Yöntem makalesi

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

DOI:

10.3791/56144

⸱

17 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, 2Department of Diagnostic and Biological Sciences and Institute for Molecular Virology, University of Minnesota

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boş hücre transkripsiyon-çeviri platformları yeni nesil Gen devreleri yürütülmesi ile biyokimyasal sistemleri vitro oluşturmak için tasarlanmış. Bu makalede, nasıl bacteriophages MS2, ΦΧ174 ve T7, gibi bir bütün E. coli boş hücre TXTL sistemini kullanarak kendi genom sentezlenmiş açıklayın.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boş hücre transkripsiyon-çeviri (TXTL) sistemleri, bir daha fazla çok yönlülük ve modülerlik, temel ve Uygulamalı Bilimler test tüpü tepkileri gerçekleştirmek için yeni yetenekleri sağlamak için tasarlanmış yeni bir nesil. Son on yıl içinde boş hücre TXTL roman çok disiplinli araştırma alanları ile ilgili nicel ve sentetik Biyoloji geniş bir yelpazesi için güçlü bir teknik haline gelmiştir. Yeni TXTL platformlar oluşturmak ve sentetik veya doğal gen devreleri yürütülmesini biyokimyasal sistemlerde sorgulamak özellikle yararlıdır. Vitro TXTL uygun hızla prototip düzenleyici elemanlarının ve biyolojik ağlara de özetlemek için kendinden montajlı mekanizmaları oturma sistemlerinde bulunan moleküler kanıtlamıştır. Bu makalede, tarif biz nasıl bulaşıcı bacteriophages, gibi MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) ve T7 (dsDNA), tamamen kendi genom kullanarak tüm Escherichia coli, TXTL sistem boş hücre bir pot reaksiyonlarda gelen sentez. Üç coliphages sentezi plak tahlil kullanarak sayılabilir. Gösterdiğimiz nasıl sentezlenmiş fajının verim reaksiyonlar biyokimyasal ayarlarına bağlıdır. Moleküler kalabalık, taklit 8000 PEG, kontrollü bir konsantrasyon büyüklükleri emriyle sentezlenmiş phages miktarını etkiler. Biz de phages yükseltmek ve onların genleri arındırmak anlatan. İletişim kuralları ve sonuçları bu çalışmada sunulan bir dizi boş hücre sentetik Biyoloji ve Biyomühendislikte multidisipliner araştırmacılar dahil ilgi olmalıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son on yıl içinde ifade boş hücre teknolojisi acil çok disiplinli araştırma alanları ile ilgili sentetik ve nicel Biyolojide adres roman uygulamaları için tasarlanmış. Aslında proteinler yaşayan bir organizma bağımsız ifade etmek için kullanılan, önemli ölçüde bu teknoloji kapsamını genişleterek her iki temel ve Uygulamalı Bilimler1,2, yeni boş hücre TXTL sistemleri geliştirilmiştir. TXTL platformları yeni nesil kullanıcı dostu, olmak için tasarlanmış daha verimli (2 mg/mL toplu iş modu3protein sentezi, daha ulaşan) transkripsiyon4düzeyde çok yönlü ve böylece ola....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: aşağıdaki yükseltme adımları ve ayıklama yöntemi birçok çift iplikçikli DNA FAJ, Örneğin, bakteriyofaj T7, enterobacteria fajının T4 veya enterobacteria fajının λ (L) için büyük ölçüde genelleştirilebilir. Kimin genom ticari kaynaklardan satın almak için hazır değil bir fajının için ağırlıklı olarak kullanıldıkları.

1. fajının amplifikasyon

Not: tek-plak, çok döngüsü (SPMC) fajının üretim tekniği de T4 fajının Chen, vd., için anlatılan 14 aşağıdaki fajının amplifikasyon ve DNA ekstraksiyon yöntemi olan E. coli çift iplikçikli DNA phages, örneğin, ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz dört temsilcisi sonuçları göster. Şekil 1' de, biz boş hücre TXTL sistemi ve FAJ DNA stokları yaşam ile kontamine değil olduğunu emin olmak için negatif denetimler kümesi mevcut E. coli hücreleri. Boş hücre TXTL sistem sağlam E. coli ücretsiz olduğundan emin olun hücre kirlenme genomik DNA (şekil 1A veB şekil 1) geçersiz bir iki sigara inkübe ve.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chen, et al. teknikte takip 14 SPMC için önemli bir adım superinfection için uygun koşullar belirlerken ulaşılır. En yakın bir ana yük'ın yeteneği superinfection dayanacak şekilde denetleyen parametre sık ilk bulaşmasını fajının bölgedir. Konak hücreleri Logaritmik büyüme aşamasında ilk enfeksiyon fajının çok küçük bir miktar ile önce olması gerekir. Sonunda, fajının Ayrıca Logaritmik büyüme ulaşacak ve bırakmak fajının her konak hücrede birden çok kopyası için hücre sayısı hızla geçmek ü.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar aşağıdaki rakip mali interest(s) ilan: Noireaux laboratuvar MYcroarray, MYtxtl protein boş hücre sağma seti distribütörü araştırma fonları alır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu malzeme Office deniz Araştırma Ödülü sayıya N00014-13-1-0074 (V.N.) tarafından desteklenen çalışma dayanır, insan Sınır Bilim Programı hibe numarası RGP0037/2015 (V.N. için) ve iki uluslu Bilim Vakfı (V.N.) 2014400 verin.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ultrasantrifüj tüpleriBeckman Coulter344057
Konik tüplerFalcon352070
Gradyan yapıcıBioComp Gradient Masterbakınız Anal Biochem. 1985 Temmuz; 148(1):254-9.
Şırınga ve Künt KanülMonoject8881513918 ve 888202017
Geniş çaplı pipet uçlarıFischerbrand02-707-134
Plak sayacıYeni Brunswik BilimselKoloni Sayacı Modeli C-110
Kültür tüpleriFischerbrand14-961-33
Hücresiz sistemMycroarray IncMytxtl
BioComp Gradient MasterBioComp InstrumentsModel 105ME
LB agar plakası tarifi25 g/L Luria-Bertani ortamı (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents ürün numarası BP1426) ve 15 g/L Bacto-Agar katı (Brenton, Dickenson and Company - ürün numarası 214010).
,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
  2. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
  3. Caschera, F., Noireaux, V.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bakteriyofaj SenteziE coli SistemiPlak Say m AnaliziMolek ler Kalabal kla maPEG 8000Faj Safla t rmaDNA EkstraksiyonuS kroz GradyanFenol Kloroform

İlgili makaleler