Biz kas kütlesi Drosophila erişkinlerde belirlemek için dolaylı bir yöntemidir kas alanı ölçmek için bir yöntem raporu. Miyotonik Distrofi hastalığı Drosophila modelinde metodolojimiz dolaylı uçuş analiz tarafından uygulanması kaslar göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
İsraf, kas kütlesi kas atrofi bilinen ortak bir fenotip Drosophila modelleri nöromüsküler hastalıklar olduğunu. Biz (IFMs) dolaylı uçuş kaslarının sinekler, özellikle dorso-boyuna kaslar (DLM), ölçü birimi tarafından farklı genetik nedenler atrofik fenotip getirdiği tabi deneysel olarak kullanmışlardır. Bu protokol için biz yarı ince kesit için sinek göğüs kasları katıştırmak, kas ve çevreleyen doku arasında iyi bir kontrast elde etmek ve yarı otomatik ölçülebilir veri edinimi için optik mikroskop görüntüleri işlemek anlatan ve analiz. Biz metodolojik boru hattı üç belirli uygulamaları açıklanmaktadır. İlk olarak, biz yöntemi miyotonik Distrofi sinek manken kas dejenerasyon ölçmek için nasıl uygulanabilir göstermek; İkinci olarak, kas kesit alanı ölçüm teşvik veya kas atrofi ve/veya kas dejenerasyonu önlemek genlerin tanımlamak için yardımcı olabilir; Üçüncü olarak, bu iletişim kuralı bir aday bileşik önemli bir hastalığa neden olan mutasyon bağlı belirli bir atrofik fenotip değiştirmek mümkün olup olmadığını belirlemek için uygulanabilirveya bir çevre tetikleyicisi tarafından.
Giriş
Meyve sineği Toraks işlevsel olarak, fizyolojik ve anatomik olarak ayrı olan uçuş kaslarının iki farklı sınıflar içerir. Bu kaslar: dorso-boyuna (DLM) ve dorso-ventral (DVM) kasları (şekil 1) ve zaman uyumlu uçuş oluşan dolaylı uçuş kasları (IFM), kontrol kas1,2. Bu kaslar birlikte uçmak için gerekli yüksek mekanik gücü oluşturmak. Boyutu, dağıtım ve IFMs rostro Kaudal bırakılmasını enine parça3 (şekil 2A) için kolay bir yönlendirme sağlar. Bu nedenle, biz bu kaslar kas atrofi Drosophila melanogasteriçinde çalışmaya seçtiniz.
Şekil 1. Diyagram dolaylı uçuş kasları (IFMs) düzenleme gösterilen meyve sineği Toraks. (Solda) bir lateral görünüm ve (sağ) bir kesit Toraks ve temsil eder. IFMs (kırmızı) Dorso-boyuna (DLM) kasları oluşur ve Dorso-ventral (DVM) (yeşil) kaslar.
Doku yapısı ve histolojik kesitler yönünü dorso-ventral ekseni kontrolünü korunması kas kesit alanı uygun değerlendirme sağlamak için kritiktir. Tomlinson ve ark. değiştiren bir fiksasyon karışımı kullanılan Kas yapısını korumak için 4 . Kaslar iç doku olduğu için Ayrıca, Drosophila' ın ezilecektir sızdırmazlık bir fiksasyon karışımları hedef dokulara nüfuz edemez olarak sorundur. Bu sorunu aşmak için sinek baş, bacaklar, kanatları ve son iki parça girmek fiksasyon karışımı izin delik oluşturmak için karın kaldırıldı. Biz tedavi ile yoğun yağ düzeltmek için onun yetenek nedeniyle kullanılan, Osmiyum tetroxide (OsO4)5, dahil fiksasyon protokolünün parçası olarak trigliserid de dahil olmak üzere. OsO4 çoğu yapıları son derece iyi, özellikle saytolojik düzeyinde korur ve aynı zamanda görüntünün kontrast sağlar. Fiksasyon sonra Drosophila thoraces reçine enine yarı ince parça (1,5 µm) için gömülü. Geliştirilmiş kontrast için doku Ayrıca toluidin ile mavi Boyanabilen. Tam thoraces görüntüleri 10 X alındı ve kas alan görüntüler (boyutlarının eşit) binarizing ve yüzde toplam, ImageJ yazılımı ile dışarı kas dokusu (siyah piksel) karşılık gelen piksel miktarının sayılabilir.
Değişikliklere doku hazırlık ve fiksasyon karışımları, bu protokol için tanıttı OsO4 ve oxazolidin çözüm, konsantrasyon artış olarak üzerinde benzersiz kas dokusunun korunması izin. Bunun nedeni protokol bozulması ve deformasyon bile son derece atrofik koşullarında nöromüsküler dejeneratif hastalıklar gibi miyotonik Distrofi (DM) ile ilişkili posterior analiz örnekleri daha güvenilir hale dokusunun önler. Daha yaygın şekliyle, DM tip 1, genişletilmiş CUG tekrarlar miyotonik Distrofi protein kinaz (DMPK) Tutanaklar içinde tarafından bu nadir genetik bozukluk getirdiği. Mutant DMPK RNA Muscleblind gibi nükleer RNA bağlanıcı proteinler (MBNL1-3; çekilmek formu ribonuclear foci toplar Muscleblind (Mbl) Drosophila)6. Miyotonik Distrofi Drosophila modelinin 250 CTG tekrarlar kas myosin ağır zincir organizatörü (Mhc-Gal4) altında ifade ederek oluşturulan. Modeli sinekler ile tipik 'kanat' up düzenlenen fenotip uçamayan ve ciddi kas atrofi onların IFMs (şekil 2B) vardı. Önceki çalışmalarda bizim laboratuarda gerçekleştirilen IFMs kas alanının belirlenmesi bu modeli sinekler7kas atrofi, farklı kimyasal ve genetik değiştirici etkilerini ölçmek için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir. Örneğin, 250 CTG ifade sinekler C'de kas içinde tekrarlar Mbl izoformu overexpression elde kas alanının bir kurtarma Mbl tükenmesi haciz tarafından DM1 Patogenez8 (şekil 2C) tetikleyici faktör olduğu gibi. Abp1, bir hexapeptit kanıtlanmış anti-DM1 etkinlik9 (şekil 2B) ile DM modeli besleme uçar kas alanı da kurtarıldı.
Şekil 2. Miktar'dorsoventral yetişkin thoraces reçine gömülü bölümlerinden. (A-D) dolaylı uçuş kaslarının Drosophila melanogaster belirtilen ilgili genotip ile. (A) denetim (yw) uçar. (B) ifade CTG kodlamayan 250 tekrarlar kas (UAS-CTG(250)x) bir azalma kas alan DLMs içinde denetim sinekler ile karşılaştırıldığında neden oldu. (C) bu kas atrofi fenotip Muscleblind (MblC) overexpression tarafından kurtarıldı (UAS-CTG (250) UAS MblC x) ve (D) beslenme modeli sinekli hexapeptit Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). Tüm görüntüleri üst dorsal ve takımıdır. Transgenes bir Myosin ağır zinciri organizatörü (Mhc) kullanarak kas için tahrik-Gal4. (E) denetim sinekler göre kas alanının yüzdesi miktar farkları önemli olduğunu doğruladı. Histogram gösterir anlamına gelir ± S.E.M. **p< 0,01 ve * p < 0,05 (Student´s t-Testi). Ölçek çubuğu: 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Rapor burada yöntem kas geliştirme, bakım ve yaşlanma, hastalık patoloji ve kas dokusu endojen ve dış faktörler nasıl yanıt vereceğini hakkında güvenilir bilgi sağlar gibi uyuşturucu testi odaklanarak araştırmacılar için ilgi olacaktır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. fiksasyon ve reçine katıştırma
- Sinekler karbondioksit (CO2) ile veya bir buz Bloğu kullanarak hipotermi ile anestezi. Bir diseksiyon mikroskop (ile bütün anında görmek için düşük büyütme) ve makas bacaklar, kanatlar, baş ve karın sabitleştirici penetrasyon kolaylaştırmak için terminal kısmındaki kaldırmak için kullanın. İskelet dikkatli işleme Toraks ve deformasyon önlemek için bu adıma gerek yoktur.
Not: düzgün işlenmiş bireyler yordamının sonunda yeterli sayıda sağlamak için genotip başına en az 12 sinekler başlayalım. - Mürekkep bir 1,5 mL tüp buz (en fazla 6 kişi tüp başına yerleştirerek) içeren 200 µL çözüm 1 aktarın.
Not: Mürekkep çözüm 1 den fazla 20 dakika içinde kalamazsınız.- Bu birim oranlarda bileşenleri için çözüm 1, mix: ¼ %4 paraformaldehyde, ¼ % 8 oxazolidin, ¼ 0.2 M Na2HPO4 ve ¼ 0.2 M NaH2PO4.
- Çözüm 2 200 µL ekleyin ve buz 30 dk için kuluçkaya.
- Çözüm 2: Mix çözüm 1 ve 1:1 (v/v) orantılı OsO4 .
Dikkat: OsO4 son derece zehirlidir. Bir duman başlıklı uygun güvenlik ve elden çıkarma tedbirler ile işleyebilirsiniz.
- Çözüm 2: Mix çözüm 1 ve 1:1 (v/v) orantılı OsO4 .
- Tüm sıvı kaldırın. Çözüm 2 200 µL ekleyin ve 1-2 h için buz üzerinde kuluçkaya.
- Çözüm çıkarın ve aşağıdaki gibi bir kademeli etanol dizi örnekleri kurutmak: bir kez içinde % 30, % 50, % 70, % 90'ı ve iki kez içinde mutlak etanol; 5 dak. 1 mL etanol örnekleri kapsayacak şekilde ekleyin.
Not: doku % 90 etanol yerleştirilir sonra sonraki adım oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. - Propilen oksit 10 min için iki kez örneklerinde her kuluçka kuluçkaya.
Dikkat: Propilen oksit zehirli, duman mahallede kullanın. - Propilen oksit epoksi reçine ve propilen oksit 1:1 (v/v) karışımı ile değiştirin ve oda sıcaklığında gecede kuluçkaya.
Dikkat: Reçine bir sıvı son derece toksik bir durumdadır. Reçine dört bileşeni (A, B, C ve D) kümesi olarak kullanılabilir.- Epoksi reçine için tek kullanımlık bir ölçek, reçine (A), 44.5 gram sertleştirici 54 g (B), 2.5 g Hızlandırıcı (C) ve Plastifiyan 10 g (D) ekleyin. Bir duman başlıklı reçine parçaları birleştirmek. Reçine aliquots-20 ° c (için 6 aya kadar) veya-80 ° c (birkaç yıl için) saklayın.
- Katı reçine toksik olmadığı için reçine atmak için bu 24 h için 70 ° C'de pişirin. Çözümler OsO izleri içerebileceği için ağır metaller grubuna göre uygun uluslararası prosedürleri, tüm önceki çözümlerinde atmak4.
- Önceki karışım % 100 reçine ile değiştirin ve örnekleri 4 h için kuluçkaya.
- Mürekkep plastik kalıpları yeni reçine (kalıp her iyi bir karkas) içeren aktarın. Bilenmiş tahta sopa veya iğne transfer ve leşleri Wells yönlendirmek ve reçine gecede 70 ° C'de Pasteur fırında polimerize bırakmak için kullanın
Not: arka süsleme ve kesit için iskelet uygun yönlendirme sağlamak için mürekkep onların uzun kenarından, karkas kuyu kenarına çok yakın ön kısmı ile yalan.
2. kırparak ve kütük parçası-in kesit
- Polimerli reçine blok kalıpları kaldırın. Jilet uzağa reçine trim, karkas çevreleyen bir yamuk şekli oluşturmak ve uygun yönelim içinde microtome vermek için kullanın. Tüm leşleri benzer sonuçları elde etmek için çapraz dikiş sonra kesit başlatın.
Not: Bölüm doğru örnek kırpmaya DLMs hastanın eksenine dik olması gerekir ( şekil 3).
Şekil 3 . Yetişkin thoraces reçine gömülü miyotonik Distrofi, dorsoventral bölümlerini model sinekler. (A), örnek kırpma görüntü dorsal sağ bölümünde bölümünde kasları için tamamen enine değildi olarak doğru değildi. Sonuç olarak, üç kas demetleri üst sağ tarafında sol tarafında olanlardan daha büyük görünüyor. Bu hata bir tahmindi kas alanı içinde sonuçlanır. (B) düzgün kesilmiş reçine blok bölümünden. Ölçek çubuğu: 200 µm.
- Kalın bir ultramicrotome bölümlerle 1,5 µm kesim ve bölümleri su damlaları gelatinized slaytlar aktarın.
- Bölümlere benzer sonuçları elde etmek tüm örnekleri için mesothorax kesiminden elde etmek.
- H2O buharlaşır kadar 70-80 ° C'de bir Isıtma blokta bölüm içeren slaytlar yerleştirin. Bu noktada, örnekleri ile OsO4 kontrast (şekil 4A) görülebilir.
3. IFM bölümleri boyama
- Bölümleri ile yeterli toluidin yaklaşık 30 için mavi kapak s Isıtma blokta.
- Toluidin blue % 1'i ve boraks H2O. ' % 1'i toluidin blue çözüm için çözmek
- H2ile O durulayın ve slaytları su buharlaşır için sıcak bir tabakta bırakın. Kontrast olması gerekiyorsa toluidin ile mavi boyama tekrar (şekil 4B) gelişmiş.
Şekil 4 . Dorsoventral bölümleri farklı kontrast stainings ile yetişkin thoraces reçine gömülü. Her iki panelleri DM1 modeli sinekler Abp1 olduğu gibi şekil 2Bile beslenen görüntülerini göster. (A) bir bölümü OsO4 kontrast görüntüsü. (B) bölümünde toluidin ile mavi lekeli kas demetleri daha iyi görselleştirme sağlar. Ölçek çubuğu: 200 µm.
4. montaj IFM bölümleri
- H2O buharlaşır kadar Isıtma blok slaytlarla kuru.
- 1 veya 2 damla montaj orta bölümleri ve bir coverslip koydu.
Dikkat: Bu adımda bir duman hood montaj orta zehirli olduğundan yürütmek.
5. resim ve miktar kas alanının edinimi
- DLM kaslar tüm kümesi odakta olması düşük büyütme oranında görüntü alabilir. Normalde 10 X kullanın.
- İstatistiksel analiz için sinek başı en az 5 seri fotoğraf çekmek ve deney grubu başına en az 5 sinekler çözümleyebilirsiniz.
- Tüm kasları (şekil 5A) içeren görüntüyü seçin. Eksen veya bölüm yönünü kontrol ve örnekleri sonuçlarını deforme etmek uygunsuz yönlendirmeyle atın (şekil 3A karşılaştırmak / kötü arasında ayırt etmek için 3B'yi ve iyi yönlendirmeli bölümler, sırasıyla).
- ImageJ yazılım sadece DLMs (şekil 5A/5B) içeren bir alanı (piksel cinsinden) seçmek için kullanın. Farklı deneysel grupları arasında karşılaştırma için kullanılmak üzere başvuru alanı her zaman en büyük kas sinek olacaktır. İçinde tüm görüntüleri karşılaştırmak için farklı genotip, DLMs (şekil 5B) başvuru alanına eşit boyutları içeren alanı seçin.
- Resim-J komut görüntülerle binarize: İşlem/ikili/yapmak ikili ve alanları veya faiz (şekil 5C) kaslarının karşılık gelmeyen piksel silin.
- Komutuyla çizim araçları silmek ve kas dışındaki alanlarda artefactual siyah noktalar görünür durumda, silgi sembolü seçin.
Şekil 5 . Görüntü analizi prosedürü kas alan tayini için. (A) miyotonik Distrofi tip 1 modeli enine bölümünü Toraks DLM içeren bir dikdörtgen ile uçmak. (B) sadece dolaylı uçuş kasları ve bağırsak (*) ile seçili alanı. (C) Binarized görüntü. Siyah alanlar faiz kaslarının karşılık gelir. Bağırsak kas alan doğru bir miktar için silindi. Ölçek çubuğu: 200 µm.
- Kas dokusu (siyah piksel) toplam komutu ile dışarı karşılık gelen piksel yüzdesi ölçmek: Analiz/ölçüm ve Seç seçeneği alanı kesir. Bir tahmini her sineğin DLM kas kütlesinin alan bu yüzdesidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MblC overexpression veya Abp1 yönetim miyotonik Distrofi sinek modeli atrofik fenotip içinde herhangi bir etkisi vardı olup olmadığını ölçmek için IFMs (şekil 1) parçası olan DLMs üzerinde duruldu. Biz model sinekler, 250 kodlamayan CTG tekrarlar Myosin ağır zincir Düzenleyici (Mhc) tarafından tahrik kas boyunca ifade kararlı-Gal4, kas alan sinekler denetlemek için karşılaştırıldığında % 50 azalma vardı. Buna ek olarak, MblC ve genişletilmiş CTG tekr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Drosophila melanogaster görünümünü tarafından karakterize miyotonik Dystrophies de dahil olmak üzere insan nöromüsküler hastalıklar7,10,11, çalışmaya uzun bir faydalı model olduğunu kanıtlanmıştır kas atrofisi. Burada sunulan Protokolü başlangıçlı veya sinek modeli belirli bir hastalık progresyon kaynaklanan kas dejenerasyon miktarının için yararlı bir araçtır. Örneğin, takip etmek ve farklı yaş sinekli bu analizi gerçe...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.
Teşekkürler
Yazarlar bu protokol üzerinde translasyonel genomik grubunun üyeleri ve Kathryn J Hanson geri besleme ve gelişmeler için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje araştırma hibe SAF2015-64500-ambulans için "gayri resmi" de Economia y Competitividad tarafından verilen Avrupa Bölgesel Kalkınma fonları içerir R ile gerçekleştirilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Image-J yazılımı | Ulusal Sağlık | Enstitüleri, https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramikrotom | Leica Leica | UC6 | |
| Mikroskop | Leica | Leica MZ6 | Parlak alan tekniği. |
| Tıraş bıçakları | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 71970 | Birkaç alternatif sağlayıcı mevcuttur. |
| Makas | Dünyası Hassas Dünya | 14003 | Birkaç alternatif sağlayıcı var. |
| Kalıpların gömülmesi | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 70900 | Birkaç alternatif sağlayıcı mevcuttur. |
| Glutaraldehit | Fluka (Sigma) | 49624 | Toksik. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Son derece toksik. |
| Propilen oksit | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Son derece toksik. |
| reçine (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Polimerize olmadığında kanserojendir. |
| Toluidin mavisi | Panreac | 251176 | Toksik. |
| Mountant Orta (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Tehlikeli. |
| Paraformaldehit | Sigma Aldrich | P6148-500G | Zararlı. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M seyreltme. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M seyreltme. |
| Boraks | Panreac | 3052 | Toksik. |
Kaynaklar
- Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
- Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).
- Griffith, W. P. Osmium Tetroxide And Its Applications. Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).
- Bird, T. D. Myotonic Dystrophy Type 1. GeneReviews. 1, 1-23 (1993).
- Bargiela, A., et al. Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model. Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).
- Llamusi, B., et al. Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).
- García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).
- van der Plas, M. C., et al. Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann New York Acad Sci. , 1184(2010).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J. Vis. Exp. , e51223(2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
