Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

Özet

Ca^{2 +} saklama kapasitesi ve Ca^{2 +}incelemek için bir yöntemi açıklamak için bu protokolü amaçlamaktadır - mitokondrial SH-SY5Y izole mitokondri şişme adım adım hücreleri tetikledi.

Özet

ATP üretimi oksidatif fosforilasyon tarafından mitokondri birincil işlevidir. Mitokondri daha yüksek ökaryotlarda da tampon sitozolik Ca^{2 +} içinde katılmak ve mitokondriyal ATP üretiminde intramitochondrial ücretsiz Ca^{2 +} konsantrasyon tarafından aracılık. CA^{2 +} saklama kapasitesi mitokondri kalsiyum mitokondrial matris korumak yeteneği olarak kabul edilebilir. Birikmiş intrasellüler Ca^{2 +} yol açan iç mitokondrial membran geçirgenliği molekülleri ile bir moleküler kaçağı neden daha az 1,5 kDa ağırlık mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP), açılış olarak adlandırdığı. CA^{2 +}-şişme mPTP açılış belirtmek için kullanılır mitokondri tetikledi. Burada, biz Ca^{2 +} saklama kapasitesi ve Ca^{2 +}incelemek için iki deneyleri tarif-izole mitokondri mitokondrial şişme tetikledi. Ca^{2 +} eklenir belirli miktarda sonra tüm adımları bir günde tamamladı ve Mikroplaka okuyucu tarafından kaydedildi. Böylece, bu iki basit ve etkili deneyleri Ca^{2 +}değerlendirmek için kabul edilebilir-mitokondrial işlevleri ile ilgili.

Giriş

Mitokondri memeli hücrelerinde oksidatif fosforilasyon tarafından kullanılan ATP yaklaşık % 95'i üretmek için ana hücresel organlar vardır. Bu münzevi micromolar konsantrasyonu Ca^{2 +} mitokondri tarafından ADP ve inorganik fosfat varlığı ADP sentez ATP¹' e fazdan için kullanılabilir bildirilmektedir. Konsantrasyonu sitozolik Ca^{2 +} bir eşiğin gittiğinde, mitokondri alımını Ca^{2 +} hızla olabilir ve sızma bu yavaş yavaş. Böylece, işleyen mitokondri akını artan sitozolik Ca^{2 +}olabilir. Oksidatif fosforilasyon katılımı için alakasız, mitokondrial Ca^{2 +} Ayrıca sitozolik kalsiyum sinyaller de katılmak ve mitokondriyal iç mPTP açılış inducing tarafından mitokondrial apoptotik mekanizması harekete geçirmek membran². Bu çok anormal yükselmesine intrasellüler Ca^{2 + 3}mPTP açarak mitokondrial büyük şişlik neden olabilir kabul edilmiştir. Böylece, mitokondriyal işlev mitokondrial Ca^{2 +} saklama kapasitesi ve Ca^{2 +}miktarının tarafından değerlendirmek için bu protokolü amaçlamaktadır-mitokondrial şişlik trigged.

CA^{2 +} saklama kapasitesi alımı sitozolik kalsiyum mitokondri yeteneği ölçümdür. Mitokondri sitozolik bedava kalsiyumu tampon ve kalsiyum-bağımlı hücresel süreçler tarafından etkin olmayan precipitates şeklinde kalsiyum alımını düzenleyen. Engelli Ca^{2 +} saklama kapasitesi enerji sınırlama ve hatta nörodejeneratif hastalıklar^4,5ile ilgili stres olayları oluşur. İzole mitokondri veya hücreleri digitonin permeabilized Ca^{2 +} saklama kapasitesi tanımlamak için kullanılabilir ve Ca^{2 +} ek Glutamat ve malat ile izole mitokondri tarafından birikir yeteneği yükseltilmiş tarafından etkilenen değil Mitokondrial yalıtım yordamı⁶. Digitonin titrated bir miktar farklı hücre tipleri plazma zarı permeabilize için kullanılmalıdır. Ca^{2 +}hexapotassium tuz-yeşil flüoresan boya, bir Ca^{2 +}bağlama-hassas cep impermeant görünür ışık telaşlı göstergesi, yaygın olarak kullanılan⁷oldu. CA^{2 +}-floresan boya düşük-benzeşme göstergesidir ve hücre içi ücretsiz Ca^{2 +} konsantrasyonları sırasında yükselmeye devam göstermek için kullanılan yeşil bağlama uzun süreli (5 dk) elektrodlar⁸. Bu yöntem radyoaktif filtre tekniği daha az hassas ancak büyük ölçüde basitleştirilmiştir. Ek Ca^{2 +} kalsiyum yeşil Floresans yükseltir ve Ca^{2 +} alımı mitokondri tarafından Floresans taban çizgisine döndürür. Mitokondri alımı extramitochondrial Ca^{2 + 9}başarısız kadar Ca^{2 +} sıralı eklemeler yapıldı. Bir floresan Mikroplaka okuyucu sürekli kalsiyum yeşil Floresans bildirmek için kullanılabilir.

Mitokondri depolarized Ca^{2 +} birikimi sonra yayımlanan Ca^{2 +} orta ve şişmeye başladı. CA^{2 +}-şişme mPTP açılış belirtmek için kullanılır mitokondri tetikledi. Elektron mikroskobu ve Ca^{2 +}ölçmek için kullanılan 540 nm can ışık Absorbans azalma-mitokondrial şişme^10,11tetikledi. Mitokondri birim doğrudan nerede Absorbans düşüşler mitokondrial matris pasif şişmesi yansıtmak ileriye doğru açı ışık saçılma¹²' belirlenebilir.

Burada, mitokondrial Ca^{2 +} saklama kapasitesi ve Ca^{2 +}incelemek için metodoloji göstermek-SH-SY5Y hücreleri izole mitokondri mitokondrial şişme tetikledi.

Protokol

1. mitokondri yalıtım

Not: Tüm çözümleri ve ekipman olmalı 0 - 4 ° C olarak precooled ve buz tuttu.

1. 10 cm hücre kültür çanak başına tohum yaklaşık 3 x 10⁶ SH-SY5Y hücreleri. Yüksek glikoz Dulbecco hücrelerde Kültür'ın kartal orta % 10 fetal sığır serum, penisilin (100 U/mL) ile modifiye-streptomisin (100 µg/mL). Gecede %5 CO₂ içeren bir kuluçka 37 ° C'de korumak.
   Not: en az 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y hücreleri her yalıtım tahlil için ihtiyaç vardır.
2. Orta kaldırmak ve yaklaşık 1 mL 10 cm hücre kültür tabak içinde buz soğuk PBS hücrelerle 3 kez yıkayın.
3. Buz soğuk PBS yeni 1 mL 10 cm hücre kültür çanak içine ekleyin ve yeni bir 1,5 mL tüp içine yapışık hücreleri kazımak. 4 ° C'de 10 dakika 800 x g, santrifüj
4. Santrifüjü sırasında proteaz inhibitörleri hisse senedi 50 μL ile takıma 5 mL mitokondrial yalıtım arabellek (250 mM Sükroz, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin ethanesulfonic asit), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA) hazırlamak çözüm (100 x konsantrasyon; 1 EDTA ücretsiz tablet GKD₂O 500 µL içinde çözünmüş).
5. Süpernatant kaldırmak ve Pelet mitokondrial yalıtım arabelleği 1 mL ile resuspend. Buz 30 dk için 1,5 mL tüp kuluçkaya.
6. Bir cam homogenizer (15-25 vuruş) askıya alınan hücrelerle yukarı ve aşağı el ile buzda parçalayıcı.
   Not: hava kabarcığı yok hücreleri homojen olduğundan emin olun. Sağlam hücreleri ve hücre çekirdeği bared tarafından mikroskop görsel olarak saymak ve bunu teyit > % 90 hücre kırılma oluştu.
7. Homogenate 1.5 mL tüp ve 4 ° C'de (çekirdek ve kalan sağlam hücreleri) enkaz kaldırmak için 5 min için 1000 x g, santrifüj içine aktarın.
8. Yeni 1,5 mL tüp ve 5 min için 1000 x g, santrifüj içine süpernatant transfer 4 ° C.
9. Yeni tüp ve 15dk için 14.000 x g, santrifüj süpernatant transfer 4 ° C.
10. Süpernatant kaldırmak ve mitokondri 1 mL mitokondrial yalıtım arabelleği ile içeren Pelet resuspend.
11. Çözüm 14.000 x g 4 ° C de 15 dakika santrifüj kapasitesi mitokondri çökelti.
12. Elde edilen mitokondri Pelet buz tuttu ve 50-100 μL KCl medya (125 mM KCl, 2 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM malat ve 2 mikron rotenon, pH 7,4) herhangi bir eşek önce Pelet hacmine göre resuspended ay.
13. Mitokondrial çözüm 5 μL standart BCA tahlil OD562 ölçme tarafından mitokondrial protein konsantrasyonu ölçmek için kullanın bir plaka okuyucu¹³kullanarak.

2. mitokondrial Ca^{2 +} saklama kapasite tayini

1. KCl ortam hazırlamak ve Ca^{2 +}Ekle-0.5 mikron deneme önce son bir konsantrasyon yeşil flüoresan boya bağlama.
2. 1 mL izole mitokondri (0.4 mg/mL) 0.5 mikron Ca^{2 +}içeren KCl medya aktarma-her 6-şey tabak içine yeşil flüoresan boya de bağlama.
3. Mitokondri ve Ca^{2 +}kuluçkaya-yeşil flüoresan boya oda sıcaklığında 1 dk. eklemek 4 μL aliquots 20 mm CaCl₂ çözüm (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl₂ için ortam ışığı korunuyorsunuz 6-şey plaka bağlama 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM malat, pH 7,4) her 6-şey plakasına iyi otomatik kullanarak dağıtmak 200 nmol Ca^{2 +}mitokondriyal /mg protein tanıtmak için ayarlama.
4. Floresans Spektrometre Floresans değişiklikleri izlemek için her 3 kullanın s 506 bir uyarma dalga boyu ile 2 min için nm ve emisyon dalga boyu 531 nm. Plaka için 3 600 RPM sallayarak ile donatılmış s yazılım (şekil 1) tarafından kontrol edilen kaynaklar arasında.
5. Her şey için bir ek 4 μL aliquot 20 mM CaCl₂ çözüm ekleyin ve her 3 Floresans değişiklikleri izlemek s 2 dakika süreyle Floresans zamanla artar kadar bu adımı yineleyin.
   Not: Mitokondri ile artan kayıt Floresans tarafından belirtilen ek Ca^{2 +} zorlanmaktadır. MPTP açıldığında, Floresans zamanla artar.
6. Toplam miktarı mPTP Ca^{2 +} saklama kapasitesi açana kadar eklendi Ca^{2 +} yorumlamak.

3. tespiti Ca ^{2 +}-mitokondrial şişme indüklenen

1. Deneme önce KCl ortam hazırlamak.
   1. İzole mitokondri (0.4 mg/mL) 1 mL KCl medyada de her 6-şey plaka aktarın.
2. 20 mm CaCl₂ sulu çözüm (500 nmol/mg mitokondrial protein) 10 μL mitokondrial şişme tetiklemek için mitokondrial protein ekleyin.
3. 540 Absorbans azalma kaydetmek nm her 3 s 10 dk (Şekil 2) için yazılım tarafından kontrol Mikroplaka okuyucu. Floresans değişiklikleri arasında mitokondri iç zar solutes bir akını tarafından kaynaklanır.
   Not: 540 azalmış Absorbans nm karşılık gelen şişmiş mitokondri. Eğer okuyucu bir düşüş Absorbans gözlemleme, bir daha uzun aralığı okuma veya okuma zamanı kabul edilebilir.

Sonuçlar

Ca^{2 +} saklama kapasitesi temsilcisi sonuçları:
Sonuçlar floresan değerler olarak ifade edildi. Ve Ca^{2 +} (200 nmols/mg mitokondrial protein), yukarıda mPTP açılış temelle Kişilik artışla Floresans ek darbeleri ile. 5 mikron Bongkrekate (BKA), bir inhibitörü olan Ca^{2 +}-indüklenen mPTP açılış veya 1 mikron atractyloside (ATR), Ca^{2 +}bir aktivatör-mPTP açılış indüklenen, izole mitokondri içinde eklenmiştir. Miktarı kadar mPTP açılış Çift ...

Tartışma

Burada, mitokondrial Ca^{2 +} saklama kapasitesi tahlil ve Ca^{2 +}için basit ve etkili iletişim kuralı açıklanan-mitokondrial şişme tahlil tetikledi.

Mitokondrial yalıtım için tüm malzeme ve tüpler buza, özellikle hücreleri homojenizasyon zaman olduğundan emin olun. % 0.25 tripsin-EDTA yemek 37 ° C'de 5 min için hücrelerden ayırmak için de kullanılabilir. 15-25 vuruş sonra mikroskop altında sağlam hücre zarı gözlemlemek ve mitokondri zar kırılma önlemek gereklidir. Ancak, biz ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SH-SY5Y hücre hattı	ATCC (Küresel Biyokaynak Merkezi)	ATCC Numarası: CRL-2266
Kalsiyum yeşili-5N	Yaşam Teknolojileri	c-3737	Ca2 + < / sup> bağlayıcı yeşil floresan boya
tam proteaz inhibitörleri	Roche Moleküler Biyokimyasallar	4693116001
cam homojenizatör	Kimble Chase	9885303002
glutamat	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malat	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl < sub>2< / sub>	Sigma-Aldrich	00457
K 2 < / sub >HP4< / sub>	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flaş cihazları	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
yüksek glikozlu Dulbecco' s modifiye Eagle ortamı	Hiklon	SH30022	4.5 g / L glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat fetal
sığır serumu	Penisilin	SV30087
	Sigma-Aldrich	P3032
streptomisin	Invitrogen	11860-038
BCA tahlil kiti	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm hücre kültürü kabı	NEST	704001