Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

9.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56212

⸱

22 Ağustos 2017

 ,  , 
1Department of Biology, University of Copenhagen

Bu makalede

Özet

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Özet

Transfer RNA (tRNA) herhangi bir canlı translasyonel makinelerin önemli bir parçasıdır. tRNA bağlamak ve amino asitler için çeviri ribozom aktarın. Farklı tRNA göreli seviyeleri ve aminoacylated oranı tRNA toplam tRNA, şarj düzeyi olarak bilinen için doğruluk ve çeviri hızını belirlemede önemli faktörlerdir. Bu nedenle, bolluk ve şarj tRNA düzeyde protein sentezi, örneğin çeşitli stres koşullarında okurken ölçmek için önemli değişkenlerdir. Burada, tRNA hasat ve doğrudan göreli bereket ve Escherichia colibelirli tRNA türler mutlak şarj düzeyini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. TRNA tRNA ve onun amino asit arasında değişken bağ korunmuş şekilde hasat edilir. RNA sonra Jel Elektroforez ve kurutma, ücret ve doldurulmamış tRNA ayrılması hangi sonuçlar Kuzey tabi tutulur. Normalleştirme spike hücreler ilavesi nedeniyle farklı örneklerinde belirli tRNA düzeyde karşılaştırılabilir. Önce RNA arıtma, her örnek için nadir tRNAselC yatırıma E. coli hücrelerinin % 5 ekleyin. Bir örnek ilgi tRNA tür miktarı o zaman tRNAselC aynı örnek miktarı için normalleştirilmiş. Ayrıca spike hücreler RNA arıtma önce Ayrıca hücre lizis verimliliği tüm farklılıkları örnekleri arasında için hesaplar arıtılmış spike bileşenini RNA'lar ek avantajı vardır.

Giriş

Aşağıda, biz belirli tRNA miktarının bir yöntem mevcut ve kendi şarj ölçme düzeyleri Kuzey Blot tarafından. Bu yöntem ilk Varshney vd tarafından geliştirilen bir teknik üzerinde dayanır 1. hücre trichloroacetic asit (TCA) hasat ve RNA arıtma boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak, korunmuş2,3,4arasında tRNA ve amino asit ester bağı olduğunu. Aminoacylated tRNA nonacylated karşılıkları Jel Elektroforez ve seçkin Kuzey kurutma, tarafından kusura bakmayın ama aminoacylated azalmış bir hareketlilik için tRNA kovalent bağlı amino asit5tarafından neden jel içinde. Ayrıca, biz tRNA miktarları sık kullanılmayan tRNAselC 4overexpressing spike hücreler ilavesi ile normalize için bir iletişim kuralı mevcut.

tRNA bakteri hücre ve çeviri makineleri kesinlikle hayati bir parçası en bol moleküllerin bazıları. tRNA amino asitleri bağlama ve çeviri ribozomlara aktarabilirsiniz. Aminoasitler tRNA (aminoacylation veya şarj) için bağlama aminoasil tRNA sentetaz tarafından yönetilir. Farklı ücret tRNA göreli bolluk protein sentezi, kalitesini sağlamak için önemli çünkü tRNA için verilen mesajcı RNA (mRNA) kodon konağımız yakınındaki tRNA eşitlenmesi olasılığını artırır konağımız underrepresentation tahsil Yanlışlıkla onun amino asit büyüyen polipeptid zinciri ribozom6teslim. Şarj edilmiş tRNA önemini E. coli hücre geniş yanıt bir tRNA şarj düzeyleri ciddi bir düşüş olarak yansıtılır; sıkı yanıt. Sıkı tepki sırasında tRNA, ribozomal RNA'ların ve çoğu mRNA sentezi, amino asit biyosentezi ve stres hayatta kalma ile ilişkili belirli mRNA'lar transkripsiyon lehine indirilir ve hücrelerin büyüme oranı önemli ölçüde düşürdü7 . Ayrıca, bize ve diğerleri tarafından son iş E. coli aktif tRNA düzeyleri ayarlama olabileceğini düşündüren onun tRNA yanıt olarak çeviri4,8, limit gerilmeler çoğunluğu düşürür gösterdi Böyle stres ile başa çıkma için önemli. Böylece, güvenilir ölçümler tRNA zenginliği ve düzeyleri şarj tamamen bakteriyel stres yanıt-e doğru anlamak için önemli bir araç olacak.

E.coli rekombinant protein hızlı için yaygın olarak kullanılır ve türler arasında kodon kullanım farklılıkları nedeniyle bir sorun kez karşı karşıya9suboptimal ifadesidir. Bu ek tRNA rekombinant mRNA10çevirmek için gerekli ifade tarafından atlatılabilir. Böyle suşları seviyelerinde şarj tRNA ölçümleri sorun giderme çabaları rehberlik ve protein ifade en iyi duruma getirmek.

Bu yöntem, aynı zamanda "mischarging"; algılama sağlar Konağımız olmayan amino asit ile bir tRNA molekül aminoacylated. Farklı amino asitler tarafından Aminoacylation-polyacrylamide jeller1,11biraz farklı hızları ile geçirilecek bir tRNA neden olabilir. Bazı durumlarda, yöntem aynı zamanda aksi takdirde aynı tRNA3farklı değişiklik desenleri ayırt etmek için kullanılabilir.

Düzeyleri şarj tRNA incelenmesi olduğunu periodate için oksidasyon başka bir biyokimyasal yordamı kurdu. TRNA korunuyorsunuz aminoacylated periodate oksidasyon ve doldurulmamış tRNA değil gözlem yöntemi kullanır. Sonra tRNA şarj şarj düzeyleri hasat RNA'ın tahmin etmek için kullanılan oksidasyon tedavi periodate. Ancak, birkaç tRNA şarj böylece biraz yanlışlık12-mek şartıyla tedavi tarafından etkilendiği gösterilmiştir. Yöntem burada doğrudan saf RNA şarj, böylece herhangi bir önyargıları kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar hariç önlemler sundu. Bu yöntemin bir sınırlama yalnızca bir o tRNA türler algılandığında bir zamanda, öylesine her ne kadar aynı Kuzey leke-ebilmek var soymak ve birden çok tRNA için reprobed zaman alan ve pek çok tRNA üzerinde veri toplamak biraz zahmetli olması.

Örnekleri birbirlerine normalleştirme için güvenilir bir yol hedefi farklı örnekler üzerindeki göreli bir molekül düzeyde karşılaştırmak için nerede çalışmalarda önemlidir. Burada küçük bir aliquot nadir tRNAselC overexpressing E. coli hücre içinde bir spike RNA arıtma önce deneysel örnekleri eklendiği RNA için normalleştirme işlemi tanıtmak. Bu yöntem sadece tRNA incelerken ama RNA'ın herhangi bir türün göreli miktar için deneysel Kur öyle ki hiçbir endojen RNA olmak güvenilir olabilir ne zaman tüm örnekleri aynı hücresel konsantrasyon mevcut yararlı olur. Örneğin, göreli miktarları arasında farklı başka bir RNA'ın karşılaştırmak için endojen bir başvuru13örnekleri gibi bir "temizlik" RNA gibi ribozomal RNA düzeyini kez kullanılır. Ama örnekleme bir stres yanıt15,16,17 veya sırasında oluşursa ribozomal RNA için durum olabilir gibi bu küçük kullanımı başvuru RNA hücresel konsantrasyonu örnekleri arasında değişir durağan faz17girmesinden. Spike hücreler RNA arıtma önce deneysel örnekleri için ek normalleştirme örnekleme kurulumunu bağımsız sağlam ve doğru bir yol sağlar. Başka bir belirli bir veya daha fazla spike içinde RNA'ların deneysel örnekleri eklenmesinden sonra RNA arınma yoludur. Ancak, bu yöntem için RNA kurtarma farklılıklarını örnekler arasındaki hesap değil.

E. coli hücreleri kullanarak bir deneyde E. coli olarak (bkz: şekil 1) spike hücreler olarak RNA gönderme yapıyor bunun dezavantajı o overexpress Ayrıca eksojen E. coli az miktarda toplam RNA örnekleri. Biz bu ek için yalnızca spike hücreler (bkz. Şekil 2, lane "selC" etiketli leke Kuzey) deneysel örnekleri ile paralel olarak içeren bir örnek analiz ederek doğru. Sunulan protokolü E. coli K-12 için geliştirilmiş ancak çoğu bakteriyel türler için geçerli olması muhtemeldir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. bakteriyel kültürlerde hazırlanması.

  1. Grow bütün kültürlerde Erlenmeyer şişeler ile bir kültür/şişesi hacim oranı en az 1/6. 37,0 ° C'de kültürler ve tercih edilen karbon kaynağı, örneğin % 0,2 glikoz, en az 10 ile takıma morpholinepropanesulfonic asit (paspas) en az orta 18 160 rpm'de sallayarak tipik bir deneysel Kur içinde büyümek RNA hasat önce üst üste nesilleri.
  2. RNA hasat, önceki gün seyreltik BEZLERİ en az orta ertesi gün istediğiniz saatte istediğiniz OD 436 ulaşacak şekilde istenen yük outgrown bir kültür. Aşılama için formül tarafından kullanmak için kültür geçmek hacmi hesaplamak:
    figure-protocol-1
    Not: Burada, OD Yeni istenen OD 436 gösterir Kuluçka sonra V Yeni gösterir seyreltilmiş kültür hacmi, OD eski gösterir üzerinden seyreltilmiş outgrown kültürünün OD 436, G gösterir kültür büyür, nesil sayısı üzerinden seyreltme (TRT 1) gün sonra (t 2) gerekli değildir ve olarak hesaplanan zaman zaman: zaman farklılığı (dk) arasında TRT 1 ve t 2 nesil süresi (dk) bölünür. Örnekleme zamanında kararlı durum büyüme sağlamak için G olmalıdır ≥ 10; V eski taze ortamına aktarılması gerektiğini dışı yetiştirilen kültür seviyesini gösterir. Bu denklem için herhangi bir gecikme aşama hesaba katmaz bir yaklaşım olduğunu; seyreltme taze medya dışı yetişkin bir kültür sonra sık sık gözlenen bir fenomen.
    1. Büyüme koşulları deneme amacına bağlı olarak değişiklik gösterir, ama hücre hücre varyasyon tRNA düzeyleri ve sonuçları (önerilen), tekrarlanabilirlik artırmak için büyümek örnekleme öncesi durumunu sürekli kültürler sınırlamak için 19.

2. Spike hücreler hazırlanması

Not: tRNA selC bir izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) kontrolü altında kodlama selC gen ifade E. coli zorlanma MAS1074,- indüklenebilir organizatörü spike zorlanma kullanılır.

  1. Dilute MAS1074 outgrown bir kültür 0,05 BEZLERİ içinde bir OD 436 için en az orta 100 µg/mL Ampisilin ve % 0,2 glikoz ile desteklenmiştir. 160 rpm'de sallayarak 37 ° C'de kültür büyümek.
    Not: tartışma bir alternatif başvuru zorlanma kullanımı için bkz.
  2. , OD 436 ~ 0,1, tRNA selC ifade ikna etmek için 1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyin. Kültür OD 436 ~0.5 için büyümek (~ 3-4 s büyüme) ve kültür şişeye bir buz banyosu için hareket. RNA arıtma için tüm örneklerini hasat kadar buz spike hücre kültür devam.

3. Deneysel örnekleri hasat.

  1. Öncesi sıcak (37 ° C) bir şapkalı 100 mL Erlenmeyer şişesi (veya benzeri) bir sıcak su banyosunda yerleştirerek her örnek için 4 mL % 10 (w/v) trichloroacetic asit (TCA) içeren.
    Not: dikkat, hidrojen klorür ve kloroform gibi toksik ve aşındırıcı duman üreten Isıtma üzerine TCA parçalanır. Güçlü bir asit suda çözümdür; Bu şiddetle üsleri ile reaksiyona girer ve birçok metaller atmış. Bu sıvı kullanırken gerekli tedbirleri alınmalıdır.
  2. Hemen önce hücre hasat, ölçmek ve kültür OD 436 rekor.
  3. Hücreleri hasat, kültür 4 mL TCA içeren önceden ısıtılmış bir şişesi transfer.
  4. İçin 5 s. karıştırma TCA ile hemen tüm enzimatik faaliyetleri devre dışı bırakır ve böylece tRNA şarj düzeyini korur şişeye el ile dönen tarafından örnek mix.
    Not: Eğer birden fazla örnekleri toplanması için tüm örnekleri toplayana kadar hasat örnekleri TCA buz üstünde tutun.

4. Ayrıca spike hücreler

Not: spike hücreler hazırlanması adım 2'de açıklanan.

    Ne zaman tüm örnekleri için RNA hazırlık
  1. toplanmıştır, her örnek için (OD üzerinde göre) % 5 spike hücreler ekleyin.
    Not: Gerekli spike hücre kültür hacmi formülle hesaplanır:
    figure-protocol-2
    V spike gerekli, spike-in hücre kültürü hacmi gösterir nerede V exp hacmi gösterir (TCA) olmadan hasat deneysel hücre kültürü, OD exp deneysel hücre kültürü OD 436 hasat TCA içine zaman gösterir. OD spike spike hücre kültürünün OD 436 gösterir. Eğer birden fazla örnekleri farklı ODs hasat, birimin eklendi spike hücreler her örnek için formüle göre ayarlanmalıdır.
    2. Spike hücreler katkısı faiz, RNA türü ölçmek için
  2. sadece 4 mL spike hücreler 4 mL TCA ile karıştırılarak spike hücreler içeren bir örnek hazırlamak. RNA bu örnekten diğer örnekleri için aynı şekilde hazırlayın.
  3. İsteğe bağlı olarak, spike hücreler, olmadan sadece deneysel örnek içeren başka bir şişe al ve tRNA için deneysel örnek katkısını ölçmek için içerir selC düzeyleri; tRNA selC endojen düzeyleri E. coli K-12 negligibly düşük.

5. RNA'ın hazırlık

Not: Burada açıklanan RNA hazırlık protokoldür esasen Varshney ve ark. tarafından açıklanan 1; Aminoacylated tRNA deacylation arıtma sırasında önlemek için asidik pH ve arıtma seyri boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak önemlidir. Örnekleri ve çözümleri tutmak için temiz steril tüpler/şişeler kullanın ve tüm çözümler ultrasaf (18,2 MΩ·cm direnci ile) su hazırlayın.

  1. Bir buz soğuk santrifüj tüpü dönüştürmek dökün 8 mL. Örnekleri de 4 ° C. tamamen Kaldır süpernatant 9.500 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve 0.3 mL soğuk 0,3 M sodyum asetat içinde pH 4.5 ve 10 mM EDTA resuspend.
  2. Her örnek için bir soğuk 1.5 mL microcentrifuge tüp nakletmek ve eklemek ile aynı tampon equilibrated 0.3 mL fenol.
    Not: dikkat, fenol zehirli gazlar oluşturur ve cilt için son derece korozif.
  3. Girdap her örnek 10 x 15 için en az 1 dk her girdap arasında bir iyimsersin. Vortexing arasında örnekleri 0 tutmak ° C. örnekleri soğuk kalmasını sağlamak için sık sık duraklar kullanın.
  4. İçin 20.000 x g 4 de 15 dk santrifüj örnekleri ° C. Transfer (üst aşama) su aşamaya yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpleri. 0.3 mL soğuk fenol ve girdap 4 x 15 s daha önce olduğu gibi ekleyin.
  5. 4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. Transfer 2,5 kat % 96 etanol (~ 750 µL) birimi içeren yeni, soğuk 1.5 mL microcentrifuge su aşamaya tüpleri. Tüpler için 1 h-20 ° C veya gecede-80 kuluçka tarafından RNA çökelti ° C.
  6. İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj örnekleri ° C. süpernatant atmak ve RNA Pelet bozmadan 1 mL soğuk % 70 etanol dikkatle ekleyin. Yavaşça iç etanol ile tüplerin yıkamak için bir kez tersine çevirin.
    Not: Pelet Bu adımda görmek zor olabilir.
  7. 4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve kadar hiçbir etanol sol Pelet kuruması. Pelet tarafından şiddetle vortexing 20 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4.5 ve 1 mm EDTA resuspend.
    Not: o-ecek var olmak resuspend zor gibi Pelet aşırı kuru değil.
  8. İsteğe bağlı olarak, RNA konsantrasyonu 260 Absorbans ölçerek değerlendirmek nm.
  9. İsteğe bağlı olarak, özel Jel Elektroforez 20 tarafından arıtılmış RNA kalitesini değerlendirmek.
  10. Mağaza örnekleri-80, ° C.
    Not: Burada protokol duraklatılmış.
< p sınıfı"jove_title" = > 6. Kimyasal olarak deacylated denetimi örneğini hazırlanması

Not: aminoacylated grup ayırt etmek için Kuzey üzerinde deacylated karşılığından tRNA leke, bir kimyasal deacylated aliquot alkali tedavisi tarafından hazırlanmıştır. Çoğu amaç için Kuzey her leke için deacylate tek bir örnek yeterli.

Buz
  1. tezcan RNA örnek. 4 µL aliquot RNA örneği için yeni bir tüp aktarın. 46 µL Tris-HCl pH 9.0 ekleyin. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
  2. PH 4.5 0,3 M sodyum asetat 15 µL ekleyip daha sonra 125 µL % 96 etanol ekler. -20 ° c için 1 h. RNA çökelti
  3. İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve 4 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4,5 ve 1 mM EDTA içinde resuspend.
    Not: örnek-80 depolanıyorsa, protokol, duraklatılmış ° C.

7. Jel Elektroforez ve Kuzey kurutma

  1. Mix 4 µL örnek (tedavi edilmemiş veya kimyasal olarak deacylated) ile 6 µL yükleme arabellek (0.1 M sodyum asetat (pH 5,0), 8 M üre, % 0.05 bromophenol mavi ve % 0.05 Ksilen cyanol).
    Not: yalnızca spike hücreler, içeren örnek eklemeyi unutmayın kimyasal olarak deacylated sample (ve bir hazır spike hücreler, olmadan).
  2. Örnekleri üzerine bir 0.4 mm kalınlığında % 6,5 polyacrylamide 0.1 M sodyum asetat arabellek (pH 5,0) 8 M üre içeren jel (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) yükleyin. TRNA türler uygun ayırma için 60 cm uzun jelleri kullanın.
  3. Ayrı RNA, 4 ° C'de 10 V/cm Jel Elektroforez tarafından mavi bromophenol kadar ulaşır jel (~ 20 h) alt.
  4. Alan Ksilen cyanol boya ve bromophenol mavi doğru aşağı 20 cm boya kurutma için kullanılır (iki boyalar arasındaki uzaklığı 25-30 cm olmalıdır). Böylece jel onlardan biri kalır iki cam levha, dikkatlice ayırın. Filtre kağıdı ince bir parçası istenen blotting alan boyutuna kesme ve kurutma için kullanılacak jel parçası üzerine yerleştirilir. Filtre kağıdı tarafından kapsanmayan jel parçaları kesilmiş ve atılan. jel parça cam levha uzak çýkýntýdan için filtre kağıdı kullanın.
    Not: Büyük jel çok kırılgandır çok özenle ele.
  5. Pozitif yüklü naylon membran (örneğin Hybond N + membran) jel üstüne yerleştirilir ve bu electroblotted 20 V 90 dk 40 mM Tris-asetat (pH 8.1), 2 mM EDTA Aktarım arabellek kullanarak için.
  6. Crosslink RNA UV ışık kullanarak membran için (0,12 J/cm 2).
    Not: Membran-ebilmek şimdi var olmak stok oda sıcaklığında ve protokol burada duraklatıldı.

8. Tasarım ve sondalar doğrulanması

Not: dikkatli tasarım ve Kuzey leke probları doğrulanması güvenilir sonuçlar elde etmek ve diğer RNA türleri ile istenmeyen çapraz hibridizasyon önlemek için çok önemli.

  1. Kullanım probları olarak kısa sentetik oligonucleotides. Sonda sıra faiz tRNA dizisi en benzersiz bir parçası için tamamlayıcı - bu kez antikodon döngü olduğunu bir şekilde Tasarla.
    Not: Çeşitli organizmalar üzerinden tahmin edilen tRNA sıralarının listesini veritabanı (GtRNAdb) 21 genomik tRNA bulunabilir.
  2. Ayarlama bir tahmin almak için dizinin uzunluğunu erime sıcaklığı 55-65 ° c
  3. Patlama (temel yerel hizalama arama aracı) seçilmiş sıra sıra 22 içinde açıklandığı gibi seçili tRNA için benzersiz olduğunu doğrulamak için deneyde kullanılan bakteriyel zorlanma genom dizisi karşı.
    Not: Tablo 1 E. coli K12 birkaç farklı tRNA için önerilen sonda serilerini listeler. Sonda faiz tRNA için belirli ise, sadece iki grup Kuzey leke (şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA) görünür ve yalnızca bir grup şeritte deacylated örnek (doldurulmamış tRNA) ile görülür. Daha--dan iki grup varsa veya daha fazla sonda özgüllük doğrulanmasını isterseniz, bkz.

9. Kuzey blot hibridizasyon

Not: Aşağıdaki adımlarda, membran sırayla probları başvurusu için belirli bir sonda da dahil olmak üzere istediğiniz belirli tRNA tamamlayıcı ile melezleşmiştir tRNA selC.

  1. Membran bir hibridizasyon tüpü yerleştirin ve 6 mL hibridizasyon çözüm ekleyin (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, %0,5 (w/v) SDS, 100 mg/mL sheared ve denatüre ringa balığı sperm DNA ve 5 x Denhardt ' s çözüm (100 x Denhardt ' s çözüm % 2 sığır serum albümin, % 2 polyvinylpyrrolidone 40 ve % 2 = Ficoll)).
  2. Ön arabellek için 1S 42 ° C. Ekle 30 pmol radyoaktif oligo-DNA prob 5 dönen membran melezlemek ' - sonu - etiketli ile 32 (Sambrook et al. tarafından açıklandığı gibi hazırlanmış P 23)
    Not: dikkat, 32 P yüksek enerjili beta emisyonları önemli cilt ve göz doz tehlike sunabilirim. 32 s. radyoaktif atık kullanarak, uygun kurumsal güvenlik protokollerini göre atılmalıdır zaman gerekli tedbirleri alınmalıdır.
  3. Membran gece 42, dönen sonda kuluçkaya ° C. Kaldır tek kullanımlık 10 mL pipet kullanarak soruşturma.
    Not: Eğer bir dolaba saklanan sonda kullanılabilmesinden.
  4. Hibridizasyon tüpte membran 0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS oda sıcaklığında 50 mL kısa bir süre içinde yıkayın.
    Not: Bu ilk yıkama çok ilişkisiz sonda içerir ve son derece olarak radyoaktif işlenmeli.
  5. Tekrar bir kez 9,4 adım, o zaman bir düz plastik konteyner veya bir kapak dahil olmak üzere tepsi membran taşıma. Yıkama solüsyonu (0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS) membran kapak ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
  6. Yıkama çözüm değiştirin ve çamaşır kadar tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı (, çözüm yıkama kez 3-4 değişiklikleri) elde etti. Nasıl boş bir alanı radyasyondan membran ölçerek gürültü oranı sinyal değişiklikleri algılamak ve nerede sonda özellikle tRNA melezleşmiştir alanına karşılaştırmak için bir Geiger-Müller tüpü kullanın.
    7. Sonda zar maruz kaldıktan sonra şerit edebilmek için
  7. emin olun (önemli) membran önce striptiz yordamı kurumasına olduğunu. Membran bir ince plastik torba veya sıkıca plastik kullanarak sarın ve hava-teyp veya kaynak tarafından sıkı sıkıya bağlanmanızı mühür şal yerleştirin. Mühürlü membran phosphorimaging ekrana koyun.
    Not: Phosphorimaging ekrandaki gerekli çekim hızı belirlenir sonda, özel faaliyetin tarafından RNA miktarı fo probedr ve sonda ve can hibridizasyon etkinliğini büyük ölçüde değişir; birkaç gün için bir kaç dakika uzaklıktadır. Deneyimi ile membran Geiger-Müller tüpü ile algılanan radyasyon şiddetini gerekli çekim hızı iyi bir gösterge sağlar. Güvenilir miktar için ekran değil pozlanmış önemli.
  8. Bir lazer tarayıcı kullanarak phosphorimaging ekran tarama ve dosyaya kaydetmek " .gel " biçimi.
    Not: Bir yüksek sinyal gürültü oranı güvenilir miktar için gereklidir. Bir tRNA sondalama iki bantlarında sonuçlanmalıdır; bir içeren aminoacylated tRNA (daha yavaş geçiş) ve bir içeren deacylated tRNA (daha hızlı geçiş). Bkz: Şekil 2.

10. Membran sıyırma

Not: membran için başka bir tRNA probed önce önceki sonda ilk membran sıyırma tarafından kaldırılmalıdır.

Membran kapak ve membran dökmek için
  1. ısı yeterince sıyırma arabellek (15 mM NaCl, 1.5 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS). 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  2. Tekrarlama adım 10.1 radyasyon yok kadar bir Geiger-Müller tüpü ile tespit; membran-ebilmek şimdi var olmak bölüm 9 açıklanan adımları izleyerek yeniden melezleşmiştir.

11. TRNA miktarının ve düzeyleri şarj

  1. yükü görüntüleme .gel dosyasına yazılım (Tablo reçetesi görmek). Nereye sinyal 3A rakam gösterildiği gibi düzensiz, olabilir bu yolun genişliğini çoğunu yayılmıştır ancak bantları kenarları hariç böyle bir şekilde her örnek yolları boyunca dikey bir çizgi çizmek.
  2. Visualize'ı tıklatarak her şeritli gelen sayar " analiz "-> " grafik oluşturmak ". Şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA her şeritli gelen temsil eden iki doruklarına şekil 3B ' gösterildiği gibi tanımlarken.
  3. Edinmek sayıları her ayında en yüksek tıklatarak " analiz "-> " alan rapor " ve her iki doruklarına altına alan kayıt.
    4. Ne zaman leke tRNA selC ve en az bir tRNA ilgi için probed
  4. tRNA tRNA selC ilgi düzeyleri normale.
    1. Her şeritte spike hücreler kaynaklanan tRNA oranını hesaplamak ve toplam sinyal denklemi kullanarak bu şeritte değerden çıkarmak:
      figure-protocol-3
      Not: Burada, Örnek tRNA bir tek şeritli bir membran için istenen tRNA; probed elde edilen sinyal = Örnek selC tRNA selC için; probed aynı membran aynı lane elde edilen sinyal = Ref tRNA için istenen tRNA; probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal = Ref selC tRNA selC için probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal =.
      2. Normalize etmek
    2. tRNA selC sinyal aynı Lane tarafından düzeltilen tRNA değeri her Lane bölmek.
      Not: tRNA selC sinyal katkısı örneklenen hücrelerden ihmal edilebilir düzeydedir (bkz: Şekil 2, lane etiketli "-selC ").
  5. Her iki zirveleri sinyal toplamı ile dolu tRNA temsil eden en yüksek sinyal bölerek düzeyinde her lane için şarj oluyor tRNA hesaplamak (ücret + doldurulmamış).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yordamı kullanarak burada, bereket ve üç tRNA düzeyde E. coli K-12 öncesi ve amino asit açlık sırasında ölçüldü şarj açıklanır.

Arginin auxotroph süzün NF9154 (thr Leyi onun argH thi mtl supE44) BEZLERİ en az orta % 0,4 gliserol, 50 µg/mL treonin, lösin, arginin ve 5 µg/mL histidin, sallayarak 37 ° C'de ile takıma en az on nesiller için yetiştirilen oldu 160 d/dak. Arginin açlık filtrasy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu iletişim kuralı aynı anda belirli E. coli şarj düzeyini ölçmek açıklar tRNA ve farklı örneklerinde tRNA göreli düzeyleri karşılaştırın. 1) örnekleri hücresel tRNA şarj düzeyleri, 2) tRNA miktarları göreli tRNA düzeyleri farklı örneklerinde güvenilir bir şekilde karşılaştırılabilir şekilde normale ve sp 3) tutulduğunu böyle bir şekilde işlemek için protokol kritik noktaları vardır tRNA ilgi için seçili sonda ecificity. Bu noktalar aşağıda ayrı ayrı ele alınmaktadır.

tRNA arıtma

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Marit Warrer mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bağımsız araştırma için Danimarka Konseyi tarafından desteklenmiştir | Doğa Bilimleri [1323-00343B] ve [DNRF120] Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ÜreMerck57-13-6Saflık >% 99
PoliakrilamidServa79-06-7
Bis (N, N'-Metilen-bis-akrilamid)BIO-RAD161-0201
Trikloroasetik asit (TCA)Sigma76-03-9
FenolMerck108-95-2
IPTG
Glikoz
Sodyum Asetat
EDTA
Etanol
Tris
Hidroklorik asit
Sodyum Klorür
NaH2PO4
Sodyum Sitrat
SDS
Ringa Balığı Sperm DNASigma100403-24-5
BSA
Polivinilpirolidon
Ficoll
P32 & gama; ATPPerkin Elmer
DNA oligoları (problar)TAG Kopenhag
Hybond N+ membranGE SağlıkRPN203B
Çapraz Bağlayıcı
Elektro Kurutma MakinesiBIO-RAD
Typhoon FLA 7000 TarayıcıGE Sağlık 28955809
Spektrofotometre
Hidridizasyon fırını
Geiger-Mü ller tüp
Fosfor görüntüleme ekranıGE Sağlık
Hibridizasyon tüpü
Kültür Şişeleri
1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri
20 ml santrifüj tüpleri
< güçlü > Adı< / güçlü >< güçlü > ŞirketKatalog NumarasıComments
Software
ImageQuantGE Healthcare
ExcelMicrosoft

Kaynaklar

  1. Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
  2. Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
  3. Krüger, M. K., Sørensen, M. A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo. J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).
  4. Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
  5. Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
  6. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
  7. Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
  8. Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302(2015).
  9. Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
  10. Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  11. Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
  12. Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
  13. Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
  14. Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).
  15. Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
  16. McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
  17. Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
  18. Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
  19. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  20. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  21. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  22. Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
  23. Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Transfer RNAtRNA Y klemesiRNA Safla t rmaJel ElektroforeziNorthern BlottingSpike in H crelerRNA KantifikasyonuAminoasil tRNAtRNA Bollu u
Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.