Method Article

Bir 2'-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü Ç Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar

DOI:

10.3791/56189

⸱

July 28th, 2017

 , 
1Department of Chemistry, University of Colorado Denver

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, C2'- O -konumunda modifiye edilmiş RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu hakkında ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. UV-vis ve dairesiz dikroizyum fotometrik analizleri yapısal yönleri, yani tek telli veya çift telli elektronları ölçmek ve karakterize etmek için kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katı faz sentezi, çeşitli alanlardaki uygulamalar için ve farklı araştırma amaçları için popüler bir metodoloji haline getirmiştir, özellikle DNA veya RNA'dan oluşan, kanonik ve modifiye edilmiş nükleik asit polimerleri elde etmek için kullanılmıştır. Burada açıklanan prosedür, C2'- O -konumunda bulunan sıfır, bir veya iki modifikasyon ihtiva eden RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' dodekamerlerinin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu üzerine odaklanmaktadır. Problar, standart organik sentez yoluyla RNA nükleotitlerine dahil edilen ve ilgili fosforamiditleri vasıtasıyla karşılık gelen oligonükleotidlere dahil edilen 2-tiyofenilmetil gruplarına dayanmaktadır. Bu rapor, fosforamidit kimyasından, iki kanonik nükleobaz (Uridin (U), Sitozin (C), Guanozin (G), Adenosin (A)) ve aynı zamanda 2'- 0- konumunda modifiye edilmiş 2-tiyofenilmetil işlevselleştirilmiş nükleotidleri kullanmaktadır. pozisyon; Bununla birlikte, metodoloji büyük bir var için uygundurYıllar içinde geliştirilen değişiklikler. Oligonükleotidler, kontrollü gözenekli cam (CPG) desteğinde, ardından reçineden ayrılma ve standart koşullar altında korumanın bozulması, yani bir amonyak ve metilamin karışımı (AMA), bunu takiben hidrojen florür / trietilamin / N-metilpirolidinon kullanılarak sentezlendi. Karşılık gelen oligonükleotidler, poliakrilamid elektroforezi (% 20 denatürasyon) ile saflaştırılmış, akabinde eluyon, tuz giderme ve ters fazlı kromatografi (Sep-pak, C18 -kolon) yoluyla izole edilmiştir. Nicelik ve yapısal parametreler sırasıyla mor ötesi görünür (UV-vis) ve dairesel dikroizm (CD) fotometrik analizi ile değerlendirildi. Bu rapor, bu alana girmek isteyen yeni başlayanlar ve uzman araştırmacılar için bir kaynak ve rehber görevi görmeyi amaçlamaktadır. Yeni teknolojiler ve metodolojiler geliştirildiğinde ilerlemiş bir iş olarak hizmet etmesi bekleniyor. Bu metodolojilerin ve tekniklerin tanımıAdlı belge, fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisine (2013 yılında yenilenmiş ve satın alınmış) karşılık gelmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA / RNA'nın oligonükleotidlerini elde etmek için katı-faz sentezi, 1970'lerden beri çeşitli alanlarda, birçok uygulamaya hizmet eden güçlü bir araçtır 1 , 2 , 3 fosforamidit yapı taşları 4 kullanarak. Geniş etki örnekleri şunlardır: etiketleme (tıklama kimyası reaksiyonları yoluyla ) 5 , yapısal sondalama 6 ve antisens teknolojileri 7'nin yanı sıra, biyolojik mekanizmaları 8 , 9 , genetik materyal olarak kaynakların aydınlatılması 10 ve burada kullanımı birçok others.The modifikasyon arasında çeşitli doğal ve / veya kimyasal modifikasyonlar 11, 12, ihtiva eden bir RNA oligonükleotid elde etmek için gerekli çabalarında ilk adımBu önemli biyopolimerin yapısını ve fonksiyonunu zamansal olarak kontrol edebilmek için fotoaktif sondalar.

Diziler ile RNA dodekamerleri sentezi: 5 '- [Cua CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [Ağustos AUU CCG UAG] -3' (altı çizili konumları C2'- O -thiophenylmethyl modifikasyonu dahil edilmesini temsil eder ) Bu çalışmanın odağını oluşturmaktadır. Diziler, RNA iplikçiklerinin tekli iplikçikler olarak veya bunların karşılık gelen dupleks yapıları olarak kantifikasyonunu ve ölçülmesini mümkün kılacak şekilde seçildi (diğer ikincil yapılar termodinamik olarak kararlı olarak tahmin edilmedi). Yapısal parametreleri, yani dupleks oluşumu ve termal denatürasyon geçişlerini oluşturmak için CD kullanıldı.

sentez
Bu oligonükleotidlerin elde edilmesine yönelik genel prosedür Şekil l' de gösterilmekte ve kademeli süreç izlemektedir: otomatik katı faz sentezi → DeprOteksiyon → Saflaştırma → Niceleme → Karakterizasyon. Şekil 2 , bu prosedürde gerekli olan monomerik birimleri göstermektedir. RNA katı faz sentezi (Şekil 2, sol) ve örneğin, G, A ve C, nükleofilik eksosiklik aminler için baz etkisiyle değişen koruma gruplarının kullanımı, fosforamidit kimyası dayandığını DNA benzerdir, Asetil, benzoil, fenoksiasetil, t -butil veya N , N- dimetilformamid ( Şekil 2 , sağda). C2'-OH grubunun (deoksoligonükleotid biyopolimerleri bulunmayan) varlığından dolayı RNA'da göz önüne alınması gereken bir diğer husus, bu nükleofilik konumun korunması ve daha sonra korumanın kaldırılması için eklenmesi gereken ek adımdır. Bu bağlamda, silikondan koruma grupları, biorthogonal kısımları (specificallHalkalı seçimler olarak tert -butildimetilsilil (TBDMS) ve triizopropilsililoksimetil (TOM) gruplarıyla ( Şekil 2 , sol alt) fluorür varlığında korumanın bozulması).

Bu çalışmada, otomatik sentez, standart fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisi üzerinde gerçekleştirildi. Cihaz üzerindeki üretici ayarları, fosforamiditlerin ticari versiyonlarını DNA için kullanırken otomatik seyreltme adımı veya kullanıcı tarafından ayarlanan hacimlerde seyreltme seçeneği içerir. Bununla birlikte, RNA fosforamiditini tartmaya ve elle seyreltmeye karar verdik: 1) RNA'nın kanonik fosforamiditlerinin fiyatı daha yüksek (bazı durumlarda 50 kat daha pahalı); 2) modifiye fosforamiditler genellikle küçük miktarlarda elde edilir; Ve 3) otomatik bir seyreltme basamağı (imalatçı tarafından belirlenmiş) kullanılarak atık malzeme miktarı büyüktür. Buna ilave olarak, 1) ticari olarak temin edilebilen katı destekler3'-uç olarak işlev görecek şekilde korunmuş bir nükleobaz içeren bir antikor ( örn. , CPG); Ve 2) C2'- O -konumunda bir TBDMS grubu ile korunan ticari fosforamiditler (kanonik nükleozazlar). Sentez adımlarının ayrıntılı listesi, Şekil 3 ve Tablo 1'de RNA sentezi için ayarlanmış adımlar için ilave açıklamalar ve yorumlar ile birlikte verilmektedir. Ayrıca, Şekil 4 , her bir detritilasyon adımından çıkan tritil katyonu nicelleştiren 'Trityl Monitor' seçeneğini seçtikten sonra her adım için gözlemlenen aşamalı verimleri göstermektedir.

Deneyimimizde, tipik olarak sınırlayıcı faktör, istenen modifikasyonu içeren fosforamiditin elde edilmesiydi. Yani, seçilen yerlerde modifikasyonların yapılmasına izin veren sentetik bir metodolojinin geliştirilmesi. Bu raporda,Karşılık gelen sentetik metodoloji olan C2'- O- tiyofenilmetil grubunu kurduğumuz, modifiye edilmiş bir nükleotidin dahil edilmesi. Bu grup, küçük boyutludur ve katı faz sentezini hiçbir şekilde etkilemez. Bu grubun, RNA oligonükleotidlerine dahil edilmesi, yapısal ve termodinamik parametreler 4 ile birlikte rapor edildiği için, burada, modifiye edilmiş fosforamiditlere yol açan organik sentezin hiçbir yönü tarif edilmeyecektir.

Korumanın Arındırılması ve Karakterizasyonu
Ekzosiklik aminlerin ve β-siyanoetil gruplarının korumasının bozulması, CPG-reçinesinden ayrılma ile aynı adımda gerçekleşir. Bu jel üzerinden ardından arıtma florür iyonu varlığında C2'- O -silil gruplarının ayrılması yolu ile ve ardından AMA sulu bir çözeltisi varlığında elde edilen reçinenin ısıtılması, yaygın olarak kullanılan koşullar, uygulamalı veElektroforez. Bu, birçok durumda, standart koşullar, daha yumuşak koşullar 13, 14, örneğin, metanol / potasyum karbonat (MeOH / K 2CO, 3'tür) veya bütilamin gerektirebilir bazik koşullar ya da florid iyonları ile kararsız olan modifikasyonlar haline iken. Dolayısıyla, karşılık gelen fosforamititlerin üzerinde farklı koruma grupları seti gereklidir. Ayrıca, bu yöntemle önceki tecrübelerimize ve diğer enstrümantasyon eksikliğine bakıldığında korumasız oligomerleri saflaştırmak için tercih edilen alternatif olarak elektroforezi seçtik. Bununla birlikte, HPLC etkili bir yöntem olarak alternatif olarak kullanılabilir 15 . Saflaştırılmış oligonükleotidlerin karakterizasyonu, 16 numaralı grubumuz tarafından bildirilen bir prosedür kullanılarak, kütle spektrometrisi, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonlaşma-uçuş süresi (MALDI-TOF) ile gerçekleştirildi.

Yapısal karakterizasyonu ve özellikleri Elde edilen dubleks mal stabilitesi CD üzerinden gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, CD'nin modifiye ve modifiye edilmemiş oligonükleotidlerinin termal denatürasyon geçişlerini belirlemek için CD'nin elastikiyetinde ca. 210 nm 'de bir λ max 270 nm, ve aynı zamanda (negatif elipslik) bandın kayboluşu. Hibridizasyon öncesi ve sonrası spektrum karşılaştırması, farklılıklarını göstermek ve kullanılan metodolojinin geçerliliğini sağlamak için verilmiştir. CD kullanımı, nükleik asitler ve aminoasitler 17'deki yapısal motiflerin belirlenmesinde yaygın olarak kabul görür ve bu nedenle çeşitli yapısal ve termodinamik parametreleri belirlemek için bir araç olarak kullanılabilir 18 ; Bununla birlikte, tekniğin termal denatürasyon geçişlerini değerlendirmek için kullanıldığı pek çok örnek bulunmamaktadır. Bazı örnekler, G-quadruplex'leri içeren DNA'daki termal kararlılıkların belirlenmesini içerirAss = "xref"> 19 , 20 veya RNA 21'in dubleksleri ve saç tokalarında.

Bu rapor, uzman olmayan okuyucuya veya görüntüleyen kişiye, bu tür bir araştırmaya sorunsuz başlamasını sağlayacak bir dizi araç sunmayı amaçlamaktadır. Bu heyecan verici bilim dalında yer alan diğer araştırma laboratuarlarındaki metodolojiler ve tekniklerle geliştirmek ve karşılaştırmak için hizmet edecektir. Bu rapordaki içerik, bu teknolojinin mevcut protokollerini çeşitli kaynaklardan ekler ve her basamak için görsel bir yardımla deneyimi zenginleştirir ve kolaylaştırır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RNA Oligonükleotidlerinin Katı Faz Sentezi

  1. Her fosforamiditi içeren solüsyonların hazırlanması (Tablo 1).
    1. Nükleotid sayısını sayın ve her tabana karşılık gelen n + 1 denklemine (n = nükleotid sayısı) uyun ve eksik değerleri içeren tabloyu doldurun. Hacim = 0,1 M konsantrasyonda nükleotid başına 0,15 mL, susuz asetonitril içinde çözülmüştür.
    2. Her bir fosforamiditi fırında kurutulmuş 10 mL kehribar şişelere (Septum Üst Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Üstü) tartın ve bir kurutma ajanı içeren bir desikatör kullanarak vakum altına yerleştirin.
    3. Desikatörü kuru argon ile doldurun, şişeyi çıkarın ve alete sabitlemeden önce ilgili miktarda asetonitril ile (susuz) hemen inceltin.
      NOT: Gaz geçirmez şırınga kullandığınızdan ve susuz bir atmosfere sahip olduğunuzdan emin olun.
    4. Şişeden septayı çıkarın ve mAchine, bir şişe değiştirme işlevi aracılığıyla.
      NOT: Bu işlem, sentezden önce hattı astarlamak için her bir çözeltinin ek bir 0.15 mL'sini (dolayısıyla yukarıdaki n + 1 denklemindeki fazla hacim) gerektirir.
  2. Yazılımı kullanarak dizi ve katı faz sentezinin kurulması ( Şekil 3 ).
    1. Yazılım simgesini ( örn . OligoNet 1.0.1) tıklayın ve Gösterge adı> Tamam'ı seçin . Dosya> Yeni Sentez> Sipariş ile yeni bir sentez oluşturun.
    2. Doldurun: Tarih; RunID; Alet seç; Sıra adı; Dizisi (5'-3 'sonu). Çevrimin altında, daha önce yaratılan yöntemi atayın ( Şekil 3 ). Son prosedürü seçin, ( oligonükleotid CPG reçinesine yapışır bırakır)> manuel.
    3. DMT Off> (sentezin sonunda bir 5'-OH grubu elde etmek için son adımda TCA muamelesi) seçin ; Dosya kaydet> Farklı kaydetVe deney için bir isim verin.
    4. Senteze başlamak için dosyayı gönderin Sipariş> Sentezöre sipariş gönder ve sütunu seçin 1-4 . Synthesizer penceresini açın ve her adımı izlemek için trityl monitor | işlevi seçin | trity> seçeneğini seçin.
    5. Bir kerede sentezlenecek olan oligonükleotidlerin sayısına bağlı olarak adımları tekrarlayın (tüm siparişlerin aynı yöntemi, yani aynı eşleşme sürelerini ve olayların sırasını belirttiğine dikkat edin).
    6. Sentez başlatmak Synthesizer> Hazırlanmaya hazırlanın . Sütunları istenen 3'üncü uçla birlikte alet üzerinde belirtilen konumlara yerleştirin. Enstrüman üzerinde Başlat> Hayır'ı tıklayın (ABI hazırlığı için).
    7. Sentez tamamlandıktan sonra, kolonu aletten çıkarın ve yuvarlak tabanlı bir şişeye yerleştirin, ardından yaklaşık 0.5 saat boyunca düşük basınç altında kurutun.
      NOT: rand'da derin bir portakal rengi olup olmadığını kontrol etmeniz önerilirTritil monitör işlevinden kaynaklanabilecek olası hataları önlemek için kaplinler (adım 1.2.4 - 1.2.7).
  3. RNA oligonükleotidlerinin korumasızlaştırılması ve saflaştırılması.
    1. Siyah kapağı çevirerek sütunu açın ve beyaz reçinenin tümünü veya bir kısmını 1.6 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın (veya ihtiyaca göre veya amacına göre). 1: 1'de 0.5 mL metilamine (suda% 40) / amonyak (% 40 su) ekleyin.
    2. Santrifüj tüp kapağını parafilm ile sabitleyin ve bir ısı bloğu kullanarak 1.5 saat boyunca 60 ° C'ye ısıtın.
      NOT: Amonyak konsantrasyonunun reaksiyon tüpü içinde sabit kaldığından emin olmak için tüpün üzerine ağır bir cisim yerleştirilebilir.
    3. Isı bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar yavaşça soğutun. İçeriği aşağı doğru döndürmek için numuneyi kısaca santrifüjleyin, sonra süpernatanı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
    4. Tüpleri sıvı azot (veya kuru buz / etanol banyosu) içine batırarak örnekleri dondurun ve dönerken kurumaya konsantre edinIndirgenmiş basınç altında bir santrifüjde karıştırın.
    5. Katıları 0.4 mL trietilamin / N-metilpirolidinon / trietilamin-trihidroflorür (2: 2: 3 oranında) çözeltisinde yeniden askıya alınız. 1,5 saat boyunca 60 ° C'ye ısıtıp yavaş yavaş oda sıcaklığına soğutulur.
    6. 0.04 mL NaOAc çözeltisi (3M, pH 5.5 - HC1 ile ayarlanır) ilave edildikten sonra bir pipet ucu ile hafifçe karıştırılır. Etanol (1 mL) ilave edin ve ca. -70 ° C (kuru buz / etanol banyosu) 15 dakika boyunca.
    7. 15.000 rpm'de ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Alikuğin çıkarılması için bir pipet kullanın ve oluşan pelleti düşürülen basınç altında kurutun.
    8. Elde edilen katı, yükleme tamponu (0.2 mL,% 90 sulu formamit, 1 mM EDTA) içinde yeniden askıya alın ve karışım homojen olana kadar karıştırın.
    9. Süspansiyonu önceden hazırlanmış bir poliakrilamid jeline yükleyin (% 20 denatüre edici, kuyu boyutları: 30 cm x 1 mm) 22 .
    10. Jel üzerinde bromofenol mavi işareti 1 / 2-2 / 3 arasında bulunana kadar bir akım uygulayın.(Jel boyutları: ~ 21.5 cm x 30 cm).
    11. Jeli standtan çıkarın ve jel içeriklerini camdan plastik sargısına (her iki tarafın üstü örtülü olarak) aktarın ve bantları görselleştirmek için silika ile kaplı ince tabaka kromatografi (TLC) plakasının üzerine yerleştirin (254 nm'de floresan boya içerir) Bir UV-lamba kullanarak ( λmax = 254 nm).
    12. Üst bandın bulunduğu konumu tanımlamak için bir işaretleyici kullanın ve yeni bir traş bıçağı kullanarak kesiniz. RNA içeren (plastik sarım olmadan) jel 50 mL'lik konik bir tüp içine yerleştirilir ve bir cam çubuk kullanılarak küçük parçalara ezilir.
    13. Jel artıkları bir NaCl aq içine asar. Solüsyonu (2 mM ve 1 mM EDTA) ilave edin ve süspansiyonu 37 ° C'de 12 saat çalkalayın. Konik boruyu 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
    14. Bir ters faz C18 kartuşu kullanarak Desalt.
      1. Kartuşu, 10 mL şırınga kullanarak, aşağıdakilerle yıkayarak hazırlayın:
        Asetonitril (10 mL)
        H2O (iki kez, 10 mL)
        5 mM NH4 Cl sulu. Çözeltisi (3 mL)
        RNA içeren çözelti, jel kalıntılarından hiçbirini dökmemeye özen gösterilir.
      2. H2O ile (üç kez, 10 mL) yıkanır.
      3. % 60 sulu bir çözeltiyi kullanarak kolondan alın. Metanol çözeltisi (3 mL)
    15. İndirgenmiş basınç altında konsantre edin ve RNaz içermeyen suda (0.3 mL) yeniden çözülür,
    16. UV-vis spektrumunu (200-450 nm) ölçmek için, seyreltilmiş bir solüsyon (10 mcL) hazırlayın ve UV-vis aletine ( örn . Nanodrop) 1 mcL koyun.
    17. Elde edilen çözeltinin konsantrasyonunu belirlemek için bira Lambert Kanunu kullanın:
      figure-protocol-1
      Burada A = elde edilen absorbans; Ε = hesaplanan molar sönme katsayısı; C = konsantrasyon ve 1 mm'lik bir yol uzunluğu için l = 0.1.
    18. Oligonükleotitler için molar sönme katsayılarını hesaplayın; Burada bir on-line hesap makinesi ile hesaplanmıştırDINAMelt yazılımını kullanan (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23
  4. MALDI-TOF yoluyla yoğunlaşma tayini ve karakterizasyonu.
    1. Desalete tabi tutmak için bir C18 ucu yüklü bir pipet ucu kullanarak bir MALDI plakasına numuneler yükleyin ve her bir oligonükleotidi spot edin.
      1. Ucu% 50 asetonitril (10 uL x 2) ile yıkayın. Ucu% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA; 10 uL x 2) ile dengeleyin. İpucu örnekle yükleyin (tipik olarak 100-150 pmol).
      2. Ucu% 0.1 TFA (10 uL x 2) ve daha sonra su (10 mcL x 2) ile yıkayın.
      3. Numuneyi istenen matrisi içeren bir solüsyona süzün; % 50 asetonitril içerisinde 10 uL 25 mM-2,4,6-trihidroksiasetofenon monohidrat (THAP), 10 mM amonyum sitrat ve 300 mM amonyum florürden oluşan bir solüsyon kullandık.
      4. Doğrudan MALDI plakası üzerinde, 0.9 uL (hava ile kurutma) takiben ve gerekirse prosedürü tekrarlayın.
        NOT: Tüm spektrumlar reflektör pozitif modunda elde edilmiştir.

2. CD yoluyla RNA Yapı Analizi

  1. CD çözümleri hazırlama.
    1. Modifiye edilmiş RNA [3 uM] NaCl [10 mM] ihtiva eden 0.25 mL Hazırlama, sodyum fosfat tamponu [10 mM, pH 7.2] ve MgCl2 [5 mM]. Numune, analiz için hazırdır, özellikle de moleküler olmayan bir geçiş gösterirse.
    2. Amaç, dupleks yapıları veya bimoleküler geçişleri analiz etmekse, şu an kompleman (mevcutsa 1 molar eşdeğer) ekleyin veya aşağıdaki adıma geçin.
    3. Numuneyi, 90 ° C'ye önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirin ve yavaş soğutmayı oda sıcaklığına (genellikle 2 - 4 saat) kontrol etmek için sıcaklığı kapatın.
  2. Spektrum edinimi
    1. Boş çözeltisi (NaCI, 10 mM sodyum fosfat, 10 mM, pH 7.3, MgCl2, 5 mM) hazırlanması, transfer tOa mikro-küvet (1 cm yol uzunluğu, 250 μL minimum hacim) yerleştirin ve cihaz içindeki numune değiştiricisinin bir tutma yerine yerleştirin.
    2. RNA içeren örneği başka bir mikro küvete aktarın ve örnek değiştiricide konumlandırın. Termal denatürasyon geçişini ölçüyorsanız, sulu katmanı bozmadan bir yağ yatağı ekleyin ve bir parça Teflon bant kullanarak küvet kapağını sabitleyin.
    3. Enstrümanda bulunan hava yüzer havasını yaklaşık olarak hareket ettiren bir akış sağlamak için azot tankını açın. 40. Soğutucuyu açın.
    4. Cihazı açın ve yazılımı Spectra Manager simgesini açın, ardından satın alma penceresi Spectra Measurement'i açın .
    5. Alma işleminden önce aleti azot ile 5 dakika temizleyin.
    6. Aşağıdaki parametreleri ölçün> Parametreleri kullanarak spektrumları elde edin ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
      1. Genel altında şunları seçin: Tarama 200-350 nm; Kanallar CD ve HT: Veri0.1 nm'de perde; 100 nm / dak'da tarama hızı; 1 nm'de bant genişliği; 5 birikim sayısı.
      2. Hücre birimi altında 20 ° C'yi seçin. Kontrol altında, Deklanşör otomatik olarak açılıp kapanır'ı seçin. Bilgi altında, adı, konsantrasyon, operatör seçin.
      3. Veri altında istediğiniz klasöre gidin. Tamam'a tıklayın.
    7. Tamam tıklama, buna uygun olarak örnek değiştirici 1-6 küvetlerin pozisyon (lar) tespit, spektrumları Ölçü> Örnek ölçümü elde edin.
  3. Termal denatürasyon geçişi yapacaksanız:
    1. Kapat Edinim yazılımı Dosya> Çıkış ve yeni bir program açın Değişken Sıcaklık Ölçümü> Ölçüm> Parametreler .
    2. İstenilen şekilde ayarlanabilen bir termal geçiş kaydetmek için aşağıdaki parametreleri uygulayın:
      1. Sıcaklık altında başlangıç ​​sıcaklığı seçin: 4 ° C; Aralık: 0.2; taRget: 90 ° C; Gradyan: 1 ° C / dak; 0 saniye bekle Başlangıç ​​/ Bitiş altında, Durum ve bitiş durumunu istediğiniz gibi seçin.
      2. Genel altında, 3 Kanal, CD / HT / Abs; Bant genişliği: 1 nm; Dalga boyu: 270 nm (veya istenen şekilde). Kontrol altında, hiçbiri seçin. Bilgi altında, adını, yoğunluğunu, operatörünü seçin.
      3. Veri altında istediğiniz klasöre gidin. Tamam'a tıklayın.
    3. Örnekleri 4 ° C'ye soğutun ve bir spektrum ölümü elde etmeden önce bu sıcaklıkta 5 dakika bekleyin.
  4. Spektrum için veri inceleme.
    1. Fonksiyonu yazılımda kullanarak, boş tayfı, hedef tayin etmeden, tampon sisteminden kaynaklanan arka plan sinyalleri için hesaba katın : Spektrum Analizi> Dosya> Aç .
    2. Boş bir dosya ve bir spektrum dosyası açıldıktan sonra, Görünüm 2'yi Görünüm 1'in (ekranın sol tarafında) altında sürükleyin.
    3. Pr için tıklayınÇıkarma> çıkarma> Tamam veya veri alışverişi> Tamam .
    4. Verileri bir ASCII dosyası olarak ayıklayın: Dosya> Ver ve ASCII'yi seçin.
    5. Karşılık gelen spektrumu oluşturmak için yazılımı kullanın. Sinyal-gürültü oranının beklenenden düşük olduğu durumlarda verilerin düzleştirilmesi isteğe bağlıdır. Bu dönüşüm düzleştirme verisi seçeneğini uygulayarak uygulanabilir.
  5. Termal denatürasyon geçişleri için veri incelemesi.
    1. Verileri bir ASCII dosyası olarak JASCO dosyasından ayıklayın.
    2. Eliptikite noktalarını sıcaklığın bir fonksiyonu olarak çizin. Genellikle, incelenen dalga boyuna bağlı olarak verilerin düzeltilmesi gereklidir. Bazı durumlarda, 210 nm'de dalga boyunun kullanımı düzleştirmeyi gerektiren çizimler arasında daha büyük varyasyonlar gösterdi. Bununla birlikte, numune ve konsantrasyonlara bağlı olarak, ham veriler kullanılarak bir takım hesaplamalar yapılmıştır.
    3. Termal deneyi hesaplamak için(T m ) değeri, eğrinin birinci türevi elde edilir. Maksimum veya minimum bu parametrenin bir göstergesi idi. Önceki adımda olduğu gibi, bazı durumlarda en doğru değeri elde etmek için verilerin düzgünleştirilmesi gerekir.
      NOT: Deneyler tipik olarak üçlü olarak gerçekleştirilmiştir, bu da ölçüm için ilgili ortalama ve standart sapma ile sonuçlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C2'- O -konumunda sıfır, bir veya iki 2-tiyofenilmetil modifikasyonu içeren RNA dodekamerlerinin sentezi, ilgili saflaştırma ve karakterizasyonu ile birlikte açıklanmaktadır. Dahası, CD yoluyla gerçekleştirilen yapısal analizin ayrıntılı bir tarifi de dahildir.

Dört RNA dizisi (tamamlayıcı bir sekansa sahip bir iplik dahil), katı faz sentezi yoluyla elde edildi ve onu her bir oligonükleotidden 300 - 700 nmol arıtma ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazısının amacı, DNA veya RNA'nın oligonükleotidlerinin sentezini başarılı bir şekilde elde etmek veya arttırmak için alan, acemi veya uzman araştırmacılarına rehberlik etmektir. Açıklanan metodoloji, standart fosforamidit kimyası yoluyla otomatik bir DNA / RNA sentezleyicisi kullanan katı faz sentezinin kullanımına odaklanmaktadır. Raporda, RNA dodecamerlerin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu adım adım anlatılıyor. Buna ek olarak, CD'nin kullanımı, ikincil yapısal motifleri ve termal denatürasy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazının hazırlanması, Colorado Denver Üniversitesi'nden (JMRE) başlatılan fonlarla desteklendi. AF bir Araştırma ve Yaratıcı Etkinlikler ödülünün (RaCAS, CU Denver) desteğini kabul etmek istiyor. Colorado Denver Üniversitesi Araştırma Hizmetleri Ofisi'nden yayın masraflarını karşılamak üzere finanse edildi. Video bölümündeki katkıları için Bayan Cassandra Herbert ve Sayın Yannick K. Dzowo'ya laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AbsolveTMPerkinElmer6NE9711
Asetonitril %99,9, HPLC SınıfıFisher Scientific75-05-8
Asetonitril %99,9, DNA dizilimi için susuzFisher BioReagents75-05-8
Akrilamid, %99+ACROSOrganikler164850025
Amonyum klorür %98+,Alfa Aesar12125-02-9
Amonyum sitrat, dibazik% 98Sigma Aldrich3012-65-5
Amonyum Florür  % 98.0, ACS sınıfıAlfa Aesar12125-01-8
Amonyum hidroksit suda% 28 - 30, ACS PlusFisher Chemical1336-21-6
Amonyum persülfatACROS Organics1444
Argon-ultra yüksek saflık  Airgas7440-37-1
Bis-akrilamid Ultra safVWR-Amresco172
Borik AsitFisher ScientificA73-1
Dietil pirokarbonat, %97ACROS OrganicsA0368487
Etanol, susuz, histolojik sınıfFisher Chemical64-17-5
Etilendiamin tetraasetik asit, disodyum tuzu dehidrat% 100.2Fisher Chemical6381-92-6
Formamid Thermo Scientific75-12-7
Hidroklorik asit, %36,5 - 38,0, Sertifikalı ACS PlusFisher Chemical7647-01-0
Magnezyum klorür hekzahidrat, %99Fisher Scientific7786-30-3
Metanol, %99,9,  HPLC SınıfıFisher Kimyasal67-56-1
Metilamin suda% 40Sigma Aldrich74-89-5
1-Metil-2-pirolidinon vesusuz,% 99.5Aldrich872-50-4
Opti-TOFTM 96 Kuyu Eki (123 x 81 mm)  MDS SCIEX1020157
RNase AwayMoleküler BiyoÜrünler7005-11
Sodyum asetat, susuz %99,2, Sertifikalı ACSFisher Chemical127-09-3
Sodyum klorür, %100,5, Sertifikalı ACSFisher Chemical7647-14-5
Sodyum fosfat monobazik dihidrat %99,0Sigma13472-35-0
2',4' Trietilamin, %99+AlfaAesar121-44-8
TEMEDAmresco761
Trietilamin trihidroflorür, %98Aldrich73602-61-6
Trifloroasetik asit, %99Alfa Aesar76-05-1
6'-Trihidroksiasetofenon monohidrat %98Sigma Aldrich480-66-0
Tris BazFisher ScientificBP154-3
ÜreFisher ScientificU15-3
reaktifler:
deblokaj çözücü karışım, diklorometan içinde %3 trikloroasetik asitGlen Research  40-4140-57
Kap Karışımı A, THF/Piridin/Asetik anhidritGlen Research40-4110-52
Kap Karışımı B, THF'de %10 1-metilimidazolGlen Research40-4120-52
Aktivatör, susuz asetonitril içinde 0.25 M 5-etiltio-1H-tetrazolGlen Research  30-3140-52
Oksitleyici Çözelti, THF/Piridin/Su İçinde 0.02 M İyotGlen Research40-4330-52
U-RNA-CPGGlen Research20-3330-xx
Ac-G-RNA-CPG Glen Research20-3324-xx
Ac-G-CE Fosforamidit Glen Araştırma10-3025-xx
U-CE FosforamiditGlen Araştırma10-3030-xx
Ac-C-CE FosforamiditGlen Araştırma10-3015-xx
Bz-A-CE Fosforamidit ve nbsp;Glen Araştırma10-3003-xx

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
  2. Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
  3. Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
  4. Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
  5. El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
  6. Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
  7. Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
  8. Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
  9. Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
  10. Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
  11. Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
  12. Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
  13. Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
  14. Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
  15. Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
  16. Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
  17. Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
  18. Mergny, J. -L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
  19. Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
  20. Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
  21. Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
  22. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).
  23. Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
  24. Breslow, R., Huang, D. -L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
  25. Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
  26. AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
  27. Farrell, R. E. RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Solid phase SynthesisOligonucleotide PurificationCircular Dichroism AnalysisPhosphoramidite ChemistryRNA Oligomer SynthesisPolyacrylamide ElectrophoresisReversed phase ChromatographyUV vis SpectroscopyMALDI TOF Analysis2 O thiophenylmethyl Modification

Related Articles