Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Doğuştan gelen bağışıklık sistemi içinde doğal öldürücü (NK) hücreler olarak bilinen efektör lenfositler özellikle tumoral ortadan kaldırarak ve virally enfekte hücreleri anormal hücreler karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Diğer patolojik koşulları, bir dizi ile birlikte yaklaşık 30 bilinen monogenic kusur olarak tezahür fonksiyonel ya da klasik NK hücre eksikliği neden azalır veya yok sitotoksik etkinlik. Tarihsel olarak, sitotoksisite hantal, pahalı ve potansiyel olarak tehlikeli olan radyoaktif yöntemler ile araştırmış. Bu makalede NK hücre sitotoksik etkinliğini ölçmek için akıcı, klinik olarak geçerli Akış Sitometresi tabanlı yöntemi. Bu tahlil, periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) veya saf NK hücre hazırlıklar NK Hücre-aracılı sitotoksisite (NKCC) duyarlı olduğu bilinen bir hedef tümör hücre satırı ile birlikte farklı oranlarıyla inkübe. Hedef hücreleri önceden onların ayırımcılığa karşı efektör hücreler (NK hücreleri) izin vermek için bir floresan boya ile Etiketlenmiş. Kuluçka dönemi sonra öldürülen hedef hücreler özellikle ölü hücreleri nüfuz bir nükleik asit leke tarafından tanımlanır. Bu yöntem hem tanı ve araştırma uygulamaları hem de, Akış Sitometresi çok parametreli yetenekleri sayesinde mükellef, potansiyel olarak daha derin çözümlenmesi NK hücre fenotip ve işlevini etkinleştirme avantajı vardır.
Giriş
Doğal öldürücü (NK) hücreleri insan doğuştan gelen lenfositler eleştirel virally enfekte hücreleri, dönüştürülmüş hücreleri ve diğer patojen tehditler 1,2ortadan kaldırılması içinde yer alan sofistike bir alt kümesidir. NK hücre litik granül sitotoksik proteinler, perforin ve granzymes gibi ev. Etkinleştirme, üzerine NK hücreleri doğrudan hedef hücre lizis ve apoptosis, sitokin ve Kemokin yayın ile birlikte sonuçlanan nereye cytolytic bu moleküller yerel olarak serbest bırakılır, immünolojik synapse bilinen onların hedefleri olan karmaşık bir etkileşim oluşturmak ve sonuçta devlet bir enflamatuar indüksiyon iç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Örnekler, UCLA İnsan Araştırmaları Koruma Programı tarafından belirlenen etik yönergelere göre toplandı ve IRB tarafından onaylandı.
1. Reaktiflerin hazırlanması
NOT: Aksi belirtilmedikçe, kullanımdan önce tüm reaktiflerin oda sıcaklığında dengelenmesine izin verilmelidir. Tüm reaktifler steril kalmalıdır.
- Bir p20 pipeti ile kalsiyum ve magnezyum içermeyen 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisine 10 μL Tween-20 çözeltisi ekleyerek 2x çalışma Tween-20 çözeltisi (yani,% 0.2) hazırlayın.
- Tween-20'nin yüksek viskozitesi göz önüne alındığında, doğruluğu sağlamak için aşağıdaki adımları izle....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tahlil ayarlamadan önce NK hücre içeriğini seçim efektör nüfusu değerlendirilmek önerilir. Şekil 1 gösterir tipik bir CD56 (daha önce açık mavi) Boyama ve sonra (kırmızı) NK hücre zenginleştirme. NK hücreleri PBMCs % 15'e kadar oluşturan ve en az % 80 saf zenginleştirme sonra olmalıdır.
Bu tahlil akış sitometrik analizinde algılama iki parametre içerir: CFSE, aynı kanalı FITC; olarak tespit ve ölü h.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan NK hücre sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için geleneksel 51Cr yayın tahlil için basit ve düşük maliyetli bir alternatif yöntemdir. Bu yöntem hassas, tekrarlanabilir ve MKK gibi önceki standart yöntemlerine göre daha az zaman alıcı ve klinik her ikisi-ebilmek var olmak kullanılmış ve uygulamaları araştırma.
Tahlil toplam PBMCs ve zenginleştirilmiş NK hücreleri ile çalışsa da, hücre popülasyonlarının arındırmak için gerek kalmadan PBMCs kullanma seçeneğine zaman.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çakışma mali ilgi bildirin.
Teşekkürler
Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Merkezi, el yazması hazırlık ile ona yardım için teşekkür etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fosfat Tamponlu Salin (1x, Ca2+ ve Mg2+ olmadan) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Isı ile İnaktive Fetal Sığır Serumu | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penisilin Streptomisin | Yaşam Teknolojileri | 15140-163 | 10.000 U/mL |
| IL-2 | R& D Sistemleri | 202-IL-050 | 0.2 & mu'dan liyofilize; Taşıyıcı protein olarak BSA ile Asetonitril ve TFA'da m filtrelenmiş çözelti. 100 & mu'da 500 ul ile sulandırın; en az% 0.1 sığır serum albümini içeren steril 100 mM Asetik Asit içinde g / mL (2.1x10E6 IU / ml) |
| K562 Hücreleri | ATCC | CCL-243 | Kanser hücre hattı |
| T-75 hücre kültürü şişeleri | Corning | 431464 | |
| CFSE hücre proliferasyon kiti | Yaşam Teknolojileri (CellTrace) | C34554 | 5mM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için I şişesini 18 ul DMSO ile sulandırın. Dondurmayın/çözmeyin. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stok çözümü 5 &mu'da sağlanır; 1 mL DMSO'da M. DMSO çözeltisi, reaktif bozulması olmadan birden fazla donma-çözülme döngüsüne tabi tutulabilir. |
| Sodyum / lityum heparin kan alma tüpleri | BD | 02-687-95 | |
| U-tabanlı 96 oyuklu plaka | Corning | CLS3897 | |
| Serolojik pipetler | BD Falcon | ||
| Polistiren yuvarlak tabanlı tüpler (5 mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polipropilen konik boru | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polipropilen konik boru | BD Falcon | 352097 | |
| Reaktif rezervuarı | USA Scientific | 2321-2230 | |
| İnsan NK hücre zenginleştirme kokteyli | Kök Hücre Teknolojileri (RosetteSep) | 15065 |
Kaynaklar
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
