Yöntem makalesi

İdrar yolu Junction obstrüksiyonu kusurları Metilen mavisi boya enjeksiyonla değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/56247

⸱

12 Ekim 2017

1Cancer and Developmental Biology Laboratory, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metilen mavisi boya enjeksiyon renal pelvis içine idrar yolu junction obstrüksiyonu kusurları değerlendirme sırasında fare embriyonik üriner sistem geliştirme kolaylaştırır. Burada, renal pelvis içine Metilen mavisi boya enjeksiyon için bir protokol açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İdrar yolu junction obstrüksiyonu kusurları Konjenital anomalileri hydronephrosis ve hydroureter inducing vardır. Fare idrar yolu junction obstrüksiyonu kusurları Üriner sistemin içinde Metilen mavisi Boya akışı izleme tarafından tespit edilebilir. Metilen mavisi boya perinatal embriyonik böbrek renal pelvis enjekte edilir ve boya akışı hidrostatik basınç uygulandıktan sonra Üreter ve mesane Lümen içine böbrek renal pelvis üzerinden izlenir. Boya birikimi normal perinatal idrar kesesi Lümen belirgin olacak ama idrar yolu engellerden oluşursa renal pelvis ve anormal bir üreter, bitiş noktası arasında kısıtlı olacak. Bu yöntem idrar yolu Kavşağı engelleri onayı ve görselleştirme hydronephrosis ve hydroureter kolaylaştırır. Bu el yazması için idrar yolu Kavşağı engelleri onaylamak için renal pelvis içine Metilen mavisi boya enjeksiyon protokolünü açıklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üriner sistemin bir böbrek ve Üreter ve ortak bir mesane ve üretra ile oluşur. Üriner sistemin ana kan su ve elektrolit dengesi yöneterek vücut homeostazı korumak için fonksiyonudur. Böbrekler denetim elektrolit konsantrasyonları ve asit-baz dengesi kan filtre ve aşırı su ve solutes ve metabolitleri dahil olmak üzere atık salgılamak idrar üretmek. İdrar sonra böbrek renal pelvis üzerinden üreter nerede depolandığı ve sonuçta ortadan üretra1yolu ile tek yönlü bir şekilde bladderin için aracılığıyla taşınır.

Üreter düz borular nephric kanalı kaynaklanan vardır. Sonra fare embriyonik günde 10.5 (E10.5), tomurcuklanma nephric kanalı üzerinden üreter SAP hisli ve çok katmanlı bir yapıda fare arasında geçirimsiz olan urothelium adı verilen E12.5 ve E16.5 ayırır. Üreter sapı çevreleyen Mezenkimal hücreler de iç stromal hücreler, orta kalın düz kas hücreleri ve dış adventitial fibroblastlar içeren üç katmanlara farklı. Renal pelvis başlatılıyor üreteral Peristaltik dalgalar E16.5 içinde fare1başlayarak üretilen idrar2,3, taşımak için mesane üreter duvara düz kas tabakası yoluyla yayılır.

Konjenital anomalileri, böbrek ve idrar yolu (CAKUT) en sık görülen genetik hastalıklar, insan fetusa1,4, yaklaşık % 1'mevcut arasındadır ve fenotipleri hydronephrosis ve hydroureter de dahil olmak üzere çeşitli oluşur. İdrar hydronephrotic böbrek ve hydroureter oluşumu böbrek ve üreter sonucu anormal birikimi. Bir hydronephrosis ve/veya hydroureter oluşumu idrar yollarının bir obstrüksiyon nedenidir. Ureteropelvic junction obstrüksiyonu (UPJO) anormal idrar akışı proksimal Üreter ve renal pelvis, hydronephrosis ve proksimal hydroureter bükülme veya kalıcı katlanır5daralma sonuçlanan arasında bir tıkanma nedeniyle neden olur, 6. Buna ek olarak, mesane duvar veya üreme sistemi içine distal üreter Ektopik ekleme ureterovesical junction obstrüksiyonu (UVJO) denir. UVJO hydronephrosis ve hydromegaureter oluşumu7,8de tetikleyebilir. Vesicoureteric reflü (VUR) bir ek ureterovesical Kavşağı (UVJ) kusurdur. VUR doğru UVJ, böbrek mesane retrograd idrar akışı ile karakterizedir. UVJO için karşılaştırıldığında, VUR ile perinatal embriyo belirgin şişmiş hydronephrotic böbrek veya şiddetli hydroureter fenotip9gösterme.

Laboratuvar fare idrar akışı Metilen mavisi gibi bir boya enjeksiyon renal pelvis9içine tarafından incelenebilir. İnjectedmethylene mavi çözüm idrar yörünge renal pelvis Üreter ve mesanenin içine üzerinden iz olur. Hydronephrosis boya böbrek yönelik kabul edilebilir. UPJO Boya akışı şişmiş renal pelvis5ile proksimal üreter, tıkanması olarak tespit edilebilir. Genişletilmiş bir çapı belirtilen üreter herhangi bir genişleme hydroureter örneği gösterir. Son olarak, boya birikimi mesane duvar veya sitenin üreme sistemi ile şişmiş hydronephrotic böbrek UVJO gösterir ve hydromegaureter7,10santim açılmış. VUR algılamak için boya çözüm mesane enjekte edilir ve sonraki retrograd akışı böbrek9' izlenir.

Burada, perinatal embriyo içine renal pelvis Metilen mavisi boya enjeksiyon için bir protokol sunulmuştur. Bu iletişim kuralı renal pelvis Üreter ve mesanenin idrar akışı izleme sağlar ve UPJO veya UVJO gibi potansiyel idrar yolu Kavşağı engel olunur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fareler (Wnt5a flox / flox fareler (Wnt5a tm1.1Tpy) ve Dll1Cre satır, UVJO fare modeli) 7 yönetilen bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için NIH esaslarına göre ve ncı-Frederick hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol altında okudu.

1. hazırlık Metilen mavisi boya çözüm

  1. ölçmek 0.1 gr Metilen mavisi pudra.
  2. 10 mL normal salin veya 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x Metilen mavisi vortexing tarafından tamamen erimesi.
  3. Enjeksiyon sırasında tıkanma ortadan kaldırmak için bir şırınga filtre (membran gözenek boyutu 0.45µm) ile 10 mg/mL Metilen mavisi çözüm filtre.
  4. Montajı steril bir kafa derisi damar seti (27GX3/4 ″) 3 mL tek kullanımlık şırınga ve dolgu 3 mL şırınga ile Metilen mavisi çözüm filtre.
    Not: hidrostatik basınç ve sonraki Boya akışı önlemek için Metilen mavisi çözüm ile dolu şırınga yukarıda iğne ucu yerleştirin.

2. Doğum öncesi embriyo diseksiyon

  1. temiz makas ve Forseps ile % 70 etanol dissekan.
  2. E18.5 veya E19.5, Perinatal embriyo toplamak için ötenazi hamile fareler ilk CO 2 inhalasyon kullanarak ve servikal çıkığı NIH esaslarına göre gerçekleştirin.
    Not: Hamile kadın fare genellikle E18.5, başlangıç doğurur, ancak, daha büyük böbrekler işlemek daha kolay. Bu nedenle, doğum E19.5 daha yakın, böbrekler üzerinde bu Çözümlemeyi gerçekleştirmek daha kolay olur. Ancak, ikili üriner sistem tıkanıklıkları die ile doğumdan sonra sersemler. Deneysel fare özellikleri bağlı olarak uygun toplama gün/saat ampirik olarak belirlenen.
  3. % 70 etanol karın ventral yüzeyde sprey ve karın boşluğu ventrally diseksiyon makası ve forseps kullanarak açın.
  4. Tüm rahim Asansör ve vücuttan makas rahim boynuzları ucunda diseksiyon ile keserek ayırın.
  5. 1 x PBS ile tüm rahim bir kabında durulayın.
  6. Segmentally makas diseksiyon ile rahim kesme ve forseps sarısı sacs embriyoların ortaya çıkarmak için anatomi ile plasental decidua kaldırmak.
  7. Sarısı sac ilk perinatal embriyo kurtarmak için forseps diseksiyon ile amniyotik membran sökün ve.
  8. Makas diseksiyon ile bir embriyo başını kesmek. Steril gazlı bez yastıkları ile aşırı kan yok etmek. Embriyo ventral yüzeyi ile yukarı üzerinde görüntüleme için bir dijital fotoğraf makinesi ile donatılmış diseksiyon mikroskop pin. Kuyruğunu Genotipleme için toplamak.
    Not: bir kerede enjeksiyonları bir embriyo gerçekleştirmek.
  9. Dikkatli bir embriyo karın boşluğuna Forseps ile cilt yırtılma tarafından açın. O zaman, dikkatli bir şekilde fazla organ ve dokulara karaciğer, mide ve bağırsak gibi Forseps ile onları kesme veya böbrekler, Üreter ve dorsally yer alan mesane ortaya çıkarmak için dışarı çekerek çıkarın ( şekil 1A). Steril gazlı bez yastıkları ile disseke embriyo aşırı kan absorbe.
    Not: Aşırı kan boya enjeksiyon renal pelvis tanımlaması etkilemektedir.

3. Metilen mavisi boya enjeksiyon Renal Pelvis ve izleme Boya akışı içine

  1. iğne ve iğne ucu çözümden Metilen mavisi tarafından hidrostatik basınç kovma tarafından tüp Kaldır kabarcıkları. Akışını başlatmak için iğne ucu seviyesinin üzerinde boya solüsyon içeren şırınga kaldırın ve sonra akışını durdurmak için şırınga düşürebilir.
  2. Bu kez yerleştirilen bozmamaya dikkat çekici proksimal üreter yakınındaki renal pelvis iğne takın. Böbrek, idrar yolları tıkanıklığı belirlemek için içine boya enjeksiyon gerçekleştirmek.
    Not: Gerçekleştirmek boya herhangi bir anormal böbrek 7 içine enjeksiyon ilk onun idrar yolları tıkanıklığı belirlemek için aynı yolu izleyerek.
  3. Şırınga hidrostatik basınç sağlamak ve 15 µL - 60 µL boya çözüm akış izin yaklaşık 20 cm yukarı kaldır. Şırınga embriyo üzerindeki bu yükseklik için harekete geçirilen akış hızı yaklaşık 3 µL/s olacak.
  4. Renal pelvis sonra üreter uzunluğu ilk başlangıç boya mavi rengini izlemek ve son olarak mesane Lümen içinde.
    Not: Bu yaklaşık 5 alır s üreter mesane düzgün eklenirse mesane Lümen içinde ortaya bir zayıf boya renk görmek için. Boya bloke sitesinde yaklaşık 15 birikmesine izin yok boya renk mesane Lümen görüntülenirse s.
  5. Dur Boya akışı aşağı şırınga yerleştirin ve böbrek iğne kaldırma.
  6. Böbrek, Üreter ve boya çözüm ile takip mesane almak görüntüleri kamera kullanarak ve program görüntüleme bağlı bir stereomicroscope.
  7. Hydronephrosis böbrek, hydroureter ve boya çözüm son konumunu kaydını yapmak bir laboratuvar defter.
  8. Gerçekleştir enjeksiyon kontralateral böbrek açıklandığı gibi bölümleri 3.1) 3.5) ve boya akışı yaklaşık 20 izin s toplam.
    Not: Mesane Lümen üreter düzgün mesane Lümen eklediyseniz güçlü bir mavi renk tarafından belirtilen boya Çözümle değiştirebilirsiniz. Sonra değerlendirme idrar yolu Kavşağı tıkanıklığının, Üreter ve mesanenin kesit için sabit olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böbrekler ve alt üriner sistem sırt en diğer iç organlara karaciğer ve bağırsak gibi yer alır. Bu diğer iç organlara kaldırdıktan sonra bir çift böbrek ve Üreter ve tek bir mesane görülebilir (şekil 1A) vardır. Başarılı diseksiyon renal pelvis enjekte boya böbrek mesane yoluyla üreter içine akar. Renal pelvis huni benzeri dilate proksimal üreter böbrek parçasıdır. Bu nedenle, boya enjeksiyon noktası görünür proksimal üreter siyah oklarla (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare böbreklerde fonksiyonel E16.5 başında ve bir boya enjeksiyon testi bu zaman noktasından teorik olarak mümkün. Ancak, böbrek boya çözüm ile enjekte edilir çok küçük ve bu fenotipleri anormal idrar taşıma nedeniyle inşa idrar ikincil bir etkisi olduğundan fenotipleri hydronephrosis ve hydroureter gibi açıkça gözlenir değil. UPJO veya UVJO, gibi engellerin üzerinden bu fenotipleri şişmiş böbrek ve üreter tarafından E18.5 açık durumdadır. E19.5 veya neonatal pups embriyolar daha büyük böbrekler bu embriyolar E18.5, daha...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Alan O. Perantoni (CDBL/ncı/NIH) bu el yazması sunulması destek için teşekkür ederiz. Ben de Dr Michael Hall (CDBL/ncı/NIH) ve Nirmala Sharma (CDBL/ncı/NIH) bu el yazması düzenleme için teşekkür ederim. Ben onun mükemmel fare yetiştiriciliği için Lai Thang (SAIC) için minnettarım. Bu eser kanser araştırmaları için Ulusal Kanser Enstitüsü sağlık ve Merkezi Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Metilen mavisiSigma-AldrichM9140
Kalite Biyolojik A.Ş. NORMAL TUZLU - 500MLFisherscientific50-983-204
BD Luer-Lok uçlu 3 mL tek kullanımlık şırıngaBD309657
Akrodisk Şırınga Filtreli Supor MembranlıPall Corporation4614
Exel Saçlı Deri Damar (Kelebek) Setleri; 27G x 3/4" 12" EXELINT26709
Hassas Ameliyat MakasıRoboz Cerrahi Alet A.Ş.RS-6702
Mikro Diseksiyon ForsepsRoboz Cerrahi Alet A.Ş.RS-5135
Dumont Cımbız; Desen #5Roboz Cerrahi Alet A.Ş.RS-5045
BD PrecisionGlide İğneler 30 G x 1/2"BD305106

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
  2. Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
  3. Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
  4. Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
  5. Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
  6. Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
  7. Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
  8. Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
  9. Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
  10. Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Renal Pelvis EnjeksiyonuHidrostatik Bas n UygulamasBoya Ak zlemesiMesane L men G rselle tirmesiHidronefroz De erlendirmesiHidroureter TespitiPerinatal Embriyo Diseksiyonureterovezikal Bile ke Obstr ksiyonu

İlgili makaleler