Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

24.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56191

⸱

9 Ağustos 2017

 ,  ,  , 
1UCLA Immunogenetics Center, Department of Pathology and Laboratory Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.

Özet

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi içinde doğal öldürücü (NK) hücreler olarak bilinen efektör lenfositler özellikle tumoral ortadan kaldırarak ve virally enfekte hücreleri anormal hücreler karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Diğer patolojik koşulları, bir dizi ile birlikte yaklaşık 30 bilinen monogenic kusur olarak tezahür fonksiyonel ya da klasik NK hücre eksikliği neden azalır veya yok sitotoksik etkinlik. Tarihsel olarak, sitotoksisite hantal, pahalı ve potansiyel olarak tehlikeli olan radyoaktif yöntemler ile araştırmış. Bu makalede NK hücre sitotoksik etkinliğini ölçmek için akıcı, klinik olarak geçerli Akış Sitometresi tabanlı yöntemi. Bu tahlil, periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) veya saf NK hücre hazırlıklar NK Hücre-aracılı sitotoksisite (NKCC) duyarlı olduğu bilinen bir hedef tümör hücre satırı ile birlikte farklı oranlarıyla inkübe. Hedef hücreleri önceden onların ayırımcılığa karşı efektör hücreler (NK hücreleri) izin vermek için bir floresan boya ile Etiketlenmiş. Kuluçka dönemi sonra öldürülen hedef hücreler özellikle ölü hücreleri nüfuz bir nükleik asit leke tarafından tanımlanır. Bu yöntem hem tanı ve araştırma uygulamaları hem de, Akış Sitometresi çok parametreli yetenekleri sayesinde mükellef, potansiyel olarak daha derin çözümlenmesi NK hücre fenotip ve işlevini etkinleştirme avantajı vardır.

Giriş

Doğal öldürücü (NK) hücreleri insan doğuştan gelen lenfositler eleştirel virally enfekte hücreleri, dönüştürülmüş hücreleri ve diğer patojen tehditler 1,2ortadan kaldırılması içinde yer alan sofistike bir alt kümesidir. NK hücre litik granül sitotoksik proteinler, perforin ve granzymes gibi ev. Etkinleştirme, üzerine NK hücreleri doğrudan hedef hücre lizis ve apoptosis, sitokin ve Kemokin yayın ile birlikte sonuçlanan nereye cytolytic bu moleküller yerel olarak serbest bırakılır, immünolojik synapse bilinen onların hedefleri olan karmaşık bir etkileşim oluşturmak ve sonuçta devlet bir enflamatuar indüksiyon içinde 1,3,4.

İnhibitör Hofstede NK hücre reseptörleri ve hedef hücreleri, sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir sistem yüzeyde ifade ligandlar ve NK hücre aktivasyonu etkinleştirme karmaşık bir dize içerir. Bir NK hücre aktivasyonu en çok çalışılan mekanizmaları "eksik" özdür. Nitekim, MHC kompleksi (MHC) veya insan lökosit antijeni (HLA) molekülleri, üzerinde büyük sınıf tespiti eksikliği enfekte veya hücreleri Tetikleyicileri NK hücre sitotoksisite dönüştürdü. Tümör ve virüs bulaşan hücreleri genellikle tümleyici böylece birincil NK olma, T Hücre-aracılı bağışıklık kaçmak için bu antijenleri hücre hedefler 1,3,4.

NK hücre işlevi değerlendirilmesi öncelikle kategorize içine degranulation ya da sitotoksisite deneyleri. Ancak, degranulation deneyleri, CD107a, degranulation ilişkili işaret akış sitometrik tespiti gibi sadece NK hücre aktivasyonu ve değil onların nihai işlevinin doğrudan hedef hücreleri 5,6,7,8öldürülmesi işaret etmektedir. Bu nedenle, bu sınırlama bir daha söylüyorum ve daha doğrudan alternatif olarak sitotoksisite deneyleri için müfettişler çekmiş olmalı.

Uzun süredir "altın T ve NK hücreleri Hücre-aracılı sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için standart" krom yayın tahlil (MKK) olduğunu. MKK radioactively hedef hücre 51Cr ile etiketleme ve onları ortak efektör hücreleri ile kuluçka içerir. Bu tahlil protein bağlı 51Cr gama sayarak ölçülen süpernatant, içine belgili tanımlık serbest bırakmak o hücre lizis sonuç ilke dolu olduğunu. Etkili, süre bu tahlil çeşitli nedenlerden dolayı sorunlu: yüksek malzeme maliyetleri, işleme ve bertaraf radyoaktif 51Cr, spontan yayın 51Cr ve zor standardizasyon - yapım o tamamen pratik 9,10.

Radyoaktif olmayan deneyleri, floresan etiketleme, enzim yayın ve hatta bioluminescence, ilgili bir dizi beri MKK 11,12,13,14alternatif olarak geliştirilmiştir. Biz burada bir Akış Sitometresi tabanlı yöntemi basit, hassas ve tekrarlanabilir NK hücre sitotoksik etkinliğini K562 hedef hücreleri üzerinde ölçüm için açıklamak. Bir insan erythroleukemic hücre satır HLA sınıf indirimli ifade ile ben ve onları NK Hücre-aracılı sitotoksisite 15özellikle duyarlı kılan ligandlar activatory NK reseptörleri için artan ifade K562 hücrelerdir. Bu tahlil K562 hücre carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) ile önceden etiketlenir ve işbirliği her iki periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) ile çeşitli oranları, kültürlü veya NK hücreleri 1saf. CFSE ayrımcılık hedef hücre efektör NK hücreleri 16,17sağlar bir istikrarlı, protein bağlayıcı floresan boya var. Co kuluçka sonra özellikle ölü hücreleri, membran permeating bir nükleik asit leke (malzemelerin tabloya bakın) öldürdü hedef hücreleri tanımlamak için kullanılır. Örnekleri sonra ölü (yani, leke +) yüzdesini belirlemek için bir Akış Sitometresi iktisap CFSE + hedef hücreleri.

Bu tahlil bir rutin tanı tarama olarak birincil veya ikincil Hemofagositik Lenfohistiyositozis ve orada olan yaklaşık 30 bilinen hataları NK hücre eksikliği, fonksiyonel veya klasik neden NK hücre bölmesi etkileyen monogenic kusurları için kullanılabilir. NK hücre etkinliği hastaların bağışıklık sulandırma hematopoietik hücre transplantasyonu veya post immunomodulatory terapi 18,19,20, aşağıdaki değerlendirmek için tekrarlayan, şiddetli herpes viral enfeksiyonlar ile ve temel araştırma uygulamaları bir dizi için araştırmak yararlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Örnekler, UCLA İnsan Araştırmaları Koruma Programı tarafından belirlenen etik yönergelere göre toplandı ve IRB tarafından onaylandı.

1. Reaktiflerin hazırlanması

NOT: Aksi belirtilmedikçe, kullanımdan önce tüm reaktiflerin oda sıcaklığında dengelenmesine izin verilmelidir. Tüm reaktifler steril kalmalıdır.

  1. Bir p20 pipeti ile kalsiyum ve magnezyum içermeyen 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisine 10 μL Tween-20 çözeltisi ekleyerek 2x çalışma Tween-20 çözeltisi (yani,% 0.2) hazırlayın.
    1. Tween-20'nin yüksek viskozitesi göz önüne alındığında, doğruluğu sağlamak için aşağıdaki adımları izleyin: kabarcık oluşumunu önlemek için yavaşça toplayın, taşınmayı önlemek için tüm ucu batırmayın ve tüm Tween-20'yi uçtan yıkamak için PBS'de birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
  2. 198 μL tam ortama (yani, 1:100 seyreltme) 2 μL IL-2 stok çözeltisi (2.1E6 IU / mL) ekleyin, bu da %1 penisilin-streptomisin ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile RPMI'dir, daha sonra 7x çalışma çözeltisi (210 IU/mL) hazırlamak için 198 μL tam ortama 2 μL IL-2 ara çözeltisi ekleyerek ek bir 1:100 seyreltmeye devam edin.
  3. 500 μL düz ortama (RPMI) 2 μL CFSE stok çözeltisi (5 mM) ekleyin. Vorteks, kapaktan damlaları çıkarmak için aşağı döndürün, ardından 1 μM'lik 2x çalışma çözeltisi elde etmek için 950 μL düz RPMI'ye 50 μL CFSE ara çözeltisi ekleyerek 1:20 oranında ek bir seyreltme ile devam edin.

2. PBMC'lerin efektör hücreler olarak izolasyonu

NOT: Bu test, sağlıklı kontrollerden elde edilen toplam PBMC'lerle etkili kullanım için doğrulanmıştır. Bununla birlikte, NK hücre içeriğinin her PBMC hazırlığında doğrulanması önerilir (Şekil 1). Ayrıca, toplanacak tam kan hacmi, periferik tam kandaki NK hücrelerinin sıklığına bağlıdır ve bu, özellikle sağlıklı donörler ve hastalar arasında, kişiden kişiye değişebilir.

  1. Sodyum veya lityum heparinize kan alma tüplerinde en az 4 mL insan tam kanı toplayın. Kan örneklerini alındıktan sonra oda sıcaklığında saklayın ve alındıktan sonraki 30 saat içinde kullanın.
  2. Tam kanı 4 mL PBS ile seyreltin (ör. tam kana eşit hacimde PBS).
  3. 15 mL'lik konik bir tüpe 4 mL yoğunluk gradyan çözeltisi (malzeme tablosuna bakınız) ekleyin. Tüpü eğerek seyreltilmiş tam kanı yoğunluk gradyan çözeltisinin üzerine dikkatlice yerleştirin.
  4. Fren kapalıyken 24 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin.
  5. Plazma ve trombositlerin üst tabakasının altındaki ince beyaz tabaka olan mononükleer hücre tabakasını dikkatlice 15 mL'lik yeni bir konik tüpe toplayın. PBS ile sesi 15 mL'ye getirin.
  6. Fren açıkken 10 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 0.5 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
  7. Hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanın ve PBMC konsantrasyonunu tam ortamla 5x106 hücre / mL'ye ayarlayın.
  8. Akış sitometrisi ile NK hücre içeriğini kontrol edin (bkz. adım 4).
  9. Testi 30 dakika içinde başlatın. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakikaya kadar tutun veya kullanıma hazır olana kadar 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.

3. NK hücrelerinin efektör hücreler olarak izolasyonu

NOT: Protokolün bu kısmı, toplam PBMC'leri efektör hücreler olarak kullanmaya bir alternatiftir. Sağlıklı bir bireyden alınan 4 mL tam kandan elde edilen tipik verim yaklaşık 4x105 NK hücresi veya PBMC'lerin yaklaşık %5-15'idir, ancak bu sıklık donörler arasında farklılık gösterir 21. İzolasyondan sonra saflık kontrolü yapılması tavsiye edilir.

  1. Sodyum veya lityum heparinize kan alma tüplerinde en az 4 mL insan tam kanı toplayın. Ön zenginleştirme numunesi olarak lekelemek için 50 μL tam kan alın.
  2. Zenginleştirme kokteylini 50 μL/mL'lik kan örneklerine ekleyin (malzeme tablosuna bakınız). İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  3. Numuneyi seyreltmek için eşit hacimde PBS +% 2 FBS ekleyin ve yavaşça iyice karıştırın.
  4. 15 mL'lik bir konik tüpe 4 mL yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin. Seyreltilmiş numuneyi yoğunluk gradyan ortamının üzerine dikkatlice yerleştirin.
  5. Fren kapalıyken 1,200 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  6. Zenginleştirilmiş hücre katmanını dikkatlice 15 mL'lik yeni bir konik tüpe toplayın. PBS +% 2 FBS ile hacmi 50 mL'ye getirerek hücreleri yıkayın.
  7. 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve yıkamayı tekrarlayın.
  8. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 0.5 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
  9. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve konsantrasyonu 5x105 hücre / mL'ye ayarlayın. Zenginleştirme sonrası numune olarak lekelemek için 50 μL saflaştırılmış hücre süspansiyonu alın.
  10. Hücreleri 10 dakikaya kadar oda sıcaklığında tutun veya kullanıma hazır olana kadar 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöre koyun.

4. NK hücre içeriğinin değerlendirilmesi için immünofenotipleme

  1. 50 μL toplam izole edilmiş PBMC'ler, ön zenginleştirme tam kan veya saflaştırılmış NK hücreleri kullanarak, bir NK hücre belirteci olarak anti-CD56 florokrom-konjuge antikor ile boyayın. Varsa kontaminasyonun kökenini değerlendirmek için diğer hücre tipleri ve soyları (yani CD3 + T hücreleri, CD19 + B hücreleri) için belirteçler de dahil edilebilir.
  2. 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin ve 2 mL PBS +% 2 FBS ekleyerek yıkayın.
  3. 450 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  4. PBMC'ler veya NK hücreleri için, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 100 μL PBS +% 2 FBS'de yeniden süspanse edin.
  5. Tam kan örnekleri için kırmızı kan hücresi (RBC) lizisi gerçekleştirin:
    1. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda (31.75 g amonyum klorür + 4.16 g Tris bazı + 6.65 g EDTA, 5000 mL deiyonize su içinde çözülmüş) yeniden süspanse edin.
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    3. Yıkamayı iki kez tekrarlayın, süpernatanı aspire edin ve parçalanmış numuneyi 100 μL PBS +% 2 FBS.
      içinde yeniden süspanse edin NOT: RBC lizisi, boyamadan önce de yapılabilir.
    4. Akış sitometrik analizine devam edin.

5. K562 hedef hücrelerinin çözülmesi, kültürlenmesi ve hasat edilmesi

  1. 10 mL tam ortamı 15 mL'lik konik bir tüpe alın ve 37 °C'lik bir su banyosunda ısınmaya bırakın. K562 hücrelerinin çözülmesi ve kültürlenmesi için, tüm adımlar için yalnızca 37 °C'ye önceden ısıtılmış ortam kullanın.
  2. Bir şişe donmuş K562 hücresini, çoğu çözülene kadar 37 ° C'lik su banyosuna yerleştirin.
  3. Yarı çözülmüş K562 hücrelerini, 15 mL'lik konik tüp içinde önceden 37 °C'ye ısıtılmış tam ortama aktarın. Kriyojenik şişenin içini önceden ısıtılmış bir ortamla yıkayın ve yıkamayı 15 mL'lik tüpe ekleyin.
  4. Fren açıkken 7 dakika boyunca 140 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
  5. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücreleri saymak için uygun miktarda hücre süspansiyonu alın.
  6. Konsantrasyonu 1x10 5-2x105 hücre / mL'ye ayarlayın ve kullanmadan önce en az 2 gün boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin. Kültürü bu yoğunluk aralığında 3 aydan daha uzun süre tutmayın, ardından yeni bir alikot çözün. Kültürde asla 1x106 hücre / mL hücre konsantrasyonunu aşmayın.
  7. Tahlilde kullanım için, K562 hücre kültürünü 10 mL'lik bir serolojik pipetle iyice karıştırın ve otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre ve Tripan Mavisi boyama kullanarak hücre canlılığını saymak ve değerlendirmek için bir alikotu çıkarın.
    1. Canlılık %85'ten azsa, aşağıdaki ölü hücre temizleme adımlarına devam edin.
      1. Gerektiği gibi 50 mL konik tüplere 15 mL yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin. Tüm hücreleri kültürden toplayın ve tüpü eğerek hücre süspansiyonunu yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine yavaşça yerleştirin.
      2. Fren kapalıyken 24 dakika boyunca 650 x g'de santrifüjleyin. Canlı hücre katmanını dikkatlice 15 mL'lik yeni bir konik tüpe toplayın. PBS ile sesi 50 mL'ye getirin.
      3. Fren açıkken 10 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL tam ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve hücre canlılığını kontrol edin (5.7'deki gibi).
      4. Kullanmadan önce en az 2 gün boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin.
  8. 5x105 K562 hedef hücrelerini toplayın ve 7 dakika boyunca 140 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini %1 FBS içeren ortamda 500 μL'de yeniden süspanse edin.

6. K562 hedef hücrelerinin etiketlenmesi

NOT: CFSE çalışma çözümünü eklemeden önce K562 hücrelerinin iyi bir şekilde yeniden askıya alındığından emin olun.

  1. 0,5 μM'lik bir nihai konsantrasyon için 500 μL CFSE çalışma solüsyonunu 500 μL K562 hücresine pipetleyin. Aynı 1000-1250 μL'lik ucu kullanarak, 3-5 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hemen karıştırın.
  2. 37 °C su banyosunda veya nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
    NOT: İnkübatörde sıcaklık dengeleme gecikme süresi su banyosuna göre daha uzun olduğundan, inkübasyon süresinin özellikle 1 mL'> hacimler için ayarlanması gerekebilir.
  3. Etiketleme reaksiyonunu 10 mL tam ortam ile karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca söndürün.
  4. Etiketli K562 hücrelerini 140 x g'da 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 1 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
  5. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve konsantrasyonu tam ortamda 1x105 hücre / mL'ye getirin.
  6. Hücreleri, kullanıma hazır olana kadar 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Hücreler oda sıcaklığında 10 dakikaya kadar veya kullanıma hazır olana kadar 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe tutulabilir. Buzdolabında saklamayın.

7. Kaplama

NOT: NK hücreleri sınırlayıcı ise, hem K562 hem de NK hücrelerinin konsantrasyonu yarıya indirilebilir, böylece hücrelerin yarısı tahlilde kaplanır. Tahlil, hücre miktarının yarısı ile karşılaştırılabilir sonuçlar verir (oranlar tutarlı tutulduğu sürece).

  1. Toplam PBMC'ler kullanılıyorsa, oyuk başına aşağıdaki koşullar için 96 oyuklu, U-dipli, doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakayı etiketleyin: (1) Efektör (E) : Hedef (T) = 50 : 1 + IL-2 - NK hücre sitotoksisitesi için pozitif kontrol; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12.5 : 1; (5) E : T = 6.25 : 1; (6) T - sadece hedef hücreler - K562 ölümü için negatif kontrol; (7) E - yalnızca efektör hücreler; (8) T + Tween - K562 ölümü için pozitif kontrol
  2. Saflaştırılmış NK hücreleri kullanılıyorsa, oyuk başına aşağıdaki koşullar için 96 oyuklu, U-dipli, doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakayı etiketleyin: (1) Efektör (E): Hedef (T) = 5: 1 + IL-2 - NK hücre sitotoksisitesi için pozitif kontrol; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2.5 : 1; (4) E : T = 1.25 : 1; (5) E : T = 0.625: 1; (6) T - sadece hedef hücreler - K562 ölümü için negatif kontrol; (7) E - yalnızca efektör hücreler; (8) T + Tween - K562 ölümü için pozitif kontrol
  3. 3, 4, 5, 6, 7 koşullarına 100 μL tam ortam ekleyin. Bu ve sonraki tüm adımlar için (önerilir) çok kanallı bir pipet kullanın.
  4. 1, 2, 3 koşullarına 100 μL efektör hücre (5x106 hücre / mL'de PBMC'ler veya 5x105 hücre / mL'de saflaştırılmış NK hücreleri) ekleyin. Seri seyreltme ile 4-7 koşulları için efektör hücreleri ekleyin. Uçları durumdan duruma değiştirmeyin.
    1. Koşul 3'ü karıştırın, 100 μL alın ve koşul 4'e aktarın.
    2. Koşul 4'ü karıştırın, 100 μL alın ve koşul 5'e aktarın.
    3. Koşul 5'i karıştırın, 100 μL alın ve koşul 7'ye aktarın; Koşul 6'da efektör hücreler yoktur.
  5. Koşul 8'e 100 μL hazırlanmış 2x %0.2 Tween çalışma solüsyonu ekleyin (son konsantrasyon: %0.1 Tween-20); koşul 8'de efektör hücreler yoktur.
  6. Koşul 1'e 30 μL IL-2 çalışma solüsyonu ekleyin. IL-2, hedef hücre süspansiyonunun eklenmesinden önce efektör hücre süspansiyonuna eklenmelidir (son konsantrasyon: 27 IU / mL).
  7. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 koşullarına 100 μL hedef hücre (1x105 hücre / mL'de K562 hücreleri olarak etiketlenmiş) ekleyin. Koşul 7'de hedef hücreler yok.
  8. Tüm kuyucukları çok kanallı bir pipetle karıştırın ve plakayı 2 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin.
  9. Nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 4 saat inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, plakayı buzun üzerine yerleştirin ve 30 dakika içinde canlılık boyamaya devam edin.

8. Canlılık ve kazanım için boyama

  1. 600 μL PBS'ye 3 μL 5 μM stok çözeltisi ekleyerek ölü hücre boyasını hazırlayın (malzeme tablosuna bakın).
  2. 250 μL'lik bir nihai hacim ve 0.005 μM'lik bir nihai konsantrasyon için her oyuğa 50 μL seyreltilmiş ölü hücre boyası ekleyin. Çok kanallı bir pipetle iyice karıştırın.
  3. Akış sitometrik analizine devam edin. Bir akış sitometresi kullanarak, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar için hedef hücre kapısında (Şekil 2) en az 1.000 olay toplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tahlil ayarlamadan önce NK hücre içeriğini seçim efektör nüfusu değerlendirilmek önerilir. Şekil 1 gösterir tipik bir CD56 (daha önce açık mavi) Boyama ve sonra (kırmızı) NK hücre zenginleştirme. NK hücreleri PBMCs % 15'e kadar oluşturan ve en az % 80 saf zenginleştirme sonra olmalıdır.

Bu tahlil akış sitometrik analizinde algılama iki parametre içerir: CFSE, aynı kanalı FITC; olarak tespit ve ölü h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan NK hücre sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için geleneksel 51Cr yayın tahlil için basit ve düşük maliyetli bir alternatif yöntemdir. Bu yöntem hassas, tekrarlanabilir ve MKK gibi önceki standart yöntemlerine göre daha az zaman alıcı ve klinik her ikisi-ebilmek var olmak kullanılmış ve uygulamaları araştırma.

Tahlil toplam PBMCs ve zenginleştirilmiş NK hücreleri ile çalışsa da, hücre popülasyonlarının arındırmak için gerek kalmadan PBMCs kullanma seçeneğine zaman...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çakışma mali ilgi bildirin.

Teşekkürler

Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Merkezi, el yazması hazırlık ile ona yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fosfat Tamponlu Salin (1x, Ca2+ ve Mg2+ olmadan)Corning (Cellgro)21-040-CM
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Tween-20SigmaBP337-100
RPMI 1640 MediaCorning (Cellgro)10-040-CV
Isı ile İnaktive Fetal Sığır SerumuOmega ScientificFB-02
Penisilin StreptomisinYaşam Teknolojileri15140-16310.000 U/mL
IL-2R& D Sistemleri202-IL-0500.2 & mu'dan liyofilize; Taşıyıcı protein olarak BSA ile Asetonitril ve TFA'da m filtrelenmiş çözelti. 100 & mu'da 500 ul ile sulandırın; en az% 0.1 sığır serum albümini içeren steril 100 mM Asetik Asit içinde g / mL (2.1x10E6 IU / ml)
K562 HücreleriATCCCCL-243Kanser hücre hattı 
T-75 hücre kültürü şişeleriCorning431464
CFSE hücre proliferasyon kitiYaşam Teknolojileri (CellTrace)C345545mM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için I şişesini 18 ul DMSO ile sulandırın. Dondurmayın/çözmeyin.
Sytox RedLife TechnologiesS34859Stok çözümü 5 &mu'da sağlanır; 1 mL DMSO'da M. DMSO çözeltisi, reaktif bozulması olmadan birden fazla donma-çözülme döngüsüne tabi tutulabilir.
Sodyum / lityum heparin kan alma tüpleriBD02-687-95
U-tabanlı 96 oyuklu plakaCorningCLS3897
Serolojik pipetlerBD Falcon
Polistiren yuvarlak tabanlı tüpler (5 mL)BD Falcon14959-5
50 mL polipropilen konik boruBD Falcon352070
15 mL polipropilen konik boruBD Falcon352097
Reaktif rezervuarıUSA Scientific2321-2230
İnsan NK hücre zenginleştirme kokteyliKök Hücre Teknolojileri (RosetteSep)15065

Kaynaklar

  1. Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  4. Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
  5. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
  6. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).
  7. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  8. Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
  9. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  10. Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
  12. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  13. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357(2014).
  14. Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
  15. West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
  16. Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
  17. Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
  18. Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152(2016).
  19. Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
  20. Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578(2015).
  21. Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
  22. Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
  23. Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
  24. Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1(2015).
  25. Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Figure 4 was updated from:

Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death.

to:

Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis.

Etiketler

Do al Katil H crelerPeriferik Kan Monon kleer H creleriYo unluk Gradyanla Ay rmaHedef H cre EtiketlemeEfekt r Hedef Oranl H cre BoyasK562 Hedef H creleri
Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.