Method Article

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

DOI:

10.3791/56216

⸱

September 23rd, 2017

1Institute of Natural and Mathematical Sciences, Massey University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan Escherichia coli veya bakteriyel konjugasyon kullanarak Shigella flexneri yüksek yoğunluklu transposon ekleme kütüphane oluşturmak için basit bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bir transposon rastgele genomik ekleme tarafından bakterilerde benzersiz mutantlar, yüz binlerce topluluğu oluşturulmasına izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transposon mutagenesis gene bozulma rasgele genomik ekleme bir transposon adı verilen DNA parçasının üzerinden sağlayan bir yöntemdir. İletişim kuralı aşağıdaki sefaloridin direnç işaretleyicisi içeren bir transposon barındıran bir plazmid bakteri suşları arasında yüksek verim aktarmak için bir yöntem özetliyor. Plazmid kaynaklı transposase alıcı gerilme çok düşük insertional önyargı ile genom transposon ekler bir varyant tnp gen tarafından kodlanır. Bu yöntem böylece hangi Transpozonlar genomik konumlarda benzersiz alıcı bir zorlanma, Escherichia coli ya Shigella flexneri bakterilerin içine eklenmiş olan büyük mutant kitaplıkları oluşturulmasına izin verir. Elektroporasyon ya da kimyasal dönüştürme gibi diğer yöntemlerin aksine bakteriyel konjugasyon kullanarak benzersiz klonlar yüzbinlerce ile büyük kütüphaneleri oluşturulabilir. Bu yüksek yoğunluklu ekleme kütüphaneler, gerekli olmayan genlerdeki her 4-6 baz çifti olarak sık sık olarak ortaya çıkan eklemeleri ile verir. Bir ucuz, kolay ve yüksek verimliliği yöntemi yoğun transposon ekleme Kütüphane yaratılması için izin veren bir yayın gibi diğer yöntemler için bu yöntem üstündür. Transposon Kütüphane-ebilmek var olmak kullanılmış (Tn-Seq), genetik etkileşim ağları, anlaması için sıralama transposon gibi aşağı akım uygulamalarda veya daha açıkçası, mutational (ileri genetik) ekranlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transposon mutagenesis kütüphaneler bakterilerde oluşturulması uygulamaları keşifler bakteriyel patojenler1,2, virülans genlerin için gerekli genler3, çalışmalar arasında değişen, çok çeşitli için yararlıdır 4 , 5 , 6, genetik etkileşim tanımlaması için7,8,9ağlar. Bu çalışmalar için kritik mutantlar büyük bir kütüphanesi oluşturmak için yeteneğidir. Bir transposon veya bir gen düzenleyici bölgeye ait açık okuma çerçevesi ekleme kez işlev veya ifade bozabilir olacaktır gibi Transpozonlar (rasgele bir genom eklediğiniz kısa parçaları DNA) gen işlevi, dağıtmak için basit bir yol kullanılır Gen.

Burada özetlenen E. coli ya da S. flexneri transposon kitaplıkta bakteriyel konjugasyon istimal plazmid pJA110tarafından oluşturulması için bir yöntemdir. Bu plazmid kullanarak iki ana avantajı vardır. PJA1 plazmid ifade Tn10 transposase türevi indüklenebilir ve düşük ekleme önyargı11,12transposon rastgele genom entegre olacak anlamı, vardır ilk avantajdır zaman isopropil Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) medyaya eklenir. Transposon transposon ekler mutantlarla seçim içine alıcı zorlanma kromozom için izin veren bir sefaloridin direnç işaretçisi içerir. PJA1 plazmid ikinci avantajı R6K mutant kökeni çoğaltma içerir olduğunu. Çoğaltma R6K mutant kökeni lambda pir gen plazmid13bakımı için sırayla gerektirir. Plazmid pir - suşları içinde çoğaltma yapamaz gibi alıcı zorlanma (şekil 1) kaybolur. Bu Tn10 transposase hücreden kaldırılır ve artık daha fazla mutasyonlar ilk transpozisyon olayından sonra azaltarak etkin değildir sağlar.

Bakteriyel konjugasyon pJA1 plazmid donör zorlanma alıcı zorlanma için taşımak için çeşitli nedenlerden dolayı avantajlı kullanmaktır. Konjugasyon basit ve ucuz gerçekleştirmek ve bir electroporator gibi özel ekipman ihtiyacı yoktur. Ayrıca, bakteriyel konjugasyon yüksek verimlilik için çok büyük bir kütüphane sağlar (> 2 x 105 benzersiz eklemeleri) sadece bir kaç mililitre (mL) gecede bakteri kültürü6ile elde edilebilir. Süreç yaklaşık iki saatlik uygulamalı kuluçka kez birlikte ve bakterilerin büyümesini alır. Langridge vd. 130 electroporations gerçekleştirme transposon mutagenesis kitaplığa bir boyuttaki bir benzer oluşturmak için rapor 14 tek bir fiil ile elde8, burada açıklanan. Emek yoğun ve zaman alıcı hazırlık electrocompetent hücre ve malzemelerin kullanımı pek çok pahalı (örneğin, elektroporasyon cuvettes), vasıl a fiyat daha--dan $1.000 USD sarf malzemeleri yalnız içinde 130 electroporations kullanımını gerektirir. Diğer çalışmalar10 benzer yöntemler kullandık ama farklı bakteri suşları ve elde çok daha küçük kütüphane (5 x 104 koloni oluşturan birimler) daha boyutları ile rapor burada.

Donör zorlanma ile ilgili notlar: Burada kullanılan donör zorlanma E. coli yük pJA1 transposon plazmid16içeren BW2076715 olduğunu. Soy BW20767 pJA1 plazmid transferini yüksek verimli yapma diğer suşları için eşlenik. Ayrıca, önemlisi, lambda BW20767 mi pır +. Daha önce de belirtildiği gibi plazmid pJA1 sadece lambda pir gen içeren suşları muhafaza edilmesi yapabiliyor. Bu yük sefaloridin ve Ampisilin dayanıklı olduğunu. PJA1 plazmid Ampisilin direnç işaretçisi içeren ve bir sefaloridin direnç işaretçisi transposon içinde yer alıyor. Bu zorlanma Ampisilin 100 µg/mL istimal plazmid seçimi ile büyüyor. Bu da ifade edilen yapısal transposase genler barındıran diğer suşların kararsız olduğu bilinmektedir kayda değer, kullanılan transposase ise işte altında ise indüklenebilir kontrol, sızan ifade düşük riski kalır. Bu nedenle, bu bu zorlanma geçirilmesi indirilmelidir ve taze bir çizgi her yeni kütüphane hazırlık için dondurulmuş bir kültürden alınması gereken önerilmektedir. Burada kullanılan donör baskı laboratuarımızın istek üzerine mevcuttur.

Alıcı zorlanma ile ilgili notlar: alıcı zorlanma seçim, E. coli K12 kaynaklı laboratuar suşları veya soy-in S.flexneri (Ayrıca bkz: tartışma) gibi büyük bir yük olabilir. Alıcı zorlanma sefaloridin direnmek, değil bir ek antibiyotik direnci işaretleyici olmalıdır, böylece donör zorlanma karşı seçilebilir. İçin alıcı zor, bir E. coli MG1655 zorlanma burada tanıtılan spontan nalidixic asit mutasyon ile kullanılır. Spontan nalidixic asit mutant kaplama gecede kültür 200 µL aliquots 30 µg/mL nalidixic asit içeren levhalar üzerine 2 mL dışarı tarafından seçildi. MG1655 tek bir klonu alıcı zorlanma olmak nalidixic aside dayanıklı seçilmiş. Ayrıca, alıcı zorlanma lambda pir negatif, yukarıda açıklandığı gibi olması gerekir.

Genel bakış: bakteriyel konjugasyon yerini almıştır ve pJA1 plazmid donör zorlanma alıcı zorlanma taşındı sonra IPTG ek olarak medya IPTG indüklenebilir kontrolü altında olduğunu tnp gen ifade neden lacIq/Ptac organizatörü (şekil 1). PJA1 üzerinde tnp gen ekleme daha düşük bir frekans sıcak noktalar6,10,11, sahip bir mutant transposase var. Ek ve indüksiyon IPTG ile transposon aktif ve rastgele genom eklenmiş. Plazmid lambda pir-alıcı zorlanma muhafaza ve kaybolur.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dikkat: S. flexneri alıcı bir yük kullanılıyorsa, S. flexneri gastrointestinal hastalık neden olabilir bir insan patojen olduğuna dikkat ediniz. S. flexneri ilgili deneyler (BSL-2 Avrupa ve ABD veya Yeni Zelanda PC2 belirlenmiştir) uygun Biyogüvenlik önlemleri ile gerçekleştirilmelidir. Bu iletişim kuralıyla ilişkili video gerçekleştirilen tüm deneyler yapılmıştır iyi karakterize alıcı zorlanma patojenik olmayan E. coli kullanarak bir PC1 ortamda MG1655. Shigella flexneri çalışmak daha önce yapılan Biozentrum Basel, BSL-2 laboratuarda 6 ' da açıklandığı gibi.

Not: aşağıdaki deneme etkili bir şekilde iki kez yapılır. İlk bölümü (adım adım 1.1 - 4.5) kaplama için en iyi seyreltme amaç konjügasyon plaka başına birçok bireysel koloniler, ama o kadar çok bu veren bir seyreltme çim formları bulmak için nerede Kütüphane bulmak için gerçekleştirilir. Bu önemli ölçüde azaltılmış fitness mutantlarla ve bu daha güçlü fitness ile arasındaki rekabet azaltmaktır. İkinci bölümü (adımları 5.1-7,4) son Kütüphane nerede birçok plakaları, Kütüphane seyreltme uygun yaymak, oluşturulmasıdır.

1. hazırlamak bir gün önce deney için

  1. Inoculate, donmuş bir hisse senedi LB suyu, 2 ml donör zorlanma dan Millers tarifi (10 g/L, NaCl) medya 100 µg/mL, Ampisilin içeren. Burada kullanılan donör zorlanma E. coli yük pJA1 plazmid 11 yataklık BW20767 15 olduğunu. Ampisilin kullanımı seçimi için pJA1 plazmid korur.
  2. Inoculate, bir koloni veya dondurulmuş hisse senedi, 2 ml LB medya Ampisilin veya sefaloridin dışında bir direnç marker ile alıcı zorlanma. Burada kullanılan alıcı yük E. coli olduğunu " vahşi türü " MG1655 17 , 18 spontan direnç mutant nalidixic asit ile süzün. 30 µg/mL nalidixic asit büyüyor.
  3. Et suyu %1,5 agar içeren 20 Luria hazırlamak (90 mM petri yemeklerinde, yaklaşık 12,5 mL) tabaklar. Birkaç ay öncesine kadar kullanım için antibiyotik eksik Ağar kaplamalar 4 ° C'de saklanabilir.
  4. 20 Luria suyu hazırlamak içeren % 1.5 agar levha (90 mM petri yemekler, yaklaşık 12,5 mL) hem 30 µg/mL nalidixic asit ve 50 µg/mL (LBA Nal30 Kan50), sefaloridin içeren. Antibiyotik içeren Ağar kaplamalar saklanabilir 4 ° C'de karanlıkta birkaç ay öncesine kadar kullanım için.
  5. 200 mL steril LB ortam hazırlamak. LB medya birkaç ay için oda sıcaklığında saklanabilir.
  6. 100 mm 1 mL steril IPTG, stokunun üretici göre hazırlamak ' s yönergeleri.

2. Bakteriyel çiftleşme veya fiil

  1. gecede kültür büyük donör yük 14.000 x 1 dakika santrifüj 1 mL g oda sıcaklığında. Büyüme medya atmak. Bu adım antibiyotik içeren tüm büyüme medyasını çıkarmaya olanak yapılıyor.
  2. Hücre Pelet böylece kültür konsantre 110 µL lb (antibiyotik içeren değil), resuspend.
  3. Kullanma steril forseps, pozisyon bir steril nitroselüloz filtre (alternatif olarak steril bir Bloting kağıt parçası, kullanılabilir malzemeleri görmek liste) orta (antibiyotik içeren değil) bir LBA plaka üzerine. Plaka etiket " negatif kontrol: donör ".
  4. Bir pipet kullanmadan bırak filtre üzerine konsantre donör kültürünün 50 µL.
  5. Plaka etiketleme 2.1-4 alıcı zorlanma için adımları yineleyin " negatif kontrol: alıcı. "
  6. Kitaplık için donör (Kimden adım 2.2) ve 50 µL (Kimden adım 2.5) (antibiyotikler bu tabak değil içermelidir) bir LBA plaka üzerinde alıcı baskı üzerine tek bir steril filtre 50 µL bırak. Bu plaka etiket " kitaplığı. " çiftleşme oluşur çünkü donör ve alıcı filtresini yakın fiziksel temas içinde.
  7. 6 h. için 37 ° C'de filtreleri içeren Ağar kaplamalar yerleştirin

3. PJA1 Transposon Transposase IPTG indüksiyon tarafından aktivasyonu

  1. hazırla üç 15 mL konik şişeleri LB IPTG ile 2 mL, 1 mM (Yani, IPTG, 100 mM stokunun 20 µL) son bir konsantrasyon içeren. Her etiket: donör denetim, alıcı kontrol ve kitaplık.
  2. Plakaları büyüme (Kimden adım 2.4) 37 ° c 6 h sonra da kuluçka kaldırın. Bazı bakterilerin büyüme üzerinde filtre görünür olmalıdır.
  3. Kullanma steril forseps, filtre kağıdı donör denetiminden kaldırmak ve donör denetim (adımından 3.1) etiketli 15 mL konik şişeyi yere koyun. Aynı şeyi alıcı kontrol ve Kütüphane için.
  4. Filtre kağıdı 15 mL konik şişenin altına almak ve bu tamamen LB. içinde sular altında emin olmak için tüplerin musluk
  5. : Yüksek nitroselüloz filtre bakterilerden ilişkisini kaldırmak için en az bir dakika girdap tüpleri. LB bakteri hücreleri ( Şekil 2) ile bulutlu haline gelmelidir.
  6. Steril cam boncuk veya steril bir ayırıcı kullanarak plaka vortexed bakteri süspansiyon etiketli LBA Nal30 Kan50 levha üzerine donör denetiminden 200 µL " donör denetim, 200 µL ".
  7. (3.6) Yukarıdaki plakaları etiketleme alıcı kontrol için tekrar " alıcı kontrol, 200 µL ".
  8. (3,7) Yukarıdaki plakaları etiketleme kitaplık için tekrar " Kütüphane, 200 µL ".
  9. Yapmak ek dilutions (Yani, 1:5, 1:10 ve 1: 100 dilutions, antibiyotik bir eritici değil içeren LB kullanarak) Kütüphane. Plaka 200 µl su katılmamış Kütüphane ve üzerine ek dilutions uygun şekilde etiketli LBA Nal30 Kan50 plakaları.
  10. 37 ° C yer kalıplara kuluçka fitness büyük kaybolmasına bir gen eklenmiş Transpozonlar ile 18 h. klonlar için büyümek ve plaka üzerinde görünür daha uzun sürebilir. Çeşitli koloni boyutları ( şekil 3) olmalıdır. Donör ve alıcı zorlanma plakaları yok kolonileri üzerlerinde olmalı.

4. Son Mutant kitaplığı için kullanılmak üzere kitaplık uygun seyreltme tercih

  1. büyüklü küçüklü birçok koloniler bu verimleri adım 3.9 kitaplığından bir seyreltme yeterince aralıklı belirleme. Amaç koloniler başka bir birleştirme ve kaynakları için rekabet gibi birçok koloniler mümkün bir plaka üzerinde ama çok fazla olarak elde etmektir. Bu sayı yaklaşık 500-2000 kolonileri tabak başı olmalıdır. Uygun koloni yoğunlukları bir plaka üzerinde bir örneği şekil 3 ' te gösterilen.
  2. Kolonileri plakaları kaydedin.
  3. Fiil (conjugants alıcı hücre başına sayısı) frekansını hesaplamak. Bu 1 x 10 -4 1 x 10 -6 19 aralığında olmalıdır.
  4. Tabanlı üzerinde aşağı akım uygulamaları son kütüphanede istenen mutantlar sayısını belirleyin. Birçok kullanıcı sade bir şekilde mümkün olduğunca çok sayıda mutantlarla bir kütüphanesi gerekli. Teorik olarak çok transposon eklemeleri mümkün oluşturmak için (bir ekleme her baz çifti), yaklaşık amacıly baz çifti olarak (örneğin, E. coli için ~4.5 x 10 6) genom aynı sayıda kolonileri tam olarak tüm olası transposon eklemeleri ile genom doyurmak için. Dikkat edilmesi gereken birçok mutantlar eklemeleri temel içinde barındıran önemli ya da işlevsel olarak önemli genler olmak yeniden elde etmek, mümkün olmayacaktır bu mutasyonlar alıcıya ölümcül olacak.
  5. İlk kütüphane ne kadar hacmi istediğiniz boyuta bir kütüphane oluşturmak için gerekli hesaplar. Örneğin, 5 x 10 4 mutantlar istediğiniz kitaplığı boyutudur. En iyi aralığı ile seyreltme kolonileri kimden adım 3,9 1:10 200 µL yapıldı seyreltme. Bu plaka üzerinde koloni sayısı yaklaşık 2.000 koloniler olduğu tahmin edilmektedir. 5 x 10 4 mutantlar ihtiyaç vardır ve her plaka 2000 kolonileri vardır, sonra 25 plakaları bu seyreltme gerekecektir.

5. Son Mutant Kütüphane yaratılması

  1. (bkz. Adım 4.4) gerektiği gibi adımda 1.4 tabak sayısını ayarlama adımları 1-3,8, yineleyin.
  2. 3,9 adımda istediğiniz boyuta kitaplığı oluşturmak için gerektiği kadar çok sayıda tabak üzerine 4.1. adımda seçilen seyreltme plaka (bkz. Adım 4.4).

6. Kütüphane yoğunluğu tahmin

  1. kaç kolonileri orada plaka çoğu saymak ve böylece ne kadar yoğun kütüphanesidir, kaba bir tahmin almak. Örneğin: 2 x 10 5 kolonileri toplam kaplama. E. coli MG1655 genom 6 baz çifti yaklaşık 4.5 x 10'dur. Bu nedenle, yaklaşık 2 x 10 5 bir kitaplıkla bir INSERT ortalama yoktur anlamına gelir her 22 baz çifti ekler ve yaklaşık 1 x 10 3 baz çifti her gen yaklaşık 45 kez, o bir gen verilen mutasyona olmasıdır. Eklemeler temel genlerde bu kitaplıkta çok underrepresented olması muhtemeldir ve böylece gerekli olmayan genler dansitesi bundan daha büyük olması muhtemeldir. Bir geniş tahmini transposon yoğunluğu ile bu tür hesaplama sağlar.

7. Transposon Kütüphane ve depolama havuzu

  1. kolonilerin sayımı sonra 1 mL LB (veya daha fazla, gerektiği gibi) eklemek için kütüphane plaka ve plaka bakterileri kazımak için steril bir ayırıcı kullanın. Bakteriyel süspansiyon çıkarın ve 50 mL veya 15 mL konik şişede yerleştirin. Tekrar ediyorum tüm plakaları için.
  2. Girdap bir dakika için havuza alınan bakteri süspansiyon süspansiyon lunaparkçı.
  3. % 20 son bir konsantrasyon için steril gliserol ekleyin.
    1. Kolay yeniden büyüme için 100 x 20 µL aliquots 0.25 mL tüpler hazırlayın.
    2. En az iki veya daha fazla 1 mL cryovials içinde aliquot hazır olun.
  4. Bütün aliquots-80 ° C'de depolayın

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyüme 18 saat sonra çeşitli koloni boyutları ile birçok kolonileri tabak içermelidir (şekil 3). Farklı koloni boyutları değişen fitness klonları gösterir ve protokol çalıştı iyi bir işaret vardır. Donör ve alıcı denetimleri hiçbir büyüme tabakaları üzerinde olmalıdır. Yukarıdaki protokolü kullanarak üzerinde 2 x 105 koloni oluşturan birimler (CFU) verim. Aynı anda beş Çoğalt conjugations protokole kadar ölçekleme yaklaşık 1 x 106 CFU verim. Önceki çalışmalarda, sonraki nesil sıralama kullanarak analiz kurmak ölçeklendirilen bir kütüphane verim belirtilen > 2 x 105 benzersiz eklemeleri6. Tüm kullanılabilir (ölümcül olmayan) eklemeleri temsil olmak gibi çok yüksek CFU (Yani, 1 x 106 CFU) benzersiz eklemeleri oranı Plato bekleniyor.

Bakteriyel konjugasyon diyagramı: plazmit transferi, IPTG transpozaz indüksiyonu, kanamisin seçimi.
Resim 1 : Bakteriyel konjugasyon ve kromozom transposon ekleme şematik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bakteriyel girdap süreci; tüplerde berrak ila bulanık ortam; Bakteri dağılım deneyinin diyagramı.
Resim 2 : Önce ve sonra vortexing LB medyada örtülü filtreleri görüntüsünü. Vortexing önce hücreleri için filtre sıkışmış ve medya açıktır. Olarak hücreleri filtre kapalı gelmiş ve medyada vortexing sonra medya bulutlu olur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Azar plakasında bakteri koloni büyümesi karşılaştırması; Mikrobiyal analiz.
Şekil 3 : (A)transposon kütüphaneden sonra büyüme 18 h temsilcisi tabak. (B) koloni boyutlarda yakın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan iletişim kuralı yoğun ekleme Kütüphane yapımı için izin verir. Bu yöntemi bir transposon kitaplığı oluşturma kullanma altındaki Kültür Cilt65 mL 2 x 10 üzerinden5 benzersiz transposon mutantlar ile olanak sağlar. Bunu gerçekleştirmek nispeten kolaydır, reaktifler en temel Mikrobiyoloji laboratuarlarında kullanılabilir kullanır ölçeklenebilir ve az pahalı ekipman veya elektroporasyon cuvettes gibi sarf malzemeleri şekilde gerektirir.

Bu yöntemin önemli bir yararı teorisinde, kullanıcı geniş enlem enterobacterial alıcı suş seçiminde, olmasıdır. Bu kağıt, diğerlerinin yanı sıra11, E. coli pJA1 plazmid Shigella flexneri6 ve Salmonella enterica gibi diğer enterobacterial alıcı türleri ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır ancak alıcı bir yük kullanın serovar Typhimurium süzün SL134410. Teorik olarak, pJA1 (oriR6Kγ) çoğaltmasında γ kökeni bu plazmid alıcı zorlanma olduğunu sağlayan bir geniş ana Aralık19, devam etmesine izin verir pır +. Son zamanlarda, yeni yöntemler pır + enterobacterial suşları20ek bir esneklik veren, bir dizi yapımı için izin tarif edilmistir. Buna ek olarak, pJA1 içinde RP4 plazmid300 baz çifti çete bölgesinden bu plazmid Konjügatif transferini gram negatif bakteri suşları19geniş bir yelpazesi için sağlar. Çeşitli şartlar yerine getirildiği sürece Basitçe söylemek gerekirse, bu yöntem teorik olarak alıcı suşları, çeşitli ile kullanılabilir: piryük olduğunu + ve sefaloridin dışında ve donör zorlanma dışında bir antibiyotik direnci ile işaretlenir.

Protokol kritik bir adımda dışarı adım 4.1 plaka hücrelerinin doğru sayısı tahmini yaparken yatıyor. Koloniler çok yakından aralıklı, plaka üzerinde besinler için rekabet ve daha az uygun mutant outcompeted. Bu mutant toplam sayısı bir azalma neden olabilir. Alternatif olarak, koloniler aralıklandırılmış Eğer çok çok ayrı plaka üzerinde çok az kolonileri olacak ve büyük bir kütüphane ulaşmak için gereken Ağar kaplamalar toplam sayısı külfetli olur. Bu nedenle, plaka başına koloni numara açısından doğru dengeyi elde etmek önemlidir.

Listelenen adımları açıklandığı gibi çalıştığınızdan emin olmak için iletişim kuralında denetimleri gerçekleştirmek önemlidir. Özellikle, nalidixic asit donör zorlanma karşı karşı bir seçim olarak kullanırken, negatif donör denetim plakaları kolonileri ücretsizdir emin olmak önemlidir. Nalidixic asit, yanlış pozitif verimli spontan direnç oranı düşük (yaklaşık 1 x 10-10)21 olabileceğinden bu. Tipik olarak, yaklaşık 2 x 10-4 19konjügasyon ve devralınmasına oranıdır. Bu nedenle, fiil ve devralınmasına büyüklükte birkaç emir nalidixic asit spontan direnç hızından daha büyük oranıdır. Bu nedenle, doğru yansıtılması olaylarına göre yanlış pozitif oranı çok düşüktür ve protokol çalışırken ihmal edilebilir sayılır. Ancak, konjugasyon veya hukuka oranları önemli ölçüde azalır, (den düşük çiftleşme verimliliği ve/veya transposase gen IPTG ile indüksiyon eksikliği) ve iletişim kuralını ölçekli Eğer bu, o zaman yanlış pozitif sayı için telafi etmek için (Bu klonlar eklenen transposon var mı) da artırabilir.

Adımları 3.2 ve 3.10 kuluçka zamanlarında bazı değişiklikler yapılabilir. Konjugasyon 6 h için gerçekleşmesi gereken 3.2 Birleşik adım, ama deneyim, bu saat adım olabilir (Yani, 4-7 h) sonuçları önemli ölçüde değiştirmeden farklı. Ayrıca, 3.10 adımda koloniler agar Tabaklarda inkübe süreyi da ayarlanabilir. Bu alıcı zorlanma zaman ya da büyüme oranını iki katına ortalama bağlı olarak farklı olabilir. Buna ek olarak, deneyim, 18 h çeşitli koloni boyutları, kitaplığa farklı uygunluk gösteren vermiştir. Ancak, büyük ölçüde azaltılmış fitness ile kolonileri büyümek için daha uzun sürebilir ve bu nedenle 18 h sonra görünür olmayabilir. Bu yöntem son derece düşük fitness klonları bulmak için kullanılıyorsa uzun kuluçka süreleri ve daha az kolonileri kalabalık (Yani, 48 h, 50-300 kolonileri) azaltmak için plaka üzerinde kullanılabilir.

Bu yöntemin ek tuzaklar zaten sefaloridin dayanıklıdır alıcı bir yük kullanmak mümkün değil içerir. PJA1 plazmid sefaloridin direnç işaretleyicisinde bu engeli aşmak için kloramfenikol direnç gibi alternatif bir seçilebilir marker için takas mümkün olabilir. Teorik olarak, bu alıcı bir gerginlik, Ampisilin dayanıklıdır kullanmak mümkün, dikkati de olabilir, pJA1 plazmid Ampisilin direnç işaretçiyi içeren transpozisyonu kısa bir süre sonra kaybolur.

Yoğun transposon kütüphane seçim genetik arka planda oluşturulmasını birçok aşağı akım uygulama için potansiyel olarak avantajlıdır. Örneğin, bir yoğun transposon Kütüphane auxotrophic mutantlar yineleme kaplama22 kullanarak veya bir enfeksiyon1,2kurulması kusurlu mutantlar tanımlamak için kullanılabilir. Daha yakın zamanlarda, DNA sıralama maliyeti düşmüş ve sonraki nesil sıralama gibi yeni teknolojileri hale gelmiş gibi sıradan, transposon kütüphaneler derin DNA sıralama ile gen zorunluluk, gen işlevi, bir anlayış kazanmak için daha önce kullanılmış ve genetik etkileşimler. Bu yöntemlerden bazıları 23 ' te incelenir ve transposon Yönetmen: ekleme site sıralama (TraDIS), transposon sıralama (Tn-seq), derin sıralama (sayısı) ve ekleme sıralama (izleme yüksek üretilen iş ekleme gibi yöntemleri içerir INSeq). Aşağı akım yöntemlerin yoğun transposon ekleme kitaplıklar inşaat üzerinde güveniyor. Diğer vektörel çizimler için belirli aşağı akım yöntemlerin kullanılması gerekebilir, burada açıklanan protokolü takip etmek en göze çarpan yordam puanları genel olarak verir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

George Kilisesi laboratuvar pJA1 plazmid tür hediye için teşekkür ederiz. Ben Fabienne Hamburger ve Alex Boehm Urs Jenal laboratuarından Biozentrum Basel, bakteriyel konjugasyon yardım ve BW20767 zorlanma sağlamak için teşekkür ederiz. Ayrıca yararlı düzenlemeler için Olin Silander teşekkür ederiz. Bu araştırma için fon fon Massey Üniversitesi Yeni Zelanda ve sistemleri biyoloji (proje "Savaş Dirk Bumann layık X") İsviçreli girişimi tarafından Basel, İsviçre Üniversitesi sağlandı.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 mikron nitroselüloz filtreler (steril)MilliporeHAWP02500Alternatif olarak kurutma kağıdı kullanılabilir (aşağıda listelenmiştir)
Kurutma kağıdı ~ 1 inç daireler halinde kesilir, daha sonra folyoda otoklavlanır / sterilize edilir. Nitroselüloz filtreler veya kurutma kağıdı arasında verimlilik farkı yokturGE yaşam Bilimleri: ürün Sınıfı 3MM Chr Kurutma Kağıdı, yaprak, 46 > 57 cm3030-917Alternatif olarak nitroseloz filtreler kullanılabilir (yukarıda listelenmiştir)
Metal Forseps, sterilVWR/Global Science New ZealandMURRE009/01
Petri kapları, steril, 90 mm çap, 68 mL hacim,   12,5 mL çalışma hacmi.Interlab Yeni Zelanda2303-1090
Steril cam yayıcılarVWR/Global Science New ZealandNZNZSPREADERAlternatif olarak, kültürü plakalara yaymak için steril cam boncuklar kullanılabilir (aşağıda listelenmiştir)
Steril cam boncuklarVWR/Global Science New ZealandHERE1080603Alternatif olarak, kültürü plakalara yaymak için steril bir cam yayıcı kullanılabilir (yukarıda listelenmiştir)
Nalidiksik asit (isteğe bağlı)GoldBio.comN-015-250
Ampisilin sodyum tuzu BioChemicaVWR / Global Science New ZealandAPLIA0839.0025üretici tavsiyesine göre hazırlayın
Kanamisin sülfat BioChemicaVWR / Global Science New ZealandAPLIA1493.0010
IPTG (İzopropil ve beta; -D-1-tiyogalaktopiranosid)  Thermofisher New ZealandFMTR0393
Difco Agar granülFort Richard Laboratries/Interlab New Zealand214530
Luria Et Suyu Tabanı (Miller's LB Et Suyu Tabanı)Thermofisher12795-084
Gliserol bidistille %99,5VWR/Global Science New ZealandVWRC24388.320
15 ml polipropilen steril konik şişeler VWR / Global Science New ZealandCORN430791
Mikrosantrifüj tüpleri, düz kapak, 1.7ml, Ultra berrak PP, dereceli, otoklavlanabilir ve dondurulabilirVWR / Global Science New ZealandAXYGMCT-175-C
50ml Santrifüj tüpleri, Falcon, PP, konik, baskılı mezuniyet, düz vidalı kapaklı, sterilVWR / Global Science New ZealandBDAA352070
Name< / strong>CompanyKatalog NumarasıComments
Equipment
37C'de
: Ortamı sterilize etmek için otoklav 
inkübatör

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).
  2. Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection. Science. 269 (5222), 400-403 (1995).
  3. Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. Essential genes of a minimal bacterium. PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).
  4. Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).
  5. Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis. PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).
  6. Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality. BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).
  7. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  8. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  9. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  10. Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice. Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).
  11. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  12. Bender, J., Kleckner, N. IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition. The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).
  13. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
  14. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  15. Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).
  16. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  17. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as γδ. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45 (0), 135-140 (1981).
  18. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  19. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  20. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157(2012).
  21. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  22. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  23. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 5/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.

The second paragraph in the Discussion section was updated from:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

to:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

The References section was updated from:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
  4. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  5. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  6. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

to:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  4. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  5. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

Tags

Transposon MutagenesisBacterial ConjugationTransposon Insertion LibraryEscherichia ColiShigella FlexneriKanamycin ResistanceTn10 TransposonMutant LibraryGenetic ScreensGene Disruption

Related Articles