Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology

8.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56224

⸱

29 Kasım 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 2Institute for Bioengineering of Catalonia, Universitat de Barcelona and CIBER Enfermedades Respiratorias

Bu makalede

Özet

Malzeme özellikleri ve tensional parametreleri içinde vivo ölçmek için Araçlar eksikliği onların rolleri geliştirme sırasında doğrulama engeller. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ve mekanik özellikleri bozulmamış Zebra balığı embriyo sarısı cep epiboly sırasında ölçmek için nanopartikül izleme çalıştırmaya başladık. Bu, güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir müdahaleci müdahaleler kaçınarak yöntemlerdir.

Özet

Dokularda gelişen spatio-temporal organizasyon doğrudan faktörler elucidating birincil amacı kalkınma insan biridir. Çeşitli önermeler hücre ve dokuların farklı gelişim ve morfogenetik süreçlerde kronolojik zamanmekansal kuruluşlarındaki mekanik özelliklerinin anlayış önemli katkıları olmuştur iddiasında. Ancak, malzeme özellikleri ve tensional parametreleri içinde vivoölçmek için güvenilir ve erişilebilir araçları eksikliği nedeniyle, bu hipotez doğrulayarak zor olmuştur. Burada istihdam Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ve parçacık sağlam Zebra balığı embriyo sarısı hücresinin mekanik özelliklerini epiboly sırasında miktarının amacı ile izleme yöntemleri mevcut. Epiboly olan çalışma embriyo şeffaflık tarafından yönetilir bir erken korunmuş gelişimsel bir süreçtir. Doku mekaniği etkileyebilecek müdahaleci müdahaleler üstesinden gelmek bu yana bu yöntemleri uygulamak basit, güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir. Basit ve bir strateji montaj örnekleri, AFM kayıt ve nanoparçacık enjeksiyonları ve izleme için uygulandı. Bu yaklaşım diğer gelişimsel kez veya organizmalar bu yöntemler kolayca uyarlanabilir yapar.

Giriş

Morfogenetik süreçleri biyomekanik kontrolünü altta yatan fiziksel ilkeleri büyük ölçüde tanımsızdır. Biyomekanik çalışmalar moleküler ve hücresel düzeyde önemli ivme toplanıyor, doku/organizma düzeyinde biyomekanik parametreleri keşfi onun bebeklik iken. Hidrodinamik regresyon1 veya Video kuvvet mikroskobu2 araştırmacılar lazer mikrocerrahi3veya daha az müdahaleci Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) Disosiye hücreleri4 aktif ve pasif Kuvvetleri ayırt etmek için izin ver veya vivo 5 veya nanopartikül microrheology6 mendil'ın mekanik özellikleri ve yanıtları beklentisiyle izin verir.

AFM yüzey pürüzlülüğü ve konsol ipuçları temas üzerine saptırma uyum Problu yüzey7ile çözme atomik yüksek çözünürlüklü üç boyutlu topografik bir tekniktir. AFM istihdam farklı yöntemleri yüzey özellikleri, sürtünme, yapışma kuvvetleri ve çeşitli malzemelerin visko elastik özellikleri ölçme de dahil olmak üzere araştırma için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, AFM biyolojik örneklerin mekanik özellikleri hakkında bilgi almak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, AFM non-invaziv karmaşık kesme modülü tek hücreleri ile bilinen bükme sürekli8konsol için bağlı bir mikro uç salınım girintili yazımları uygulayarak ayıklayabilirsiniz. Bu ortaya çıkan Kuvvetleri sonucuna izin veriyor. Henüz, ve farklı yöntemleri izin rheological veri ve mekanik özellikleri tek tek hücreleri ayıklama AFM benzersiz değildir (Örneğin, Micropipette aspirasyon9, manyetik sitometresi (MTC)10büküm veya uniaxial çekme dayanımı «««test)11.

Henüz, bu roman metodolojileri uygulamaya karmaşık morfogenetik işlemleri basit değildir. Yumuşak küçük (µm mm), embriyonik dokuların mekanik özelliklerini belirlerken karşı karşıya ana sorunlar nelerdir (102 - 104 Pa aralığı) ve malzeme12doğası visko-elastik (Saat-bağımlı olayları veren artış). Bu nedenle mekanik özellikleri (sertlik, viskozite, yapışma) belirlenmesi için embriyo ve gelişmekte olan organizmalar belirli durumunda istihdam yöntemleri uyum önemlidir. İki önemli konu göz önüne geliştirme çalışmaya rheological yaklaşımlar analiz ederken alınması gerekir: müdahaleci bir girişimi engellemek için ve kolay erişilebilirlik sağlamak için. Bu senaryoda, micropipette aspirasyon, MTC ve gerilme test sınırlamalar sergi. İlk durumda, bir hücrenin muzdarip yüksek deformasyon onun fizyolojik ve mekanik özellikleri9değiştirebilir. İkinci durumda, sıkıca uygulanan stresleri sitoiskeleti yerel olarak deforme emin olmak için bir substrat için deneysel doku uygun gerek Ayrıca etkileri hücre harekete geçirmek durum ve, dolayısıyla, onların mekanik özellikleri10 tanıştırır mısın . Son, uniaxial gerilme yaklaşımlar gelişmekte olan organizmalar ve erişilebilirlik11geometri tarafından sınırlıdır.

AFM doğal çevrenin hantal örnek herhangi bir hazırlık yapmadan doğrudan içinde biyolojik örnekler incelenmesi verdiğinden daha iyi gelişim süreçleri çalışma için uygun görünüyor. Ayrılma embriyonik dokuların genellikle zor olduğu için Ayrıca, AFM probları indirimli boyutu sınırlama olmaksızın orta (sulu veya sulu olmayan), örnek ısı veya kimyasal türünü seçiminde çok yönlü yüksek derecede sağlar kompozisyon örnek. AFM büyük etki alanlarına uygulanması ve ölçekler saat için çok yönlü ve farklı gelişim aşamalarında veya fizyolojik şartlarda dokuların malzeme özelliklerini almak için istihdam edilmiştir. Bütün yerel doku arterler13 ya da kemik14 topografik açıdan ve bazı durumlarda, sklera gibi okudu gibi mekanik özellikleri de erişim tarihi15olmuştur. Topografya ayrıca canlı embriyolar Xenopus16görselleştirme, örneğin, hücre düzenlenmesi sırasında morfogenez izin içinde keşfedilmeyi. En son ve kapsamlı örnek hazırlama protokoller farklı gelişim sürecinde mekanik parametreler belirlemek için geliştirilmiştir. Nanoindentation haritalar yerel sabitlenmemiş doku bölümlerinde piliç embriyonik sindirim sistemi11için oluşturulan; gastrulating Zebra balığı embriyo4den izole tek tek ektoderm, mesoderm ve endoderm progenitör hücreler için alınan ya da mekanik özellikleri; sertlik ölçümleri epiblast ve ilkel çizgi explants üzerinde kuş embriyo17için gerçekleştirilen; ve sertlik degradeleri doğrudan Xenopus5embriyonik beyinde tanımlanan farklı bir desen.

AFM embriyonik gelişim keşfetmek için uygulamak için önemli bir nitel sıçrama basit erişilebilir morfogenetik süreçleri yaklaşan gelebilir. Zebra balığı epiboly içinde sınırlı bir küresel alanda blastoderm genişleme birkaç saat içinde doğrudan farklı dokuların koordine bir temel ve korunmuş, olaydır. Zebra balığı epiboly (küresel sahne) başlangıcında, hücreleri, zarflama Katmanı (EVL), yüzeysel tabakası hayvan pole büyük sarısı sinsisyal cepten oturan embriyo merkezli blastomeres yarı küresel bir kap kapsar. Epiboly EVL, kortikal bitkisel ward genişlemesi derin hücreleri (DCs) blastoderm ve sarısının etrafında sinsisyal sarısı hücre (E-YSL) dış tabakası oluşur. Epiboly EVL ve DCs bitkisel pole18,19,20kapatılması ile sona erer. Nasıl ve nerede Kuvvetleri epiboly sırasında oluşturulur ve nasıl genel olarak birleştiğinde değil henüz1,21açıktır.

Burada ayrıntılı olarak nasıl pasif mekanik doku özellikleri Zebra balığı sarısı ilerlemesinde epiboly sırasında in vivohücre anlaması için AFM uygulanacağını açıklar. Bunu yapmak için küçük mikroküreler probları gibi AFM cantilevers bağlı çalıştırmaya başladık. Bu kesin yerel bilgi üniform olmayan sarısı hücre yüzeyine içinde ve tensional gradyanlar ve onların dynamics zaman içinde çalışmaya alınmasını sağlar. Alternatif AFM kama cantilevers22kullananların gibi yaklaşımlar, değil yeterince kesin yerel veri render olacaktır. Konsol sonundaki örnek boyutundan daha büyük bir kama yapıştırmak için çok dikkatli işleme beceri gerektirir, kama tekniği iyi embriyo problama için uygun değildir (~ konsol uzunluğu daha büyük 2'ye katlanmış) mekaniği.

Modelleme ve nitel ve nicel bir şekilde hücreleri visko elastik özelliklerini karakterize geliştirilmiş onların biyomekanik için anlayabileceksiniz. Biyomekanik açıdan epiboly ve kortikal gerilim ölçümleri ve AFM tarafından çıkarılan dynamics, sadece talep bilgi anlamak önemlidir; Böylece doku biyofiziksel özellikleri hakkında bilgi için gerek yoktur. Bu bilgileri ayıklamak için çeşitli hücre Reolojisi teknikler geliştirilmiştir yıllar içinde farklı hücre türleri farklı fizyolojik şartlarda23altında karakterize için. AFM, MTC ve optik cımbız (OT) içerir. Bu yöntemler, ancak, embriyo veya organları ölçekte mezoskopik analizleri için yetersiz kanıtlanmıştır. Alternatif olarak, başarıyla nanopartikül izleme microrheology6 in vivo rheological ölçümler için adapte edilmiştir. Bu teknik bireysel parçacıkların Brown talebiyle analiz eder ve yerel micromechanical özelliklerini tanır.

Birlikte AFM ve nanoparçacık microrheology epiboly sırasında kortikal tensional dynamics tanımı ve yumurtalı iç mekanik özellikleri sağlar. Bu bilgiler tamamen Anizotropik stres EVL deformasyon yanıt farklılıkları bir sonucu olarak gelişir ve E-YSL korteks izotropik actomyosin daralma için sarısı sitoplazmik Katmanı (GKB) için gerekli bir model onayladığı EVL ve epiboly ilerleme1yönlü net hareketi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıda açıklanan tüm iletişim kuralı adımları kurumlarımıza hayvan bakımı yönergeleri izleyin.

1. Zebra balığı kültür

  1. Doğurmak ve standart koşullar altında yetişkin Zebra balığı korumak.
    Not: Bu çalışma için AB ve TL vahşi türü embriyo kullanılmıştır.
  2. Embriyo toplamak ve onları E3 embriyo orta24' te 28.5 ° C'de büyümek. Onları Morfoloji göre yukarıda açıklanan19sahne.

2. Atomik kuvvet mikroskobu

  1. El ile dechorionate Zebra balığı embriyo (bireysel ilgi alanlarına göre farklı yaştan) düzenledi. Chorions iki ince ve keskin forseps ( Tablo malzemelerigörmek) kaldırın.
    1. Bir forseps kullanarak koryon kavrama ve gözyaşı içinde diğer Forseps ile yapmak. Daha sonra bu gözyaşı ters bir bölgede koryon holding, embriyo delikten hafifçe itin.
    2. Dechorionation büyütme 8 X ve 50 X arasında ayarlanabilir bir dizi ile bir diseksiyon stereomicroscope altında gerçekleştirin.
  2. Embriyo AFM için mount
    1. Embriyo orta % 2 özel bir çözüm hazırlamak ve 35 mm Petri kabına bu ile doldurun. Kuvvetlendirmek izin. Özel yatakta ince Forseps ile 1.5 mm çapında (iki embriyo katı) ve yaklaşık 350 µm derinlik (yarım embriyo boyutu) küçük delikler yapmak.
    2. Özel katmanda yapılan sokmak embriyoların yer ve onlar özel embriyo orta yerde etrafında % 0,5 düşük bir çözüm yayarak erime vardır sizi temin ederim. Sadece onları deliklere güvenli embriyo etrafında bu çözüm dökün.
    3. Düşük erime noktası özel oda sıcaklığında katılaşır önce embriyo tarafından AFM probed ilgi bölge yukarı doğru (şekil 1A) karşıya gelecek şekilde döndürün.
  3. AFM tarafından embriyo incelemek
    1. Bulun ve bir 20 X objektif bir ters Atomik kuvvet mikroskobu istihdam petri kabına embriyo resim (bkz. Tablo reçetesi25) oda sıcaklığında (23-24 ° C).
      Not: Embriyo embriyo ortamda dalmış ve özel yatağa bağlı canlı tutulur.
    2. Döküm embriyo bir konsol bir nominal bahar sabit 5 mikron ve 1 Hz için onun sık sık oluş olarak konsol salınım en yüksek zirve genliğini N/m. ayarlayın 0.01 ile bağlı çapı 4.5 µm küresel polistren boncuk istihdam sarısı hücre yüzeyine sonda.
    3. Farklı pozisyonlar ve birkaç embriyolar ortalama veri için bir rutin olarak test edilecek her bölge için veri toplamak.
      Not: Beş pozisyonlar AFM mikroskop XY piezo-erişim düzenekleri ile prensibine göre konumunu kontrol ederek orta ve 10 µm x 10 µm kare köşelerinde bulunan soruşturma için iyi bir başlangıç noktası olduğunu. Görüntüleme ve veri toplama embriyo başına yaklaşık 20 dakika sürdü. Veri embriyo sarısı hücre yüzeyine farklı bölgelerinde kayıt, örneğin, bitkisel kutup veya farklı bölgeleri EVL hücre kenar boşluğu (şekil 1B ve 1 C), yakın sadece yapılabilir ayrı numuneler farklı yönelik istihdam ederek.
  4. Kuvvetleri hesaplamak
    1. Piezo-aktüatörler ve çeyreği fotodiyot kullanma onun saptırma (d) optik kolu yöntemle mikroskop kontrol yazılımı ile birleştiğinde ağırlık ölçme esneklik detektörler sensörleri ile AFM konsol (z) dikey yerinden ölçmek ( Tablo malzemeleri görmek 25).
    2. Bir cam coverslip çıplak bir bölgeden toplanan verilerden elde edilen bir d-z eğrinin eğim fotodiyot sinyal ve konsol saptırma (d) arasındaki ilişkiyi ayarlamak için kullanın.
      Not: Konsol saptırma ölçülen dikey deplasman eşittir ve yamaç optik kolu26saptırma duyarlılığını temsil eder.
    3. Termal dalgalanmaları gelen konsol bahar sabiti (k) daha önce27açıklandığı gibi algılayın.
    4. Örnek (h) girinti olarak hesaplamak:
      h (z - zc) = -(d - dkapalı)          (1)
      Not: Burada zc temas noktası konumunu ve dkapalı fotodiyot uzaklık.
    5. Kuvvet (F) konsol Hesapla:
      F = k · d (2)
  5. Viskoz sıvı kapsayan kortikal gerginlik Tc elastik bir tabakanın oluşan bir sıvı-balon modeli açısından korteksin gerginlik hesaplayın. Bu modelde, (göre embriyo boyutu), küçük girintili yazımları için kuvvet orantılı olarak4,28 olarak artar:
    F 4π Tc= [(Rb / Re) + 1)] h (3)
    Not: Burada Rb boncuk yarıçapı ve Re embriyo yarıçapı. Embriyo (400 µm) RADIUS iki büyüklük boncuk (2,25 µm), daha büyük olduğu gibi Zebra balığı embriyo için olarak bu denklem yaklaşık:
    F = 4π Tc h (4)
    1. Gerilim kuvveti-girinti (F-h) hesaplamak Eğriler için beş farklı her embriyo sarısı hücre bölgedeki gelin ölçümleri.
    2. Tc hesaplamak için her F-h eğri doğrusal en uygun küçük kareler tarafından için. İstatistiksel analiz, kortikal gerginlik Tc hesaplanan farklı F-h eğrileri ortalama gerekir için.
  6. Korteksin visko elastik özellikleri (Reolojisi) düşük genlik uygulayarak ölçmek (100 nm) multifrekans salınım AFM sırasında değişik Frekanslar25sinüsoidal dalgalar oluşur.
    1. Frekans etki alanından kuvvet girinti eğrileri bir etkili karmaşık modülü g*(ƒ) hesaplamak:
      g * (f) = [F(f) / h(f)]- IFB (5)
      Burada hayali birimdir ve frekans (f) spectra kuvvet ve girinti F(f) ve h(f) vardır. b için yüzeye uygulanan salınım çıkarılan konsol üzerinde yapışkan sürükle düzeltmedir.
    2. Gerçel ve sanal içine ayrı g*(ƒ) :
      g * (F) = g' (f) + IG'' (f)          (6)
      em > g'(f) elastik modül ve elastik enerji ölçüsü depolanan ve salınım döngüsü kurtarıldı. g'' (f) olduğu için harcanmış enerji hesapları viskoz modülü.
    3. Katı gibi bir dizinin sağlar kaybı tanjantı hesaplamak (< 1) veya sıvı benzeri (> 1) malzemenin, davranış olarak:
      g'' (f) / g' (f)          (7)
      Not: Bu tür ölçüm, parametreleri ayıklamak mümkün mü nasıl viskoz gösteren ve nasıl elastik Problu malzemedir. B biraz yüzeye konsol sonu mesafe bağlı olsa da, çok düşük değerler gverilen ´´ sarısı tarafından sergilenen ( 2D rakam aşağıda görmek) hücre, b küçük değişimler ihmal edilebilir bir etkiye sahip ölçümleri29.

3. parçacık izleme Microrheology

  1. Parçacık mikroenjeksiyon sarısı hücre içine gerçekleştirmek
    1. (Bkz. Tablo reçetesi) bir yatay micropipette puller ve kapiller borosilikat cam kullanarak özel microneedles imal.
      1. 1.00 mm, bir iç çapı 0,58 mm ve 10 çektirmenin ayarlar kullanılarak cm uzunluğunda bir dış çapı var microneedles hazırlamak: Basınç: 500; Isı: 510; Çekme: 65; Hız: 25; Zaman: 50.
    2. Bir enjeksiyon petri kabına plaka özel yapılmış kalıpları ( Tablo malzemelerigörmek) istihdam embriyo orta yatakta bir % 1'özel düz girinti şerit oluşturarak hazırlayın.
      1. Kalıpları ters çevirin ve sıvı özel jel üstüne koyup ve jel katılaşmış bir kez kalıpları çıkarın. Özel bir diseksiyon stereomicroscope 1.2 X büyütme, altında kalıp tarafından yapılan oluklar içine embriyo pipette.
        Not: Genişlik ve tasarım kalıpları kendi kendini hizalamak embriyo etkinleştirin.
    3. Önce enjeksiyon, enjeksiyon (yüzey gerilimi embriyo/koryon enjeksiyon sonra kaldırırken için iğne yapışmasını önler) kolaylaştırmak için orta neredeyse tamamen kaldırın.
    4. Floresan nano tanecikleri microinject (RADIUS bir = 100 nm, Tablo malzemelerigörmek) embriyo sarısı hücre (şekil 3A) bitkisel bölümünde (1:1, 000) suda seyreltilmiş.
    5. Micropipette hassas micromanipulators ile ayarlamak ve zaman ve basınç kontrol eder (bkz. Tablo reçetesi) ile otomatik bir microinjector boncuk enjekte. Arasında 10 ve 20 psi basınç ayarlı.
    6. Boncuk çözüm enjekte önce enjekte etmek için birim kalibre (0,5 nL) 1 x 0,01 mm sahne mikrometre ile teslim tarafından microinjector damlacık boyutu ölçerek ( Tablo reçetesigörmek).
    7. Oda sıcaklığında yapılan enjeksiyonlar sırasında embriyolar görselleştirmek için diseksiyon stereomicroscope 1.6 X büyütme istihdam.
  2. Termal dalgalanmaları kaydederek sarısı viskoelastik davranışını değerlendirmek
    1. Dechorionate olarak microinjected embriyo adım 2.1 ve % 0,5 düşük erime noktası özel 30 ° C'de embriyo orta çözümde katıştırmanız Daha sonra onları ( Tablo malzemelerigörmek) cam alt tabakaları bana aktarın ve yönlendirmek ve özel hala sıvı olduğunda onları coverslip doğru itin.
      Not: özel oda sıcaklığında katılaşır, embriyo yansıması için hazır olduğunda.
    2. Cam alt levha confocal ters mikroskop 2 h sahnede mikroenjeksiyon sonra monte embriyo yerleştirin. Nano tanecikleri 26 görüntülerini yakalamak bir ters confocal mikroskop Standart ticari mikroskop bilgisayar yazılımı istihdam içinde oda sıcaklığında 63 X amacı ile 25 Hz örnekleme hızında s (piksel boyutunu 166 = nm, her 40 ms yakalanan görüntüleri).
    3. Parçacıklar cisimlerin konumunu hesaplamak ve açık kaynak ImageJ yazılım (şekil 3B) TrackMate eklentisi ile zaman içinde onların yörüngeleri tanımlayın.
    4. Her bir parçacık özel yazılım6,30 ile iki boyutlu ortalama kare deplasman (MSD) hesaplamak:
      < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8)
      Not: Burada t geçen süre ve gecikme süresi. Bir saf viskoz sıvı viskozitesi (ν) göre Stokes-Einstein ilişki MSD ters artar:
      < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9)
      T mutlak sıcaklık nerede.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kortikal gerilim ölçümleri
Her ölçüm noktası için beş kuvvet-deplasman (F-z) eğrileri AFM tarafından 1 Hz değerinde 5 mikron tepe tepe genliği ile konsol ramping tarafından satın alınan (hız = 10 µm/s) ~ 2 µm maksimum bir girinti kadar. Bu yordam az 20 dk alıyordu ve epiboly ilerleme tarafından etkilenmez. Deneysel her koşul en az 5 embriyo test edildi.

Embriyo sarısı cepten kaydedilen kuvvet-deplasman eğrile...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İşte malzeme özellikleri ve Zebra balığı sarısı hücre epiboly sırasında bazı biyomekanik parametreleri kolayca AFM ve nano tanecikleri microrheology tarafından tahmin edilebilir olduğunu göstermektedir.

AFM hücre ve dokularda fizyolojik şartlarda4,5,25,28rheological özelliklerini almak için ediyor sağlam geliştirmek için AFM uygulamak için bir protokol buraya gelişti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

Biz Amayra Hernández-Vega ve Philippe-Alexandre Pouille bu protokoller için temel ayarlamak için katıldığınız için teşekkür ederiz. Ayrıca moleküler görüntüleme platformu IBMB-PCB, Xavier Esteban ve üyeleri, laboratuvar sürekli destek için teşekkür ederiz. Generalitat de Catalunya ve DGI ve Ekonomi Bakanlığı ve günümüzde İspanya'dan gelen Consolider hibe EMB ve DN konsolide grupları programı bu çalışmaları destekledi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ters optik mikroskopNikonTE2000Numunenin ve AFM konsolunun görselleştirilmesi
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM)Özelyapım-Herhangibir ticarileştirilmiş AFM kullanılabilir
Ters Konfokal mikroskopZeissLSM780Nanoreoloji veri toplama
Agarose D1 Düşük EEOConda8016.00Döküm embriyoları
Ultra saf LMP Agaroz (düşük erime)Invitrogen16520-100Embriyoların güvence altına alınması,
Zebra balığı, Mikroenjeksiyon ve Transplantasyon Kalıpları,Dünya Hassas AletleriZ-MOLDS,Döküm embriyoları. Orijinal boyutlarla özel olarak yapılmış
Dumont 5 ForsepsFST11251-201.5 mm çaplı
Si3< / sub>N<>sub4< / sub> konsolNovascan. GSEmbriyonun AFM ile ölçülmesi. Küresel uç: 4.5 & mikro; m çap ve k=0.01 N/m
Floresan nanopartiküllerYaşam TeknolojileriFluoSpheres F8811,Nanoreolojiyi izlemek için
Mikropipet çektirme SutterInstrumentsP-2000Özel mikroiğneler
Borosilikat kılcal camWarner InstrumentsG100TF-4Özel mikroiğneler üretimi
MikromanipülatörNarishigeMN-153Mikropipetin manipüle edilmesi
MikroenjektörEppendorfFemtoJet ExpressEnjeksiyon süresini ve basıncını kontrol
StereomikroskopLeicaDFC365FXEnjeksiyon sırasında embriyoların görselleştirilmesi
Analiz YazılımıMathWorksMatlabAFM ve parçacık izleme verilerinin analizi
Zebra balığıAB ve TL vahşi tip- Embriyo toplama için kullanılan suşlar
Cam Alt PlakalarMat TekP35G-0.170-14-CNanoreoloji veri toplama için embriyoların montajı
Aşama mikrometresiFST29025-02Enjeksiyon hacminin ölçülmesi
, PT de kullanılabilir: üretimi etme

Kaynaklar

  1. Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
  2. Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
  3. Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
  4. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
  5. Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
  6. Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
  7. de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
  8. Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
  9. Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
  10. Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914(2003).
  11. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
  12. Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
  13. Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
  14. Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21(1998).
  15. Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
  16. Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
  17. Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
  18. Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
  19. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  20. Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
  21. Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
  22. Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213(2014).
  23. Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
  24. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
  25. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
  26. Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
  27. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
  28. Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
  29. Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
  30. Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
  31. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
  32. Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
  33. He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
  34. Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Atomik Kuvvet MikroskobuEpiboliMekanik ÖzelliklerPartikül İzlemeKonfokal MikroskopiNanopartikül EnjeksiyonuKuvvet İndentasyonu
AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.