Her dosyayı bir elektronik tablo programı ile açın ve Farklı Kaydet'i ' xls/xlsx ' dosyaları MATLAB ile uyumlu hale getirmek için.
      Not: İçin ' ek açıklama ' dosyası, ek el ile ek açıklamaları başlangıcı ve sonu her iki önceden çiftleşme ne dersin lordoz (PreMBlordorsis açıklamalı, dikte etmek için bir elektronik tablo programında sonrası ihracat eklendi ) ve çiftleşme ne dersin bu zaman Puan doğrudan belirtildiği gibi karşılaştırılabilir içinde gaza 5.1.2.
   3. Açıklama önceden çiftleşme ne dersin lordoz (startPreMBlordosis) başlangıcı aynı anda lordoz davranış (startLordosis) aynı zamanda başlar gibi bir bağlama davranışı içerir ve aynı zamanda yeni bir başlangıcında çiftleşme ne dersin Eğer dişi lordoz duruş kalır.
   4. İlk monte başladığında önceden çiftleşme ne dersin lordoz (endPreMBlordosis) sonunda açıklama.
   5. Bu çiftleşme bir müddet başlangıcı anlamına gelir gibi çiftleşme dersin (startMB) başlangıcı endPreMBlordosis, aynı zamanda ek açıklama.
   6. Bir çiftleşme ne dersin (endMB) iki ucundaki bir boşalma içeren bir bağlama sonu açıklama (bkz. Adım 4.1.4.1), ya da dişi takiben ' s sona ermesi lordoz duruş (endLordosis).

Sonuçlar

Elektrokimyasal ve davranışsal yukarıda açıklanan metodoloji kodlama kullanarak, bu lab tonik ve dopamin ve Glutamat phasic dalgalanmalar cinsel davranış vivo kayıtları sırasında karakterize etmek başladı. Bu metodoloji geçici hassas şekilde nedeniyle, daha doğrusu cinsel davranış sırasında neurotransmission karakterize olabilir; aynı zamanda yayın şekillerindeki belirli değişiklikler karşılık gelen tonik değişiklikleri için karşılık gelen geçici dalgalanmalar ve çiftleşme nöbetl...

Tartışma

Nispeten basit olsa da, bazı sorunlar bu tekniği istihdam ortaya çıkabilir. İlk olarak, sondalar stereotaksik yerleşimini kesin olmalıdır: sonda çevreleyen ekstraselüler ortamın daha geniş bir yarıçap örnekleri microdialysis bu teknik yalnızca doğrudan temas gelir bir nörotransmitter ölçüm verir sonda ile. İkinci olarak, kablo, küçük genişliği nedeniyle karbon fiber kayıt durumunda kırılması meydana gelebilir ve sonda kasıtlı bakımı ile eklenmesi gerekir. Sonda garantili-süre içinde 3-hafta kullanılırsa glutamatergic biy...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nembutal	Meşe İlaç A.Ş.	76478-501-50	Pentobarbital sodyum enjeksiyonu, USP. Bu laboratuvarda 8.5 mg/100 g vücut ağırlığı kullanılarak intraperotineal olarak enjekte edilmiştir.
Loxicom analjezik	Norbrook Laboratuvarları	6451603670	NSAID, postoperatif ağrı kontrolü için kullanılan aninflamatuar ve analjeziktir. Jenerik: meloksikam.
Enroflox antibiyotik&	Norbrook Laboratuvarları	5552915411	Ameliyat sonrası enfeksiyonun önlenmesi için florokinolon antibiyotik. Jenerik: Enrofloksasin.
Beuthanasia-D	Merck Hayvan Sağlığı	00061047305	Pentobarbital Sodyum, Fenitoin Sodyum ötenazi ajanı.
Kemik vidaları	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" kemik vidası (Pkg. 16) kafatası kapağını kafatasına takmak için kullanılır.
Diş akrilik (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Kendiliğinden kürlenen diş akriliği, kanülü ve kafa montajını kafatasına yapıştırmak için bir kafatası başlığının yapımında kullanılır.
Donanım biyosensör kurulumu	Pinnacle Teknolojileri A.Ş.	8400-K2	Pinnacle, fareler için bağlı biyosensör sistemimizin yeni kullanıcıları için eksiksiz donanım kitleri sunar. Kitler arasında bir komütatör, ön amplifikatör ve veri koşullandırma ve toplama sistemi
Temel video bilgisayar paketi	Pinnacle Technologies, Inc. bulunur.	9000-K1	Temel bilgisayar paketi, geniş sabit disk depolama alanına sahip önceden yapılandırılmış bir bilgisayar, yüksek çözünürlüklü bir monitör, klavye ve fare, kesintisiz güç kaynağı ve gerekli tüm kabloları içerir.
Video EQ700 EverFocus kamera ve nbsp; paket	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	Bağımsız IR kaynağına sahip EQ700 gece görüş özellikli kutu kamera, Pinnacle video bilgisayar paketinin bir parçası olarak elde edildi. Dome kamera (9000-K9) ve HD kamera (9000-K11) seçenekleri de mevcuttur.
Sirenia Satın Alma yazılımı	Pinnacle Technologies, Inc.	Ücretsiz--pinnaclet.com	Sirenia'dan indirilebilir  Edinim, herhangi bir Pinnacle donanım sisteminden veri kaydetmek için tek bir platform sağlar. Yazılım, tüm veri akışlarının senkronizasyonu, kullanıcı tarafından yapılandırılabilir ayarlar, veri konsolidasyonu ve çoklu dışa aktarma seçeneklerine sahiptir. Ek olarak, yazılım biyosensör kayıtları için temel inceleme ve analiz modüllerini içerir. Sirenia  Veri toplama ve inceleme için ideal olan ücretsiz LL'si bir arada yazılım sunar.
Bağlı sıçan  in vitro  kalibrasyon kiti	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	Bir biyosensör tarafından ölçülen akım değişikliklerini analit konsantrasyonundaki gerçek değişikliklerle ilişkilendirmek için, hayvana implantasyondan önce biyosensörün kalibre edilmesi gerekir. Süreç aynı zamanda sensörlerin bütünlüğünü ve seçiciliğini de doğrular.  Kalibrasyon kiti 20 mL ceketli beher (#7058), 1/2" x 1/8" manyetik karıştırma çubuğu (#7059), dik açılı kelepçe (#7056), 2 uçlu tek ayarlı kelepçe (#7055), 4 kanallı kalibrasyon preamplifer (#7053) ve kalibrasyon tutucu (#7051) içerir.
Karıştırma plakası	Corning	6795-410D	Corning dijital Karıştırıcı, 5 "x 7", 120 VAC, glutamat biyosensörlerinin in vitro< / em> kalibrasyonu sırasında ceketli beherde manyetik karıştırıcıyı döndürmek için kullanılır.
Kapalı döngü sirkülasyon yapabilen su banyosu	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standart Dijital Isıtmalı Sirkülasyon Banyosu, ceketli beheri fizyolojik sıcaklığa ısıtmak için plastik boru ile 120VAC su banyosu kullanıldı.
BASi sıçan kanülleri ile karbon fiber sensör	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Dopamin nörotransmisyonunu kaydetmek için kullanılan karbon fiber elektrot.
Ag / AgCl referans elektrodu	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Karbon fiber kayıtlar için gereklidir.
Glutamat biyosensörleri	Pinnacle Teknoloji, Inc.	7001	Glutamaterjik nörotransmisyonu kaydetmek için kullanılan enzimatik biyosensör probu.
BASi kılavuz kanülleri	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Probu yönlendirmek için beynin ilgilenilen bölgesine implante edilen kanülleri yönlendirin.
Fareler için BASi kanül plastik başlık	Pinnacle Teknolojileri A.Ş.	7011	Başa montaj, probu stabilize eder ve potansiyostata bağlanır.