Yöntem makalesi

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

15.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56186

⸱

29 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC), University of Cologne, 2Cologne Center for Genomics (CCG), University of Cologne, 3Cologne Excellence Cluster for Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), Research Center and Systems Biology of Ageing Cologne, University of Cologne

Bu makalede

Özet

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Özet

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) post-translationally tarihinde Histon, Histon çeşitleri, transkripsiyon faktörleri ya da Kromatin değiştirici enzimler belirli bir odağı veya bir genom geniş ölçekte lokalizasyonu eşleştirmek için bir yaygın kullanılan tekniktir. ChIP deneyleri ile yeni nesil sıralama (Yani, ChIP-Seq) kombinasyonu genel olarak gen düzenleyici ağları ortaya çıkarmak için fonksiyonel ek açıklama genleri, özellikle sıralarının kodlamayan düzenleyici geliştirmek için güçlü bir yaklaşımdır. Çip iletişim kuralları normalde böylece nadir hücre tipleri veya küçük doku biyopsisi soruşturma için bu yöntem uygulanabilirliği iyileştirmelerden hücresel malzeme büyük miktarda gerektirir. Biz burada hangi adımları tamamlamak için gereken basitleştirilmiş bir çip Protokolü çip tahlil genellikle vivo içinde sırasında erken omurgalı embriyo elde edilebilir biyolojik malzeme miktarı ile uyumlu hale getirmek için tarif tahlil örnek kaybı en aza indirmek için azaltılmış. Bu çip protokolü farklı Histon değişiklikler çeşitli embriyonik tavuk ve yetişkin fare dokular Orta hücre sayıları (5 x 104 - 5 x 105 hücreleri) düşük kullanarak araştırmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Önemlisi, bu iletişim kuralı standart kitaplığı hazırlama yöntemleri kullanarak ChIP-seq teknoloji ile uyumludur, böylece küresel epigenomic sağlayan son derece alakalı embriyonik dokularda haritalar.

Giriş

Histon translasyonel modifikasyonlar doğrudan transkripsiyon, çoğaltma ve DNA onarım1,2,3de dahil olmak üzere çeşitli Kromatin bağlı işlemlerde söz konusu. Ayrıca, farklı Histon değişiklikleri olumlu gösterir (Örneğin, H3K4me3 ve H3K27ac) veya negatif (Örneğin, H3K9me3 ve H3K27me3) gen ekspresyonu ile korelasyon ve genel olarak tanımlanabilir etkinleştirebilir veya baskıcı Histon işaretler gibi sırasıyla2,3. Sonuç olarak, küresel Histon değişiklik haritalar, epigenomic haritalar, olarak da işlevsel olarak omurgalı genleri4,5ek açıklama eklemek için güçlü ve evrensel araçlar ortaya çıkmıştır. Arttırıcılar tespit edilmesi gibi örneğin, distal düzenleyici dizileri belirli Kromatin imzalar varlığı dayalı (Örneğin, etkin arttırıcılar: H3K4me1 ve H3K27ac), hangi proksimal organizatörü bölgelerden onları ayırmak (Örneğin, etkin rehberleri: H3K4me3)6,7,8. Öte yandan, genlerin büyük hücre kimlik düzenleyici fonksiyonları ile genellikle H3K4me3 H3K27me3, altta yatan genlerin transcriptionally etkin veya etkin olmayan durumuna bağlı olarak sırasıyla yine geniş Kromatin etki alanları ile9 bulunur ,10. Benzer şekilde, büyük hücre kimlik genlerin ifade sık sık çoklu tarafından ve dağınık şekilde kontrol edilebilir için geniş H3K27ac işaretlenmiş etki alanları11tanımlanabilir arttırıcılar (Yani, süper arttırıcılar), kümelenmiş gibi görünüyor.

Şu anda, Histon değişiklik haritalar sağlayan ChIP-yonga (ChIP microarrays için birleştiğinde) gibi önceki yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek çözünürlük, daha az eserler, daha az gürültü, daha fazla kapsama alanı ve alt ChIP-seq teknolojisi kullanılarak oluşturulan maliyeti12. Yine de, ChIP-seq teknolojisini kullanarak epigenomic haritalar nesil çoğunlukla çip faiz örneklerinde başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için kapasite ile ilişkili doğasında kendi sınırlamaları vardır. Geleneksel çip protokolleri genellikle milyonlarca hücre hangi sınırı içinde in vitro hücre için bu yöntemin uygulanabilirliği hatları veya bu hücreler kolayca izole vivo içinde (Örneğin, kan hücreleri) olabilir, gerekli. Son birkaç yıl içinde bir dizi modifiye ChIP Protokolü düşük hücre sayıları ile uyumlu açıklanan13,14,15,16olmuştur. Ancak, bu iletişim kuralları (Yani, ChIP-seq) yeni nesil sıralama ile birleştiğinde olabilir için özel olarak tasarlanmış ve genellikle özel Kütüphane hazırlama yöntemleri13,14, kullanın 15 , 16.

Burada, Histon değişiklik profilleri için ara düşük hücre sayıları (5 x 104 - 5 x 105 hücreleri) kullanarak araştırmak için kullanılan bir çip protokol açıklanan ya da seçili loci (Yani, ChIP-qPCR) veya genel olarak (Yani, Çip seq) (şekil 1). ChIP-seq teknoloji birleştiğinde, bizim çip Protokolü standart kitaplığı hazırlama yöntemleri, böylece birçok laboratuar10genel olarak erişilebilir yapmak ile birlikte kullanılabilir. Bu iletişim kuralı birkaç Histon işaretleri araştırmak için kullanılan (örneğin, H3K4me3, H3K27me3 ve H3K27ac) farklı tavuk embriyonik dokularda (Örneğin, spinal Nöral tüp (SNT), iyi çikinti ve epiblast). Ancak, biz genel olarak hangi biyolojik ve/veya klinik olarak ilgili örnekleri yalnızca düşük miktarlarda elde edilebilir diğer organizmalar için uygulanabilir olmalıdır tahmin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Alman hayvan bakımı kurallarına göre kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) onay tavuk embriyo deneyler yerine getirilmesi. Yerel kurallarına göre yalnızca deneyler tavuk HH44 (18 gün) bebekleri ile ve eski IACUC onayı gerekir. Ancak, bu çalışmada kullanılan embriyolar tüm önceki embriyonik gelişim aşamalarında idi (Yani, HH19 (72 h)).

Not: etkin bir şekilde qPCR veya Histon değişiklikleri araştırmak için (Yani, ChIP-seq) yeni nesil sıralama ile birleştirilerek oluşturmaları çip tahlil ayrıntılı bir açıklama sağlamak için bu protokolü amacı mevcuttur düşük-bereket embriyonik örnekleri (5 x 10 4 arasında değişen-5 x 10 5 hücreler her çip tepki için) ve farklı doku türlerine ( şekil 1). Protokol transkripsiyon faktörleri ve ortak harekete geçirmek (Örneğin, p300) bağlama profilleri soruşturma için uygulanabilir olmalıdır. Ancak, bu düzenleyici proteinler düşük bolluğu nedeniyle, daha büyük hücre sayıları gerekli (5 x 10 5 - 5 x 10 6 hücreler her çip tepki için) olması muhtemeldir.

1. hazırlama yumurta ve tavuk SNT mikrodiseksiyon

Not: yordamı microdissections için teknik olarak dokuya dokusundan ve hayvan modeli için hayvan modeli farklıdır. Bu bölümde, diseksiyon protokolü kullanılan Brakiyal SNT bölümler sahne-HH19 tavuk bebekleri örnek olarak edinmek için ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

  1. Verimli beyaz Livorno tavuk yumurta,--dan a yerel doğurmak, 37 ° C ve % 80 nem sahne-HH19 tavuk bebekleri almak 3 gün boyunca, yatay yönde elde kuluçkaya.
  2. Aşamaları Hamburger ve Hamilton göre tavuk embriyonik gelişim hazırlama sistemi 17 belirlemek.
  3. Tüm microdissections soğuk koşullarda gerçekleştirmek; aksi halde, Kromatin bütünlüğü tehlikeye.
  4. HH19 embriyolar izole.
    1. Embriyo erişilebilir olması için blastoderm düşürmek için bir iğne (0,90 x 40 mm) ile 10 mL şırınga kullanarak albümin 3 mL ayıklamak.
    2. İyi makas kullanarak yumurta içinde küçük bir açılış yapmak ve 1 mL Locke çözeltisi ekleyin (tarif için Ek materyalleri görmek) ekstra embriyonik membranlar kaldırılmasını kolaylaştırmak için.
    3. % 10 Hint siyah mürekkep/Locke çözüm 1 mL şırınga embriyo görselleştirme kolaylaştırmak için blastoderm altında bir iğneyle (0,55 x 25 mm 2) kullanarak enjekte.
    4. Medikal Cerrahi iyi makas ve forseps kullanarak embriyo çevreleyen ekstra embriyonik membran kesti.
    5. 4,5 cm Petri kabına 20 mL 1 x PBS çözüm içeren embriyo transfer etmek için delikli kaşık kullan.
  5. Uzak amnion ve ekstra embriyonik membran kullanarak iyi makas ve forseps bir stereomicroscope altında kalan bölümlerini teşrih.
  6. Caudally ( Şekil 2) SNT yalıtmak için göğüs bölgesine uzanan embriyo, brakiyal düzeyde enine SNT segment kesti.
  7. Kaldırmak yanal/ventrally (Örneğin, yan plaka mesoderm, ektoderm, notochord ve aort) SNT çevreleyen dokuların kullanarak forseps ( Şekil 2).
  8. 3.5 cm Petri kabına 5 mL sıcak (37 ° C) tripsin (tripsin/EDTA çözüm 1:250) de içeren her disseke tavuk SNT segmentinde bırakın.
  9. Durdurmak tripsin tedavi altında stereomicroscope SNT çevresinde sigara-nöro dokuları gevşeme algılandığında.
    Not: Trypsinization zaman sıkı bir şekilde aşırı sindirim ve sinir dokusu dağılım önlemek için ve SNT yapısal bütünlüğünü korumak için denetlenmelidir.
  10. El ile temiz SNT kısmını hazırlamak için kalan Mezenkimal ve ektodermal doku tripsin tedavi sonrası kaldırmak.
  11. 1.5 mL tüp SNT bölüm aktarmak ve flash-bu sıvı azot içinde dondurma. Bir kez yeterli SNT bölümler (birikmiş havuzu SNT bölümler ~ 30 tavuk bebekleri bir çip tepki için gelen), depolamak-80 ° C.
    Not: Eğer yeterli embriyonik doku (Yani, 5 x 10 5-5 x 10 6 hücreler) tek bir veya birkaç tavuk bebekleri, disseke sonra donma gerekli değildir ve doğrudan sonraki adımlara devam etmek mümkündür. Lütfen Tablo 1 ' deki sorun giderme kılavuzu'na başvurun.
    Not: dikkat! Sıvı nitrojen var bir son derece düşük sıcaklık, uygun koruma giymek.

2. Crosslinking proteinler DNA için: gün 1

Not: aksi belirtilmedikçe buza tüm adımları gerçekleştirin.

  1. DMEM Ekle 500 µL % 10 ile FBS ve 1 M Na-bütrat donmuş doku için doğrudan 10 µL veya alternatif olarak, hemen taze disseke doku için. Hücreleri nazikçe 1 mL pipet ile yeniden askıya tarafından lunaparkçı.
    Not: Na-bütrat isteğe bağlıdır, ancak önerilen eklenmesidir Histon asetilasyon soruşturma eğer. DMEM - %10 FBS yerine örnekleri 1 x PBS % 0,1 BSA ile içinde resuspended. FBS veya BSA eklenmesi isteğe bağlıdır, ancak sonraki Santrifüjü adımları örneklerinde peletleme kolaylaştırır.
  2. 13.5 µL % 37 formaldehit (%1 formaldehit final) ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında bir rotator yerleştirin.
    Not: dikkat! Formaldehit zehirli.
  3. 2.5 M glisin 25 µL tüp ekleyip bir rotator formaldehit gidermek için oda sıcaklığında 10 dakika yerleştirin.
  4. Tüp 850 x g masa üstü santrifüj 4 ° C'de 5 min için de spin. Süpernatant atın.
  5. Pelet soğuk 500 µL hemen ile yıkayın taze hazırlanmış yıkama 850 x g ve 4 ° C 5 min için arabellek (bakınız Ek materyalleri tarifi için), santrifüj ve süpernatant atın.

3. Lizis ve Sonication

  1. hazırla tam lizis arabellek (LB) (tarif için Ek materyalleri görmek) ve buz üzerinde sakin ol. 1 mL için 950 µL LB, proteaz inhibitörü konsantresi (25 x) 40 µL ve %100 10 µL kullanın PMSF.
  2. Pelet tam LB 300 µL içinde pipetting tarafından resuspend ve 4'te 10 min için sallanan bir platformda yer ° C.
  3. Solüsyon içeren temizleyicide aşağıdaki ayarları kullanarak örnekleri: Temp = 4 ° C, toplam süre = 7 dakika, “ üzerinde ” aralığı = 30 s, “ kapalı ” aralığı = 30 s, genlik = %25
    Not: Sonication koşulları her doku için optimize edilmiş olması gerekir ve kullanılan sonicator bağlı olarak değişir. 200 ile 600 arasında değişen yamultulmuş DNA sonucunda en düşük sonication ayarları kullanmak için önerilen boyut içinde bp. Yamultma büyük ölçüde doku türüne bağlı olarak, quanti değişirTy, sonication birim, crosslinking koşullar ve ekipman. Lütfen Tablo 1 ' deki sorun giderme kılavuzu'na başvurun.
  4. Sonicated örneği 16.000 x g 4 ° C'de hücresel enkaz cips için 10 dk'spin.
  5. Taze bir 1.5 mL tüp lysate (süpernatant) transfer.
    Not: başlangıç materyali iki çip deneyler için yeterli görüldüğü takdirde, o zaman 300 µL tam lb sonicated Kromatin eklenebilir (Yani, son hacim: 600 µL).
  6. Ekleyin 30 µL % 10 octylphenol 300 her µL için ethoxylate sonicated lysate (son konsantrasyonu: % 1) ve karıştırın pipetting.
    Not: dikkat! Octylphenol ethoxylate akut toksik (oral, dermal, inhalasyon).

4. Antikor kuluçka

  1. Aliquot 330 µL, sonicated iki 1.5 mL tüpler içine lysate: ChIP ve giriş denetiminin (başlangıç materyali %10) olarak 30 µL için 300 µL. Mağaza " 30 µL giriş denetimi örneğini ", -20 ° c
    Not: üç 1,5 mL tüpler (300 µL çip #1, ChIP #2 için 300 µL ve giriş denetimi (her çip başlangıç materyali %20) olarak 60 µL içine, 660 µL lysate sonicated sonra iki çip tepkiler aynı örnek gerçekleştirilmesi durumunda dağıtılabilir ).
  2. Ekleyin antikor, 3-5 µg sonicated Kromatin aliquot ve karıştırmak için ters çevir'i 300 µL.
    Not: Bu çalışmada, her küçük parça tepki K4 metillenmiş Histon H3 tri için belirli bir antikor ile gerçekleştirildi (H3K4me3), Histon H3 di K4 metillenmiş (H3K4me2), Histon H3 tri K27 metillenmiş (H3K27me3) ve Histon H3 tri asetilasyon K27, (H3K27me3). Bu iletişim kuralı başarısı tamamen kullanılan antikor kalitesine bağlıdır. Antikor özel ve belirli bir protein immunoprecipitation, verimli olması gerekir. İmmunoprecipitate çapraz protein-DNA karmaşık kullanılabilir antikor miktarını belirlemek önemlidir. Ayrıca, antikor özgüllük Western blot tarafından doğru protein algıladığı emin olmak için kontrol edilebilir. Birden çok özel olmayan bantları algılar bir antikor küçük parça için tavsiye edilmez.
  3. Koyun tüp 4 ° C'de antikor bağlamak için gecede (12-16 h) sallanan bir platformda Kromatin için.
    Not: Tablo 1 ' deki sorun giderme kılavuzu için lütfen bakın.

5. Manyetik boncuklar hazırlanması: 2 gün

  1. Aliquot 50 - 100 µL Protein G/manyetik boncuk Bulamaç 1.5 mL microfuge içine her çip tepki için tüp buz üzerinde
  2. Manyetik boncuklar üç kez soğuk blok çözüm ile yıkayın (tarif için Ek materyalleri görmek) (4 ° C). Ters çevirme veya flicking 500 µL soğuk blok çözüm ve karışımı ekleyin. Tüp manyetik tutucusuna koyun ve yan tarafında tüp yerleşmek boncuk için bekleyin. NET sıvı dökün ve tekrarlayın. Son yıkama sonra jel-yükleme bahşiş ile tüm sıvı kaldırmak.

6. Kromatin Immunoprecipitation

  1. antikor bağlı Kromatin 300 µL yıkanmış boncuk ekleyin ve karışımı ters.
  2. Antikor için boncuk bağlamak için Döndür dikey olarak 4 ° C en az 4 h için bir tüp rotator.

7. Yıkama, Elute ve Glossar ters

  1. RIPA yıkama arabellek Chill (tarif için Ek materyalleri görmek) buz, su banyosu 65 ° C için ayarla ve 4 santrifüj precool ° C.
  2. Dört kez 1 mL soğuk RIPA yıkama arabellek Kromatin bağlı boncuk yıkama ve buz üzerinde tutun. Bunu yapmak için ters çevirme veya flicking 1 mL soğuk RIPA yıkama arabellek ve karışımı ekleyin. Tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve boncuk tarafında tüp yerleşmek bekleyin. NET sıvı dökün ve yineleyin.
    Not: Yıkama ile RIPA yıkama arabellek sayısını optimize gerekebilir örnek türü, örnek bereket ve kullanılan antikor bağlı olarak. Yıkama artan sayıda arka plan azaltmak ama -ecek da azalma qPCR veya çip seq. göre aşağı akım analiz olumsuz etkileyebilir kurtarılan DNA'ın toplam tutarı
  3. TE/50 mM NaCl 1 mL tüp ekleyin ve Kromatin bağlı boncuk TE/50 mm NaCl taze 1.5 mL microfuge tüp sıvı manyetik tutucu kullanarak yukarıda açıklandığı gibi kaldırmadan önce aktarın.
  4. Boncuk 900 x g 4 ° C'de 3 dk de spin, tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve jel-yükleme bahşiş ile tüm kalan TE kaldırmak.
  5. Ekle 210 µL elüsyon arabelleği (tarif için Ek materyalleri görmek) oda sıcaklığında ve flicking tarafından resuspend.
  6. Elute sallayarak süre bir ısı blok içinde 65 ° C'de 15 dakika.
  7. Boncuk 16.000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de spin ve tüp manyetik yuvasına yerleştirin.
  8. Taze microfuge tüp boncuk yerleşmiş bir kez süpernatant (~ 200 µL) transfer.
  9. Giriş denetimi örnekleri (30 µL)-20 ° c için oda sıcaklığında (Adım 4.1 dondurulmuş) çözülme elüsyon arabelleği (90 µL) 3 cilt ekleyip karıştırın kısaca tarafından vortexing.
  10. 65 ° C'de Glossar tersine çevirmek için gecede (12-16 h) çip ve denetim örnekleri kuluçkaya.

8. Özet hücresel Protein ve RNA: gün 3

  1. 8.1At Oda sıcaklığı, TE arabelleği (SDS sulandırmak için) tüp başına 1 birim ekleme ve karıştırmak için ters çevir: 120 µL denetim örneği ve TE 200 µL 200 µL çip örneği için TE 120 µL ekleyin.
  2. Ekleyin karıştırmak için RNase A 0.2 mg/mL nihai toplama ve ters çevir'i: 240 µL denetim örneği ve 20 mg/ml RNase A 400 µL çip örneği için 4 µL 20 mg/ml RNase A 2.4 µL ekleyin.
  3. Su banyosu için RNA sindirmek 2 h 37 ° C'de tüpler kuluçkaya.
  4. K 0.2 mg/mL ve ters çevir'i son bir konsantrasyon karıştırmak için eklemek İndinavir: 240 µL denetim örneği ve 20 mg/mL İndinavir K çip örnek 400 µL 4 µL 20 mg/ml İndinavir K 2,4 µL ekleyin.
  5. Protein sindirimi ve DNA arındırmak için bir su banyosu için 2 h 55 ° C'de Incubate.

9. ChIP-qPCR

Not: DNA çıkarma ve arıtma, Ek materyalleri açıklandığı gibi gerçekleştirmek.

Not: 200-500 bp DNA parçalarının ( şekil 3) elde edilen onaylamak için Ek materyalleri, açıklandığı gibi sonication verimliliği doğrulayın.

Not: çip gerçekten işe yaradı eğer belirlemek için kritik bir adımdır. Orada ilgi protein için genomik bağlayıcı siteleri biliniyorsa, astar kantitatif PCR (qPCR) bilinen siteler özellikle çip DNA'zenginleştirilmiş eğer belirlemek için bağlı kalacağınızı beklenen değil negatif kontrol bölgeleri ile karşılaştırıldığında dizayn edilebilir canditarihi proteinler. Örnek olarak, bu iş H3K4me3 için gerçekleştirilen fişleri ile elde edilen ChIP-qPCR sonuçlarını gösterir (etkin organizatörü Histon işareti) ve H3K27me3 (etkin olmayan organizatörü Histon işareti) HH14 civciv embriyo izole SNT bölümlerdeki ( şekil 4A ).

  1. Aynı tüp her astar çifti (ileri ve geri) mix ve 20 µM, hisse senedi toplama her kullanarak hazırlamak dH 2 O (Tablo 2).
    Not: her astar çifti verimliliğini ChIP-qPCR analiz daha önce değerlendirilmelidir.
  2. Çip ve % 20 giriş denetimi adım 8.5 qPCR optimizasyonu için elde DNA kullanın.
    Not: DNA'sı genellikle giriş (ChIP reaksiyonlar kullanılan başlangıç materyali % 1 ') için 20 x qPCR analiz için seyreltilmiş.
  3. İçin her 10 µL PCR, aşağıdaki bileşenler bir PCR tüp, mix: (DNA mastermix için dH2O, SYBR yeşil karışımı 2.5 µL ve DNA'ın 1 µL 2 µL çip ya da % 1 giriş) Ekle mastermix astar ile için; , dH2O, SYBR yeşil karışımı 2.5 µL ve ileriye ve geriye doğru astar Mix 0,125 µL 2.375 µL ekleyin.
  4. Örnekleri 2 s ve kısaca santrifüj vasıl 900 x g 1 dk. için vortexing tarafından mix
  5. Gerçek zamanlı PCR (astar ve bisiklet koşullarını burada kullanılan bir örnek Tablo 2 ve Tablo 3, sırasıyla bulunabilir) gerçekleştirmek.
    Not: ChIP-qPCR veri analizi: ChIP sinyalleri giriş yüzdesi olarak hesaplanır. Kısaca, bir kez Ct değerleri elde edilir bir seyreltme faktörü 100 veya 6.644 döngüleri her qPCR tepki için (100 log2) giriş DNA reaksiyonlar için elde edilen Ct değerlerini uygulanır. Sonra faiz (Yani, astar çifti) belirli bir bölge için ChIP sinyalleri aşağıdaki gibi hesaplanır:
    ayarlanmış giriş Ct (giriş) - 6.644 =
    çip sinyal = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10. chIP-seq Kütüphane hazırlık; Son onarım: Gün 4

  1. seyreltik 100'lere elüsyon arabelleği 60 µL içinde çip DNA'ın ng (malzemeler tablo bakınız).
  2. Sonu Ekle 40 μL onarım mix ve yavaşça 10 kat pipet.
  3. Incubate 30 ° c termal cycler üzerinde 30 dk için.
  4. Girdap manyetik boncuklar ve 160 μL son onarım karışımı içeren tüp ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
  5. Tüp manyetik tutucu içine yerleştirin ve yan tarafında..... tüp yerleşmek boncuk bekleyin
  6. Net sıvı dökün.
  7. Tüp üzerinde manyetik tutucu tutarken, taze hazırlanmış %80 200 μL eklemek alkol.
  8. Incubate, oda sıcaklığında 30 s ve atma süpernatant için. Bir kere... tekrar
  9. 15dk için tüp üzerinde manyetik tutucu oda sıcaklığında tutmak. Pelet kuru olduğunda, manyetik sahibinden tüpü çıkarması.
  10. Pelet resuspension arabellek 20 μL içinde resuspend. Yavaşça 10 kez iyice karıştırmak için pipet.
  11. Incubate oda sıcaklığında 2 dk için.
  12. Tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve boncuk tarafında tüp yerleşmek bekleyin. 17,5 μL süpernatant ile yeni bir tüp transfer.

11. Çip seq Kütüphane hazırlık; Adenilat 3 ' biter

  1. Yeni A-takip karışımı ekleyin 12,5 μL tüp ve yavaşça aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Tüp üzerinde termal bir cycler yerleştirin ve aşağıdaki programa göre kuluçkaya: 30 dk, 5 dk ve 4 ° C'de tutmak için 70 ° C için 37 ° C

12. Çip seq Kütüphane hazırlık; Bağdaştırıcıları ligate

  1. resuspension ekleyin 2.5 μL tampon, 2.5 μL ligasyonu mix ve 2.5 μL uygun RNA bağdaştırıcısının dizin. İyice yavaşça aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından Mix.
  2. Termal cycler 10 dk 30 ° Incubate.
  3. Ekleyin 5 μL dur ligasyonu arabellek ve karışımı iyice tarafından 10 kez pipetting.
  4. Girdap manyetik boncuklar ve 42,5 μL örnek için ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
  5. Tüp manyetik tutucu içine yerleştirin ve yan tarafında tüp yerleşmek ve net sıvı dökmek boncuk bekleyin
  6. Tüp üzerinde manyetik tutucu tutarken, taze hazırlanmış %80 200 μL eklemek alkol.
  7. Incubate, oda sıcaklığında 30 s ve atma süpernatant için. Bir kez yineleyin.
  8. Tüp manyetik tutucu üzerinde tutun ve izin örnek kuruması için 15 dk..
  9. Manyetik sahibinden tüpü çıkarması ve Pelet resuspension arabellek 52,5 μL içinde resuspend. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. 2 min için oda sıcaklığında kuluçkaya, tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve boncuk tarafında tüp yerleşmek bekleyin. 50 μL açık süpernatant ile yeni bir tüp transfer.
  10. Girdap manyetik boncuklar ve 50 μL örnek için ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
  11. Tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve yan tarafında tüp yerleşmek ve net sıvı dökmek boncuk bekleyin.
  12. Tüp üzerinde manyetik tutucu tutarken, taze hazırlanmış %80 200 μL eklemek alkol.
  13. Incubate, oda sıcaklığında 30 s ve atma süpernatant için. Bir kez yineleyin.
  14. Tüp manyetik tutucu üzerine alın ve 15 dk. için Kuru örnek hava izin
  15. Manyetik sahibinden tüpü çıkarması ve Pelet resuspension arabellek 27,5 μL içinde resuspend. İyice 10 kez pipetting tarafından Mix.
  16. Incubate 2 dk, oda sıcaklığında tüp manyetik yuvasına yerleştirin ve boncuk tarafında tüp yerleşmek bekleyin. 25 μL açık süpernatant ile yeni bir tüp transfer.

13. Çip seq Kütüphane hazırlık; DNA parçalarının amplifikasyon

  1. , 0.2 mL PCR şablonunun yer 12.5 µL tüp. PCR astar kokteyl 2.5 μL, Gelişmiş PCR karışımı Mix 10 μL iyice aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından ekleyin. Tüp üzerinde termal bir cycler ve Tablo 4 ' te açıklanan koşullar kullanın.
  2. Girdap manyetik boncuklar ve 25 μL örnek için ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
  3. Tüp yer manyetik tutucu, tüp tarafında yerleşmek ve net sıvı dökmek boncuk bekleyin.
  4. Tüp üzerinde manyetik tutucu tutarken, taze hazırlanmış %80 200 μL eklemek alkol. 30 s ve atma süpernatant için oda sıcaklığında kuluçkaya. Bir kez yineleyin.
  5. Tüp manyetik tutucu ve izin örnek hava kuru için 15 dk. tutun manyetik sahibinden tüpü çıkarması ve Pelet resuspension arabellek 32,5 μL içinde resuspend. İyice 10 kez pipetting tarafından Mix.
  6. Kuluçkaya oda sıcaklığında 2 min için PCR tüp/levha. Oda sıcaklığında manyetik stand PCR tüp/tabak yerleştirin, tüp tarafında yerleşmek ve süpernatant ile 30 μL için yeni bir tüp aktarmak boncuk bekleyin.

14. Çip seq Kütüphane hazırlık; Kitaplık doğrulama

Not: doğrulama kütüphanesi bir DNA ve RNA kalite kontrol sistemi kullanarak gerçekleştirilir. Merdiveni hazırlanması: aliquot 1 µL genomik DNA merdivenin ilk içine tüp/iyi ve örnek arabelleği 3 µL ekleyin.

  1. Örnek hazırlanması: 1 µL Kütüphane örneği (10-100 ng/µL) 3 µL örnek arabelleği bir tüp ile karıştırın. Spin aşağı ve sonra örnek tüp sonundaki pozisyon vortex Tarih 5 s. Spin için için en yüksek hızı.
  2. Örnekleri kalite kontrol sistemini yüklemek.
    3. Çalışma tamamlandıktan sonra
  3. analiz sonuçları hiçbir astar dimer örnek ( şekil 5) mevcut; astar dimer bir band yaklaşık 135 karşılık emin olmak için en büyük değer, karşıtlığı ayarlayarak bp. Hatta zayıf bir grup varsa, bir ikinci temizlik için elüsyon arabelleği ekleyerek devam (Malzemeler tablo bakın) 50 µL birime ve karışık manyetik boncuklar 47,5 µL ekleyin. Örnek konsantrasyonu çok düşükse (< 2 nM), PCR (adım 13,1) çalıştırmak için devam, 15, örnek 12.5 µL hacmi ile yerine 18 döngüleri kullanma--dan adım 12.16 yaptı.
  4. Ölçmek kitaplıkları tek tek piyasada Kitleri kullanarak qPCR.
    Not: Havuzları kütüphanelerin tek oku 30 M okuma/örneği'hedefleyen 1 x 50 nt iletişim kuralı ile bir sequencer kullanarak sıralı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bizim çip protokol performansını göstermek için biz ChIP-seq HH19 tavuk bebekleri havuza alınan SNT bölümleri kullanarak deneyler, HH22 üst çıkıntıların tavuk embriyo ve sahne-HH3 tavuk bebekleri bağlama profilleri araştırmak için gerçekleştirilen çeşitli Histon değişiklikler (Yani, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 ve H3K27me3). Bir kez çip DNA'lar elde edilmiştir, sonication verimliliği karşılık gelen giriş DNA'lar (şekil 3) özel Jel Elektroforez tarafında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Epigenomic çip seq kullanarak Histon modifikasyonu profil oluşturma farklı hücresel bağlamlarda4,5,18omurgalı genleri fonksiyonel ek açıklama geliştirmek için kullanılabilir. Bu epigenomic profilleri, diğer şeyler arasında artırıcı öğeleri, arttırıcılar (hazır veya hazırYani, aktif,) yasal durumunu tanımlamak ve farklı biyolojik büyük hücre kimlik düzenleyiciler tanımlamak için tanımlamak için kullanılabilir veya patolo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkarlarının açıklanması gerekir var mı.

Teşekkürler

Yazarlar Jan Appel bu protokolü kurulması sırasında onun mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Rada-Iglesias laboratuvar çalışmalarında intramural CMMC tarafından desteklenmektedir finansman, DFG araştırma hibe (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 ve TE 1007/3-1) UoC gelişmiş araştırmacı grup Grant ve CECAD Grant.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif< / güçlü >
BSA tozuCarl Roth3737.3
Fosfat Tuzlu su tamponu (PBS)Sigma AldrichD8537
Tris-HCL pH 8.0Sigma AldrichT1503
NaClCarl Roth3957.2
EDTACarl Roth8043.2
EGTACarl Roth3054.2
Na-DeoksikolatSigma AldrichD6750-24
N-lauroylsarcosineSigma Aldrich61743-25G
HepesAplikhemA3724,0250
LiClCarl Roth3739.2
NP-40Sigma AldrichI3021-100ml
SDSCarl Roth1833
Protein G / manyetik boncuklarInvitrogen1004D
% 37 FormaldehitSigma Aldrich252549-1L
Glisin
RNasePeqlab12-RA-03
Proteinaz KSigma Aldrich46.35 E
Na-bütiratSigma Aldrich
Proteinaz inhibitörüRoche5892791001
SYBRgreen Mixbiozym617004
dH2OSigma AldrichW4502
1 Kb merdivenThermofisherSM1333
Turuncu GSigma Alrich03756-25
AgarozInvitrogen16500-500
%0.25 Tripsin-EDTA (1x)Gibco25200-072
Oktilfenol Etoksilat (Triton X 100)Roth3051.4
DMEM (Dulbecco&akut; s Modifiye Eagle Medium)Gibco31331-028
Jel yükleme uçları MultiflexA.HartensteinGS21
qPCRPlakaları Sarstedt721,985,202
384 kuyuSarstedt721,985,202
1.5 mL tüplerSarstedt72,706
100 - 1,000 &mikro; L Filtre uçlarıSarstedt70,762,211
2 - 20 & mikro; L Filtre uçlarıSarstedt70,760,213
2 - 200 & mikro; L Filtre uçlarıSarstedt70,760,211
0,5 - 10 & mikro; L Filtre uçlarıSarstedt701,116,210
H3K27me3 antikorAktif Motif39155
H3K27ac antikorAktif Motif39133
H3K4me3 antikorAktif Motif39159
H3K4me2 antikorAktif Motif39141
Son Onarım KarışımıIlluminaFC-121-4001
Paramanyetik boncuklarBeckman CoulterA63881
Yeniden süspansiyon tamponuIlluminaFC-121-4001
A-Kuyruk KarışımıIlluminaFC-121-4001
Ligasyon KarışımıIlluminaFC-121-4001
RNA Adaptör İndeksleriIlluminaRS-122-2101
Durdurma Ligasyonu TamponuIlluminaFC-121-4001
PCR Primer KokteylIlluminaFC-121-4001
Gelişmiş PCR KarışımıIlluminaFC-121-4001
Genomik DNA merdiveniAgilent5067-5582
Elüsyon TamponuAgilent19086
Numune TamponuAgilent5067-5582
Kütüphane Miktar Belirleme KitiKapa BiosystemsKK4835 – 07960204001
Bereketli tavuk beyaz yumurtalarıLSL Rhein MainKN: 15968
İğne (Neoject)A.Hartenstein10001
Şırınga (Ecoject 10 mL)dispomed witt oHG21010
NameCompany<strong>Katalog NumarasıYorumlar
>Ekipman
SantrifüjHermleZ 216 MK
TermoshakerITABISMKR13
SonikatörAktif MotiveEpiShear probu sonikatör
SonicatorDiagenodeBioruptor Plus
RotatorStuartSB3
Değişken hacim (5 – 1.000 μ L) pipetler, EppendorfN/A
ZamanlayıcıSigmaN/A
, Manyetik tutucuThermo Fisher, DynaMag-2, 12321D,
Masa döndürücüHeathrow, ScientificSprout
Mikser,LMSVTX, 3000L
Gerçek Zamanlı PCR Döngüleyici,RocheIşık Döngüleyici; Seri No.5662
PCR DöngüleyiciUygulamalıBiyosistemler Gen Amp PCR Sistemi 9700
DNA ve RNA kalite kontrol sistemiAgilentAgilent 4200 TapeStation Sistemi
ForsepsDumont5-Inox-H
Delikli kaşıkDünya hassas aletleri501997
SLB2659V,, , ,

Kaynaklar

  1. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
  4. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  6. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  8. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  9. Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
  10. Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
  11. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  12. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
  13. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  14. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  15. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  16. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
  18. Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
  19. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  20. Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

D k Bolluklu rneklerEmbriyonik DokuHiston ModifikasyonlarSonikasyon Verimlili iAntikor Ba lanmasManyetik BoncuklarDNA PurifikasyonuKantitatif PCR

İlgili makaleler